Nghiên cứu định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu và các sản phẩm có chứa diệp hạ châu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI- 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng HÀ NỘI- 2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với TS Trần Việt Hùng, người thầy quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực hồn chỉnh luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tập thể cán Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý Khoa Kiểm nghiệm Đông dược – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương giúp đỡ tạo điều kiện thời gian trang thiết bị cho q trình thực luận văn Đó giúp đỡ quý báu thiếu suốt thời gian thực luận văn cao học Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cơ, cán phòng đào tạo sau đại học Bộ mơn, phòng ban khác trường Đại học Dược Hà Nội Cuối vô biết ơn gia đình, bạn bè ln bên động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập trường hoàn thành luận văn cao học Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Thu Hà DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril ADN : Acid Deoxyribo Nucleic AST : Aspartate Transaminase ALT : Alanine Transaminase CTCP : Công ty cổ phần CTCPD : Công ty cổ phần dược DAD : Diode Array Detector (Detector mảng diod) DĐVN : Dược điển Việt Nam DHC : Diệp hạ châu DL : Dược liệu HD : Hạn dùng HIV : Human immunodeficiency virus (Virus suy giảm miễn dịch người) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) LD50 : Lethal Dose 50 (Liều lượng chất độc gây chết cho nửa (50%) số cá thể dùng nghiên cứu.) LOD : Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) MeOH : Methanol NSX : Ngày sản xuất PA : Purity Analysis (Tinh khiết phân tích) PDA : Photo Diode Array STB : Diện tích píc trung bình STZ : Streptozotocin TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) THF : Tetrahydrofuran TNHH : Trách nhiệm hữu hạn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Cách pha dung dịch chuẩn 29 Bảng 3.1: Cách pha xác dung dịch chuẩn 34 Bảng 3.2: Kết xác định tính đặc hiệu 45 Bảng 3.3: Kết xác định giới hạn phát 46 Bảng 3.4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 48 Bảng 3.5: Kết xác định độ lặp lại hệ thống 49 Bảng 3.6: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu thử 49 dược liệu Diệp hạ châu Bảng 3.7: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp viên nang 49 Hamega (mẫu H1) Bảng 3.8: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp mẫu thử 50 Diệp hạ châu viên bao đường Bảng 3.9: Kết xác định độ (dược liệu) 50 Bảng 3.10: Kết xác định độ (Diệp hạ châu viên bao đường) 51 Bảng 3.11: Kết xác định độ (viên nang Hamega) 51 Bảng 3.12: Kết định lượng phyllanthin dược liệu Diệp hạ châu 53 đắng (Phyllanthus amarus Schum et thonn) Bảng 3.13: Kết định lượng phyllanthin viên Diệp hạ châu 54 (CTCPD DANAPHA) Bảng 3.14: Kết định lượng phyllanthin viên nang Hamega 55 lô 0021 Bảng 3.15: Kết định lượng phyllanthin viên nang Hamega lô 0061 56 Trang Bảng 3.16: Kết định lượng phyllanthin viên nang 56 Diệp hạ châu V Bảng 3.17: Kết định lượng phyllanthin viên nang 57 Diệp hạ châu TW3 Bảng 3.18: Kết định lượng mẫu Livsin-94 62 Bảng 4.1: Tỷ lệ phyllanthin có dược liệu (cao) dùng