Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Tuy nhiên các phương pháp này sử dụng dung môi đắt tiền hoặc khó áp dụng với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng e

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI• • • •

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đoàn Cao Sơn là người thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quả trình thực hiện ỉuận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Trần Đức Hậu là người đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Phòng D ược lý - Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương, cùng các cản bộ Bộ môn Hóa Dược- Trường Đ H Dược Hà N ội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình tôi làm thực nghiệm tại đây.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội ngày 8 tháng 09 năm 2010

Học viên

Vũ Đức Lọi

MỤC LỤC Danh muc các chữ viết tắt

Danh mục các bảng số liệu

Danh mục các hình vẽ

ĐẶT VẤN Đ È 1

CHƯƠNG 1 TỔNG Q U A N 3

1.1 Tổng quan về etoricoxib .3

1.1.1 Công thức cấu tạo của Etoricoxib 3

1.1.2 Tính chất lý hóa 3

1.1.3 Dược động h ọ c 3

1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng 4

1.1.5 Chỉ định 4

1.1.6 Chống chỉ đ ịn h 4

1.1.7 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.8 Tương tác thuốc 5

1.1.9 Chế phẩm 5

1.2 Một số phương pháp định lượng etoricoxib 5

1.2.1 Định lượng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC 5

1.2.2 Định lượng Etoricoxib trong huyết tương bằng phương pháp L C/M S/M S 7 6

1.2.3 Phương pháp đo quang để định lượng etoricoxib trong chế phẩm viên nén 7

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) định lượng etorỉcoxib trong chế phẩm 7

1.3 Tổng quan về HPLC .8

1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng c a o 8

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc k ý 8

1.3.3 Cơ sở ỉý thuyết của quá trình sắc k ỷ 9

1.3.4 Cấu tạo của hệ thống HPL C 9

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc k ý 10

1.3.7 ửng dụng của H PLC 14

1.4 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương 15

1.4.1 Phương pháp tủa protein 16

1.4.2 Phương pháp chiết lỏng- lỏng 16

1.5 Thẩm định phương pháp phân tíc h 16

1.5.1 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dạng chế p h ẩ m 16

1.5.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 20

2.1 Nguyên vật liệu và thiết b ị 20

2.1.1 Nguyên vật liệu 20

2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ 20

2.2 Nội dung nghiên c ứ u 20

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương 21

2.2.2 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng 21

2.2.3 ửng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Etoricoxib trong chế phẩm viên nén 21

2.3 Phương pháp nghiên cứ u 21

CHƯƠNG 3 KỂT QUẢ NGHIÊN c ứ u 23

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm bằng HPLC 7 7 23

3.1.1 Lựa chọn bước sóng thích hợp 23

3.1.2 Khảo sát chọn thành phần pha động 24

3.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng 25

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm 25

3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống 26

3.2.2 Độ đặc h iệu 27

3.2.3 Độ tuyến tính 29

3.2.4 Độ chính xác 30

3.2.5 Độ đúng 31

3.3 ứ n g dụng định lượng etoricoxib trong chế phẩm 32

3.4 Xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib trong huyết tương 34

3.5.2 Độ tuyến tỉnh 47

3.5.3 Giới hạn định lượng dưới 48

3.5.4 Độ đúng và độ lặp lại 49

3.5.5 Hiệu suất chiết 52

3.5.6 Độ ổn định 53

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 59

KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 63

Kết luận 63

Kiến n ghị 64

IS : Chất chuẩn nội (Internal Standard).

KNTTW : Kiểm nghiệm thuốc trung ương

LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổ

LOQ : Gới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

LQC : Mau kiểm soát có nồng độ thấp (Lower Quanlity Control

NSAIDS : Thuốc chống viêm giảm đau hạ sốt không steroid

PA : Tinh khiết phân tích

QC : Mầu kiểm soát (Quanlity Control Sample)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation),

s : Diện tích pic.

SD : Độ lệch chuẩn (Relative Standard).