sản xuất viên 69 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L) Hình 1.2: Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo số chất hóa học có DHC Hình 3.1: Phổ 3D dung dịch chuẩn phyllanthin 0,02 mg/ml 39 Hình 3.2: Kết chồng píc dung dịch chuẩn phyllanthin 39 0,02 mg/ml bước sóng 230 nm, 254 nm, 280 nm Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,02 mg/ml phân tích pha 40 động ACN – đệm phosphate pH 2,8 (15:85) Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,02 mg/ml với pha động 40 ACN – H2O (65:35) Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,02 mg/ml với pha động 41 MeOH – H2O (65:35) Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,02mg/ml (MeOH:H2O = 72:28) 42 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch dược liệu DHC (MeOH:H2O = 72:28) 42 Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử Diệp hạ châu (CTCPD DANAPHA) 43 Hình 3.9: Sắc ký đồ dung dịch thử Hamega 44 Hình 3.10: Píc sắc ký dung dịch chuẩn 0,33 µg/ml 46 (MeOH:H2O = 72:28) Hình 3.11: Píc sắc ký dung dịch chuẩn 0,17 µg/ml 47 (MeOH:H2O = 72:28) Hình 3.12: Píc sắc ký mẫu trắng (dung mơi) 47 Hình 3.13: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính diện tích píc 48 nồng độ phyllanthin Hình 3.14: Sắc ký đồ dung dịch thử Bobina 58 Trang Hình 3.15: Sắc ký đồ dung dịch phyllanthin chuẩn 2,65 µg/ml 59 Hình 3.16: Sắc ký đồ dung dịch thử Bình can ACP 60 Hình 3.17: Sắc ký đồ dung dịch phyllanthin chuẩn 1,325 µg/ml 60 Hình 3.18: Sắc ký đồ dung dịch thử Livsin-94 lơ 670810 (mẫu L2) 61 Hình 3.19: Sắc ký đồ dung dịch thử Livbilnic lô 01 (mẫu LIV1) 62 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, Y học giới nói chung, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc thực phẩm chức có nguồn gốc thực vật để phòng trị bệnh trở lên thịnh hành Hướng tân dược hóa thuốc đơng dược phát triển mạnh nhiều nước có cơng nghiệp dược phẩm tiên tiến Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ Trung Quốc… Việt Nam nước có nguồn thực vật phong phú đa dạng Đặc biệt, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược điều trị bệnh mãn tính, thời gian sử dụng thuốc kéo dài bệnh tim mạch, tiểu đường, đặc biệt bệnh viêm gan … ngày trở lên phổ biến Trên giới có khoảng tỉ người mắc viêm gan B, có khoảng 350 triệu người chuyển sang giai đoạn mạn tính, gây khoảng 500.000 đến 1,2 triệu ca tử vong năm Việt Nam nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao (từ 10-20%) Để điều trị viêm gan B, bên cạnh việc sử dụng thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược cơng nghệ sinh học thuốc có nguồn gốc từ cỏ quan tâm Nhiều loài nghiên cứu áp dụng điều trị viêm gan B, có thuộc chi Phyllanthus như: Phyllanthus urinaria L (Diệp hạ châu hay Chó đẻ cưa) Phyllanthus amarus Schum et Thonn (Diệp hạ châu đắng hay Chó đẻ đắng) Các mang tên "Diệp hạ châu" thuộc chi Phyllanthus phổ biến Việt Nam với số lượng phong phú Dựa nghiên cứu khoa học kinh nghiệm sử dụng lâu đời dân gian, "Diệp hạ châu" ngày dùng nhiều công nghiệp Dược Các nghiên cứu cho thấy phyllanthin hypophyllanthin có mặt thành phần [17],[43],[59],[67] Phyllanthin Diệp hạ châu có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion chất bảo vệ phục hồi tế bào gan Phyllanthin