SDK : Số đăng ký

ti/2 : Thời gian bán thải của thuốc (h a lf- life)

tmax : Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong máu

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (upper limit o f quantification).ƯV-VIS : Tử ngoại - khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Trang

Bảng 3.1 Kêt quả khảo sát độ thích hợp của hệ thông săc ký 26

Bảng 3.5 Kêt quả định lượng etoricoxib trong viên nén Etotab-60 34

Bảng 3.7 Kêt quả khảo sát độ tuyên tính của Etoricoxib trong HT 47

Bảng 3.9 Kêt quả xác định độ đúng độ lặp lại trong ngày 49Bảng 3.10 Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 51Bảng 3.11 Kết quả xác định hiệu suất chiết etoricoxib 52Bảng 3.12 Kết quả xác định hiệu suất chiết aspirin (IS) 53Bảng 3.13 Kết quả xác định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và

Bảng 3.14 Kết quả xác định độ ổn định mẫu huyết tương qua 3

Bảng 3.15 Kết quả xác định độ ổn định dài ngày của mẫu huyết

tương

56

Bảng 3.16 Kết quả xác định độ ổn định autosampler 57Bảng 3.17 Kết quả xác định độ ổn định trong thời gian ngắn của

diện tích pic

29

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Etoricoxib định lượng 33

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib định lượng 34Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp Celecoxib và Etoricoxib

35

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Paracetamol và Etoricoxib 36

Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch hỗn họp Aspirin và Etoricoxib 36

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được

acid hoá

39

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS không

được acid hoá

39

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được

acid hoá và cô cạn

40

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có etoricoxib và IS được acid hoá và cô cạn

41

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib và IS 41

Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu huyết tương etoricoxib và IS, chiết bằng ethylacetat

42

Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu huyểt tương etoricoxib và IS, chiết bằng

diethylether/dichloromethane

43

Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của người 44

Hình 3.20 sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn Eto 100ng/ml 44

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu huyết tương có chuẩn nội aspirin

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng của chó 46

Hình 3.24 sắc ký đồ mẫu huyết tương thử của chó 46Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ

và tỷ lệ diện tích pic Eto/IS

47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhóm thuốc NSAID là một nhóm thuốc hiện nay đang được sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới Nhóm thuốc được dừng với tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt rất hiệu quả và không gây nghiện như nhóm thuốc Opiat, những tác dụng này đã được biết đến chính thức ngay từ những năm 1838 khi Raffaelle Piria (Italia) tinh chế được acid acetylsalicylic

từ vỏ cây liễu Hiện nay nhiều nước đã đưa một số thuốc thuộc nhóm NSAID vào danh mục thuốc thiết yếu của quốc gia Tuy nhiên nhóm thuốc này cũng

có tác dụng phụ nguy hiểm trên tiêu hoá như gây loét dạ dày, xuất huyết tiêu hoá do cơ chế tác dụng của thuốc gây ra Do đó các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những thuốc mới có tác dụng tốt hơn nhưng hạn chế tối đa các tác dụng phụ này Đó là các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 như nhóm coxib và phải kể đến thuốc gần đây nhất là etoricoxib

Etoricoxib được nghiên cứu thành công và đưa vào sử dụng trong điều trị vài năm gần đây nhưng hiện nay thuốc đã có mặt trên 60 quốc gia trong đó có Việt Nam và ngày càng được sử dụng rộng rãi hơn Vì vậy, việc kiểm soát chất lượng của thuốc nhập khẩu và tiến tới là thuốc sản xuất trong nước là điều quan trọng Mặt khác bên cạnh những ưu điểm của thuốc trên đường tiêu hoá thì thuốc lại có những nhược điểm trên một số cơ quan khác như tim mạch Vì thế để hạn chế tác dụng phụ và tăng cường hiệu quả sử dụng thuốc thì việc có liệu trình điều trị cho từng bệnh nhân là điều cần thiết Bởi vậy việc nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương

sẽ góp phần giải quyết khâu kiểm soát chất lượng thuốc và có được liệu trình điều trị hiệu quả nhất Mặt khác, việc nghiên cứu này cũng giúp cho việc đánh giá sinh khả dụng và thử tương đương sinh học của thuốc

Hiện nay, trong và ngoài nước mới chỉ có một vài nghiên cứu về định lượng etoricoxib, Dược điển các nước như Dược điển Anh, Mỹ, Việt Nam cũng chưa có chuyên luận về etoricoxib Một số tác giả có nghiên cứu định lượng etoricoxib bằng phương pháp LC/MS, HPLC, CZE, quang phổ ƯV-VIS [6], [17], [18], [24], [30] Tuy nhiên các phương pháp này sử dụng dung môi đắt tiền hoặc khó áp dụng với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.

Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng phương pháp HPLC” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lưựng etorỉcoxỉb trong chế phẩm bằng HPLC.

2 Áp dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng chế phẩm chứa etoricoxib trên thị trường.

3 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib trong huyết tương bằng HPLC.

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN1.1 Tổng quan về etoricoxib [7], [8], [11], [19], [26]

1.1.1 Công thức cấu tạo của Etoricoxib

- Phân bố: Thuốc liên kết với protein huyết tương là 92%, thuốc phân bố rộng qua được nhau thai và hàng rào máu não

- Chuyển hoá: Thuốc chuyển hoá chủ yếu ở gan tạo thành dẫn xuất 6- hydroxymethyl-etoricoxib nhờ phản ứng oxy hoá khử dưới sự xúc tác của

enzym CYP (chủ yếu là CYP3A4) và chỉ một phần nhỏ (<1%) của liều dùng được thải trừ ở dạng không chuyển hoá.

- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua nước tiểu khoảng 70% và qua phân khoảng

20%, thời gian bán thải là ti/2 « 22h

1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng

- Tác dụng: giảm đau, chống viêm

- Cơ chế tác dụng: do thuốc ức chế chọn lọc enzym COX-2, ngăn cản tổng họp prostaglandin là chất trung gian hóa học gây viêm, do đó làm giảm quá trình viêm Do thuốc không ức chế COX-1 nên không gây ra các tác dụng phụ trên đường tiêu hoá

1.1.5 Chỉ định

- Viêm xương khớp 60mg/ngày

- Cơn gout cấp 120mg/ngày

- Viêm khớp dạng thấp 90mg/ngày

- Đau cấp do phẫu thuật răng 120mg/ngày

- Thống kinh nguyên phát 60mg/ngày

- Đau cơ xương mãn tính 60mg/ngày, liều 120mg/ngày chỉ dùng trong giai đoạn cấp

1.1.6 Chống chỉ định

Quá mẫn với các thành phần của thuốc, suy gan nặng, suy thận Clcr < 30ml/phút, phụ nữ có thai hoặc cho con bú, tiền sử hen, viêm mũi cấp

1.1.7 Tác dụng không mong muốn

- Chóng mặt, đau đầu, rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, khó tiêu, đau thượng

vị, suy nhược, giống bệnh cúm, tăng men gan

- Không thường gặp: Phù, tăng trọng, lo lắng, trầm cảm, mất ngủ, dị cảm, ngủ gà, nhìn mờ, ù tai, suy tim, tăng huyết áp.

1.1.8 Tương tác thuốc: Tương tác với các thuốc chống đông, lợi tiểu, thuốc

ức chế men chuyển như: acetazolamid, furosemid

1.2 Một số phương pháp định lượng etoricoxib

1.2.1 Định lưọng Etoricoxib bằng phương pháp HPLC

Danh mục các chương trình HPLC tham khảo được trình bày ở bảng 1.1

100 Ci8

(250x4,6 mm, 5|im)

- Pha động: acetonitrile: methanol: dung dịch đệm KH2PO410 inM, pH 3,0 (35:35:30 v/v)

(250x4,6 mm, 5|im)

- Pha động: acetonitrile: amoni acetat 0,05 mM; (50: 50 v/v)

mm, 5(im)

- Pha động: acid formic 0,05 M (pH3)- acetonitrile-methanol- nước (10: 60: 20 : 10, v/v) chạy theo chương trình gradient - time

[34] Huyết

tương

Cột Waters symmetry®

- Chuẩn nội là Zelaplon

- Mầu huyết tương được chiết bằng dung môi diethyl ether/dichloromethane (70/30, v/v)