nhanh chóng làm giảm men gan ức chế men ADN polymerase virus viêm gan B Vì Diệp hạ châu có 10 Hình PL2.7: Hình ảnh chế phẩm Diệp hạ châu TW3 Hình PL2.8: Hình ảnh chế phẩm Livbilnic 100 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA PHỔ 101 Hình PL3.1: Độ tinh khiết phổ với mẫu thử Diệp hạ châu (CTCPD DANAPHA) chạy pha động ACN – H2O (65:35) Hình PL3.2: Độ tinh khiết phổ với mẫu thử viên nang Hamega chạy pha động ACN – H2O (65:35) 102 Hình PL3.3: Độ tinh khiết phổ với mẫu thử Livsin 94 chạy pha động ACN – H2O (65:35) Hình PL3.4: Độ tinh khiết phổ với mẫu thử Bobina chạy pha động ACN – H2O (65:35) 103 PHỤ LỤC KẾT QUẢ SO SÁNH PHỔ CỦA MẪU CHUẨN VÀ MẪU THỬ 104 PHỤ LỤC PHIẾU PHÂN TÍCH 05 SẢN PHẨM CĨ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU Hamega (Công ty TNHH Nam Dược) Bình can ACP (Xí nghiệp Dược phẩm Á Châu – Công ty TNHH) Livsin-94 (Công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây) Bobina (Công ty TNHH Dược thảo Phúc Vinh) Livbilnic (Công ty cổ phần Traphaco) 105 PHỤ LỤC TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA CÁC CHẾ PHẨM Viên nang Diệp hạ châu V (Công ty TNHH Vạn Xuân) Viên bao phim Livbilnic (Công ty cổ phần Traphaco) Viên nén bao đường Diệp hạ châu (CTCPD DANAPHA) Viên nén bao phim Bổ gan tiêu độc Livsin-94 (Công ty CPDP Hà Tây) Viên nang Bình can ACP (Xí nghiệp Dược phẩm Á Châu – Công ty TNHH) Viên nang Diệp hạ châu (Công ty CPDP TW3) Viên bao đường Bobina (Công ty TNHH Dược thảo Phúc Vinh) Viên nang Hamega (Công ty TNHH Nam Dược) 106 PHỤ LỤC GIẤY CHỨNG NHẬN BÀI ĐĂNG TRÊN TẠP CHÍ KIỂM NGHIỆM THUỐC 107 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU NGUYỄN THỊ THU HÀ Trường Đại học Dược Hà Nội ương TRẦN VIỆT HÙNG Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Đặt vấn đề CTPT: C24H34O6 P.t.l: 418,53 Nhiều loài nghiên cứu áp dụng điều trị viêm gan B, có thuộc chi Phyllanthus như: Phyllanthus urinaria L (Diệp hạ châu hay Chó đẻ cưa) Phyllanthus amarus Schum et Thonn (Diệp hạ châu đắng) Phyllanthin thành phần hoạt chất Các nghiên cứu cho thấy phyllanthin có tác dụng tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc gan uống bia, rượu, … Trên thị trường nước xuất nhiều dòng sản phẩm đa dạng hình thức chất lượng có nguồn gốc từ Diệp hạ châu như: Diệp hạ châu, Livsin 94, Bobina, Hamega,…Thực tế cho thấy việc kiểm tra, kiểm sốt chế phẩm đòi hỏi phải thực chặt chẽ hơn, đặc biệt việc kiểm tra chất lượng yếu tố định hiệu điều trị thuốc Tuy nhiên, chất lượng thuốc thành phẩm đánh giá tiêu chí hình thức, đồng khối lượng, độ rã, định tính,… mà chưa có tiêu chuẩn định lượng Để góp phần vào cơng tác kiểm tra, giám sát chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu, thực đề tài nghiên cứu định lượng phyllanthin Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu Nội dung, đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát xây dựng phương pháp HPLC để định lượng phyllanthin Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu - Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng 2.2 Đối tượng nghiên cứu - Dược liệu Diệp hạ châu đắng – Phyllanthus amarus Schum et Thonn (Viện Dược liệu cung cấp) - Các sản phẩm có chứa Diệp hạ châu: Bảng 1: Các sản phẩm nghiên cứu STT Tên SP Diệp hạ châu Nhà sản xuất CTCPD DANAPHA Hamega Công ty TNHH Nam Dược Dạng bào chế Viên nén bao đường Viên nang Số đăng ký VD-10924-10 Số lô 020111 Hạn dùng 10.01.2014 680/2010/YTCNTC 0021 18.02.2014 2.3 Phương pháp nghiên cứu - Sử dụng thiết bị phân tích có độ xác cao có Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương định lượng phyllanthin đối tượng phương pháp HPLC 108 - Áp dụng quy định tài liệu WHO thẩm định phương pháp phân tích 2.4 Phương pháp xử lý kết Sử dụng phương pháp tính tốn thống kê có hỗ trợ phần mềm Microsoft Excel Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử, nguyên liệu, chất chuẩn 3.1 Thiết bị, dụng cụ - Cột sắc ký: Cột Phenomenex C18 (250 x 4,6mm; 5µm) - Máy HPLC: MERCK - HITACHI với detector DAD - Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204, SARTORIUS-CP224S - Máy đo pH; máy lắc siêu âm Emasonic S100; dụng cụ đun hồi lưu cách thủy dụng cụ thủy tinh xác (bình định mức, pipet,…) 3.2 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn - Acetonitril, methanol dùng cho HPLC (Merck) - Kali dihydrophosphat (KH2PO4); acid phosphoric (H3PO4); nước cất - Chất chuẩn đối chiếu hóa học phyllanthin lọ 20 mg, SKS: KC.10.16-04.09 hàm lượng 99,97% C24H34O6 (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương) Thực nghiệm kết 4.1 Xây dựng phương pháp HPLC Phyllanthin chất bột màu trắng, dạng phân tử khơng phân cực, có phân tử lượng 418,53 đvC, tan nước, tan tốt methanol, ethylacetate, chloroform tan phần n-hexan Cấu trúc phân tử phyllanthin có chứa nhân thơm nên phyllanthin có khả hấp thụ xạ vùng tử ngoại Dựa vào tính chất chúng tơi dự kiến sử dụng chương trình sắc ký pha đảo sử dụng cột C18 Để xây dựng phương pháp HPLC định lượng phyllanthin, tiến hành khảo sát thông số sau: Nồng độ, tỷ lệ dung môi pha động; loại dung môi pha mẫu; bước sóng cho độ hấp thụ cực đại; nồng độ dung dịch thử… Dự kiến áp dụng điều kiện sắc ký sau: Cột C18 Phenomenex (250 x 4,6mm; 5µm); tốc độ dòng: ml/phút; detector: Diod array; thể tích tiêm: 20 µl - Dung mơi pha mẫu: Do phyllanthin dễ tan methanol nên lựa chọn methanol làm dung môi pha mẫu - Pha động: + Pha đệm phosphate pH 2,8: Hòa tan 68 g KH2PO4 500 ml nước, điều chỉnh pH đến 2,8 H3PO4, lọc qua màng lọc 0,45 µm + Kết khảo sát pha động: Qua phân tích tham khảo tài liệu tiến hành khảo sát nhóm pha động (PĐ), kết thu sau: Bảng 2: Kết phân tích nhóm pha động khác STT Pha động Nhận xét ACN – đệm phosphat pH tR = 68,37 phút, tR dài 2,8 (15:85) ACN – H2O (65:35) - Dung dịch chuẩn: tR = 7,28 phút ; diện tích píc lớn, ổn định, pic cân đối; thời gian lưu phù hợp, ổn đinh, độ tinh khiết phổ (purity spectra) = 0,9998 - Dung dịch thử: tR= 7,28 phút; thử Diệp hạ châu viên bao đường, độ tinh khiết phổ (purity spectra) = 0,9597; thử viên nang Hamega: purity spectra = 0,9744 Phyllanthin không tách hoàn toàn MeOH – H2O (50:50) Dung dịch chuẩn: thời gian lưu dài, không phù hợp MeOH – H2O (65:35) Dung dịch chuẩn: Diện tích pic lớn pic không cân 109 MeOH – H2O (72:28) đối; thời gian lưu dài (tR=30,56 phút), không phù hợp - Dung dịch chuẩn: tR=11,76 phút; Diện tích pic lớn, pic gọn, cân đối; purity spectra = 1,0000 - Dung dịch thử: Dược liệu Diệp hạ châu: purity spectra = 0,9998; thử Diệp hạ châu viên