[27] Huyết

tương

Cột Hypersil BDS Ci8 (150

X 4,6 mm, 5 Jim)

- Pha động: acetonitril: dung dịch amoni acetat lOmM, pH 4,0 (65: 35, v/v)

- Tốc độ dòng: 1 ml / phút

- Detector ƯV ở bước sóng 235 nm

- Thể tích tiêm: 20 |4,1

- Nhiệt độ cột: 30°c

- Chuẩn nội là valdecoxib

- Mầu huyết tương được chiết bằng dung môi ethylacetat, cô cạn dưới dòng khí nitơ

1.2.2.Định lượng Etoricoxib trong huyết tương bằng phương pháp LC/MS/MS [17]

- Cột phonomenex Luna Ci8 (50 X 3 mm, 3|Am).

- Pha động: acetonitril: dung dịch amoni acetat lOmM, pH 4,0 (95: 5, v/v)

- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút

- Thể tích tiêm: 20 |J.1

- Nhiệt độ cột: 25°c

Điều kiện khối phổ:

lon hoá bằng hoá học ở áp suất thường (APCI): dùng luồng khí nitơ

- Điện áp điện hoá: 2,5 kV; điện áp RF: 0,5V

- Nhiệt độ nguồn APCI là: 120 và 450°c

- Điện áp đỉnh là 65V và năng lượng bắn phá là 35eV

- Phân tích dữ liệu bằng phần mềm Masslynx

1.2.3 Phương pháp đo quang để định lượng etoricoxib trong chế phẩm viên nén [24], [35]

Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong dung dịch HC1 0,1N [35] hoặc methanol [24], lọc qua giấy lọc rồi đem đo quang Dung dịch đem đo quang có nồng độ khoảng 6 |ig/ml, đo ở bước sóng cực đại là X = 233nm

[35] trên máy Shimadzu ƯV-Visible Spectrophotometer (UV-1700), hoặc X

= 284nm trên máy u v 1601 [24], xây dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc

tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của etoricoxib trong dãy nồng độ từ: 2- 24|ig/m l Căn cứ vào đồ thị và độ hấp thụ đo được để tính kết quả hàm lượng etoricoxib trong chế phẩm

1.2.4 Phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) định lượng etoricoxib trong chế phẩm [18]

- Sử dụng mao quản chiều dài 40cm, đường kính trong 50|im

- Hệ đệm: dung dịch tris - phosphat 25mM, pH 2,5

- Điện thế đặt vào 2 đầu mao quản: 25kV

- Tiêm mẫu 50mbar trong thời gian 5s

- Bước sóng phát hiện: 234nm với detector PDA

Nhận xét: Phương pháp định lượng etoricoxib bằng sắc ký lỏng khối phổ khá phức tạp, tốn kém và chưa phù hợp với đa số phòng kiểm nghiệm của Việt Nam Phương pháp đo quang và điện di mao quản vùng có độ chính xác không cao và mới áp dụng định lượng etoricoxib dạng chế phẩm, chưa có nghiên cứu áp dụng phương pháp này để định lượng etoricoxib trong huyết tương Phương pháp HPLC ở trên sử dụng hệ dung môi còn phức tạp và đắttiền Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp địnhlượng etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương bằng HPLC đơn giản,

có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù họfp với đa số điều kiện của các phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam

1.3 Tổng quan về HPLC [2], [3], [4], [5], [10], [22], [31]

1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ

sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu

tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

1.3.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký

Quá trình phân tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra

khỏi cột Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải

tách được các chất ra khỏi cột Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ.Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiềuthành phần

1.3.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

1.3.4.1 Hệ thống bơm

Bơm có tác dụng đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ nhất định

Có hai loại bơm: - Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng

- Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại bơm này được áp dụng cho phân tích HPLC thông thường

1.3.4.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi.

Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |im) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) Trong phương pháp thông thường chỉ càn một bình dung môi, trong phương pháp gradient cần phải có nhiều bình

1.3.4.3 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.