bao đường: purity spectra = 0,9986; thử viên nang Hamega: purity spectra = 0,9923 Hình 1: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 0,02mg/ml (MeOH:H2O = 72:28) Sau tiến hành khảo sát loại pha động nêu trên, nhận thấy sử dụng pha động số phù hợp Theo tham khảo tài liệu [2] chúng tơi lựa chọn bước sóng định lượng 230 nm Với kết thu đề xuất sử dụng điều kiện sắc ký sau: Cột C18 (250 x 4,6mm; 5µm); pha động: MeOH – H2O (72:28); tốc độ dòng: ml/phút; detector: 230 nm; Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng; thể tích tiêm: 20 µl 4.2 Thẩm định phương pháp phân tích Các tiêu chuẩn cần xác định: Tính đặc hiệu; xác định giới hạn phát (LOD); xác định giới hạn định lượng (LOQ); khoảng tuyến tính (r); độ đúng; độ chụm (RSD) 4.2.1 Tính đặc hiệu phương pháp - Pha dung dịch mẫu thử có nồng độ sau: 0,02 mg/ml; 0,05 mg/ml 0,07 mg/ml - Tiêm lần lượt: Dung môi pha mẫu, dung dịch thử 0,02 mg/ml; 0,05 mg/ml 0,07 mg/ml Bảng 3: Kết xác định tính đặc hiệu Nồng độ (mg/ml) Số lần tiêm S trung bình 0,02 0,05 0,07 648943 662384 654735 655354 Diện tích pic (AU.s) 1642354 1659766 1652016 1651378,7 2329258 2312129 2301189 2314192 Tỷ lệ d.tích pic đáp ứng 99,68 % Sử dụng phầm mềm phân tích phổ máy HPLC, tiến hành chồng phổ mẫu thử (3 mẫu thử: Dược liệu Diệp hạ châu, chế phẩm Hamega chế phẩm Diệp hạ châu (DANAPHA)) mẫu dung dịch phyllanthin chuẩn ta thấy phổ thử phổ chuẩn có độ xác > 99,0 %, cho thấy phổ chuẩn phổ thử tương tự Đồng thời, với tỷ lệ 99,68 % diện tích pic đáp ứng dung dịch 0,07 mg/ml so với tổng diện tích pic đáp ứng dung dịch riêng rẽ 0,02 mg/ml 0,05 mg/ml cho thấy phương pháp có độ nhạy cao có tính đặc hiệu 4.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Pha dung dịch chuẩn phyllanthin có nồng độ 10,6 µg/ml, sau pha lỗng dần đến dung dịch chuẩn khơng có đáp ứng Chúng tơi tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký lựa 110 chọn, nồng độ 0,17 µg/ml khơng có pic đáp ứng nên nồng độ 0,33 µg/ml coi giới hạn phát (LOD) phương pháp Bảng 4: Kết xác định giới hạn phát Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (AU.s) 2,65 59938 1,33 28050 0,66 15399 0,33 10980 0,17 Không đáp ứng Như giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp là: 0,33 x 3,3 = 1,089 µg/ml 4.2.3 Xác định khoảng tuyến tính Pha dãy dung dịch chuẩn phyllanthin có nồng độ từ 2,65; 5,03; 10,6; 21,2; 26,5, 37,1; 50,3, 74,2 106 µg/ml Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký lựa chọn Kết thể bảng hình Bảng 5: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch số Nồng độ 2,65 5,03 10,6 21,2 26,5 37,1 50,3 74,2 106 59938 158116 328046 655537 803670 1121309 1652016 2329258 3454594 (µg/ml) D.tích pic (AU.s) Kết Phương trình hồi quy: y = 33015848,83 x – 21399,32; Hệ số tương quan tuyến tính: r = 0,9998 4000000 y = 33015848.83x - 21399.32 R2 = 1.00 3500000 Diện tích píc 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Nồng độ (mg/ml) Hình 2: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính diện tích pic nồng độ phyllanthin Nhận xét: Từ kết khảo sát cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát rộng (từ 2,65 đến 106 µg/ml) có phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ phyllanthin, thể qua hệ số tương quan r = 0,9998 4.2.4 Xác định độ Thêm lượng xác chất chuẩn phyllanthin vào mẫu thử cho nồng độ hoạt chất nằm khoảng tuyến tính khảo sát Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào thử để xác định độ đúng, áp dụng dược liệu Diệp hạ châu hai loại mẫu thử chế phẩm + Mẫu dược liệu Diệp hạ châu: - Chuẩn bị: Cân vào bình, bình khoảng 0,5 g bột dược liệu; thêm vào bình 1,0 ml dung dịch chuẩn 1,04 mg/ml Xử lý mẫu theo quy trình, lọc qua giấy lọc, qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký Kết khảo sát độ dược liệu trình bày bảng sau: 111 Bình Bảng 6: Kết xác định độ (dược liệu) C dược liệu = 0,78 % (tính theo nguyên trạng) m bột dược liệu (g) 0,5280 0,5352 0,5425 0,5443 0,5389 0,5584 Đã có (mg) 4,1197 4,1752 4,2322 4,2468 4,2050 4,3569 Thêm (mg) 1,04 1,04 1,04 1,04 1,04 1,04 S trung bình 1673356 1693756 1713538 1716324 1706898 1756164 Tìm thấy (mg) 1,0135 1,0197 1,0226 1,0165 1,0297 1,0271 % tìm lại 97,45 98,05 98,33 97,74 99,01 98,76 + Mẫu thử Diệp hạ châu viên bao đường (Công ty cổ phần dược DANAPHA) Thành phần viên: Diệp hạ châu 250 mg (tương đương 36,4 mg cao khô) Tá dược vừa đủ viên - Chuẩn bị: Cân vào bình định mức 50,0 ml, bình khoảng 1,2 g bột viên; thêm vào bình 1,0 ml dung dịch chuẩn 50,3 µg/ml Xử lý mẫu theo quy trình, lọc qua giấy lọc, qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký Kết khảo sát độ trình bày bảng 7: Bảng 7: Kết xác định độ (Diệp hạ châu viên bao đường) Bình C viên = 73,53 µg/ viên; m tb viên = 0,3516 g m bột viên (g) 1,2163 1,2308 1,2670 1,2527 1,2465 1,2323 Đã có (µg) 254,37 257,41 264,97 261,98 260,68 257,72 Thêm (µg) 50,3 50,3 50,3 50,3 50,3 50,3 S trung bình 179300 181161,3 186481,7 185318,3 184681 181997,7 Tìm thấy (µg) 49,58 49,35 49,85 51,07 51,41 50,31 % tìm lại 98,56 98,12 99,11 101,54 102,22 100,02 + Mẫu thử viên nang Hamega Thành phần viên: Diệp hạ châu đắng 2,0 g Vọng cách 0,3 g Nhân trần 0,2 g Phụ liệu vừa đủ viên - Chuẩn bị: Cân vào bình định mức 50,0 ml, bình khoảng 1,6 g bột viên; thêm vào bình 5,0 ml dung dịch chuẩn 26,5 µg/ml Xử lý mẫu theo quy trình, lọc qua giấy lọc, qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc ký Kết khảo sát độ trình bày bảng 8: Bảng 8: Kết xác định độ (viên nang Hamega) Bình C viên = 179,25 µg/ viên; m tb viên = 0,5268 g m bột viên (g) 1,6870 1,6928 1,6445 112 1,6483 1,6745 1,6760 Đã có (µg) 574,0351 575,9918 559,5578 560,8423 569,7824 570,2811 Thêm (µg) 132,5 132,5 132,5 132,5 132,5 132,5 S trung bình 443003 444785 433049,7 435149 440597,3 440226,7 Tìm thấy (µg) 129,27 130,01 128,67 130,57 129,88 128,82 % tìm lại 97,56 98,12 97,11 98,54 98,02 97,22 Nhận xét: Phương pháp phân tích mà chúng tơi xây dựng có độ cao với khả thu hồi nằm giới hạn cho phép thẩm định độ phương pháp phân tích hóa học ≤ ± 3,0 % 4.2.5 Xác định độ lặp lại Xác định độ lặp lại hệ thống Sử dụng chương trình sắc ký vừa xây dựng để phân tích dung dịch chuẩn phyllanthin Tiêm lặp lại lần dung dịch chuẩn 0,02 mg/ml; ghi lại kết diện tích pic lần tiêm Bảng 9: Kết xác định độ lặp lại hệ thống Lần tiêm S 648943 650534 654735 Stb = 655537; 657174 662384 659450 RSD = 0,79 % Nhận xét: Hệ thống phân tích có độ lặp lại tốt Xác định độ lặp lại phương pháp Độ lặp lại phương pháp đánh giá dựa độ lệch chuẩn tương đối mẫu thử phân tích riêng biệt Kết khảo sát trình bày bảng bảng Bảng 10: Kết khảo sát độ chụm viên nang Hamega (mẫu 1) STT mcân (g) 1,6077 1,6110 1,6038 1,6163 1,6043 1,6027 Cviên 181,41 182,43 177,53 173,03 181,26 179,84 (µg/viên) C viên trung bình = 179,25 µg/viên ; RSD = 1,94 % Bảng 11: Kết khảo sát độ chụm mẫu thử Diệp hạ châu viên bao đường STT mcân (g) 1,2787 1,2423 1,2402 1,2401 1,2030 Cviên (µg/viên) 71,93 72,61 75,11 74,85 73,13 C viên trung bình = 73,53 µg/viên ; RSD = 1,89 % Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại tốt Kết luận Sau tiến hành thẩm định phương pháp phân tích, chúng tơi thu kết sau: Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với detector UV bước sóng 230 nm, chương trình sắc ký có tính đặc hiệu thể qua độ nhạy đạt 99,67 %; có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích pic với r = 0,9998; có độ xác cao với độ < 3% độ lặp lại phương pháp < 2% Hệ thống phân tích có độ lặp lại RSD = 1,94 % < % Chúng tơi đề xuất sử dụng phương pháp phân tích HPLC thẩm định nêu để tiến hành phân tích phyllanthin Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu 113 Tài liệu tham khảo Bộ Y tế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung Ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, Tài liệu đào tạo, tr 107-119 Lê Thị Thu, Lê Quang Thảo, Nguyễn Thị Kim Thanh, Trịnh Văn Lẩu – Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC định lượng Phyllanthin nguyên liệu – Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số - 2010 Annamalai, A and P.T.V Lakshmi (2009), HPTLC and HPLC analysis of bioactive phyllanthin from different organs of Phyllanthus amarus, Asian J Biotechnol., 1: 154 - 162 J Chromatogr A (2007); School of Pharmaceutical Sciences, University Sains Malaysia, 11800 Minden, Penang, Malaysia; Determination of four lignans in Phyllanthus niruri L by a simple high performance liquid chromatography method with fluorescence detection; 1154 (1-2): 198 – 204 SUMMARY HPLC method using UV detector to determine phyllanthin in original Phyllanthus plants and other products containing phyllanthin has been developed successfully Chromatographic conditions include: the chromatographic column: Phenomenex C18 (250 x 4,6mm; 5µm); mobile phase: Methanol – water (72:28); flow rate: 1.0 ml/min; detective wavelength: 230 nm Results showed that the above method has excellent linearity; the association between concentrations and pic areas of phyllanthin was found (r = 0.9998) The method is repeatable with relative standard deviation (RSD) is 0.79% Moreover, the experiment also met the requirements including the accuracy (< 3%), and the precise (RSD < 2.0 %) LOD =0.33µg/ml and LOQ=1.089 µg/ml 114 ... "Nghiên cứu định lượng phyllanthin Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu" với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình định lượng phyllanthin dược liệu Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu Ứng...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC... dụng quy trình để định lượng phyllanthin dược liệu Diệp hạ châu số sản phẩm có thành phần Diệp hạ châu lưu hành thị trường 11 CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU 1.1.1 Đặc điểm