1.3.4.4 Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm, đường kính trong 2-5mm

1.3.4.6 Bộ phận hiển thị kết quả: Computer

1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

I.3.5.I Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR

- tR là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc

ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ

Thời gian lưu thực t’R của một chất: t’R = tR- to

to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)

- VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ.

V r = Í r X Fc

Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian

I.3.5.2 Hệ số phân bố K

Là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ của nó trong

pha động, thể hiện tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh

cs và CMlà nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng K phụ

thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

1.3.5.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số dung lượng k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của một chất qua cột

k ’ phụ thuộc : bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm

cột, thể tích của pha động và pha tĩnh

Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1< k ’< 8

1.3.5.4 Hệ số chọn lọc a: là biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh

K k' t

(X= B = B =

Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05- 2,0

I.3.5.5 Độ phân giải Rs: Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một

Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu AF nằm trong khoảng 0 ,9 -2

W: là chiều rộng đo ở đáy pic

w 1/2: là chiều rộng đo ở 1/2 chiều cao pic

Số đĩa ỉý thuyết cho biết hiệu lực tách của cột sắc ký

1.3.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (S i0 2), nền oxyd nhôm

(AI2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch cacbon Pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và được sử dụng nhiều nhất

1.3.6.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định

Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực như: n- hexan, n-heptan, benzen

Trong sắc ký pha đảo thì pha động thường là hệ dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng

1.3.6.4 Tốc độ dòng

Sau khi có pha động, pha tĩnh, pH thích hợp thì cần phải lựa chọn tốc

độ dòng cho pha động để quá trình tách tốt hơn

• Phương pháp chuẩn ngoại: cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó so sánh trực trực tiếp chiều cao hay diện tích pic của mẫu thử với mẫu chuẩn Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính Công thức tính theo cách

chuẩn hoá 1 điểm: Cx = Sx —

Ss

Trong đó: Cs, Cx là nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử

Ss, Sx là diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử

• Phương pháp chuẩn nội: là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội

• Phương pháp thêm chuẩn: dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất hấp phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp Mầu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa

trên sự chênh lệch nồng độ và độ tăng của diện tích Với phương pháp thêm

nhiều lần ta có phương pháp thêm chuẩn

• Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic:

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỉ ỉệ phần trăm diện tích pic của nó so YỚi tổng diện tích của các pic thành phần

1.4 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương [1], [27], [30]

Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp là: chiết pha rắn, kết tủa protein và chiết lỏng - lỏng Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không kinh tế so với 2 phương pháp còn

lại nên trong luận văn chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein

và chiết lỏng - lỏng

1.4.1 Phưong pháp tủa protein

- Tủa bằng acid: thường dùng các acid: percloric, tricloacetic, trifloacetic với

nồng độ khoảng 5-10 %

- Tủa bằng dung môi hữu cơ như: methanol, acetonitril

- Tủa bằng muối: hay dùng muối amonisulfat khan

1.4.2 Phương pháp chiết lỏng- lỏng

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi với những ưu điểm như có thể

cô đặc mẫu, dịch chiết phù họp với hệ thống sắc ký và dễ thay đổi dung môi

để có độ chọn lọc cao, hiệu suất chiết cao Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có những nhược điểm như các dung môi thường độc hại, bay hơi, dễ cháy nổ

và có thể tạo ra nhũ dịch khó xử lý

- Cơ chế chiết lỏng - lỏng: là quá trình phân bố hay hoà tan đồng thời một chất ở 2 pha lỏng không trộn lẫn khi tiếp xúc với nhau Có 3 yếu tố chính tác động đến quá trình chiết là:

+ Lực Van der waals

+ Quá trình solvat hoá

+ Tương tác hoá học

Sau khi khảo sát, căn cứ vào hiệu suất chiết hoạt chất, độ lặp lại giữa các lần chiết, thời gian chiết, tính kinh tế để lựa chọn quy trình xử lý mẫu huyết tương tối ưu nhất

1.5 Thẩm định phương pháp phân tích [12], [15], [20], [23], [36]

1.5.1.Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dạng chế phẩm

Tiến hành thực hiện với các tiêu chí: tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng,

độ chính xác Nội dung thẩm định:

Độ đặc hiệu của một phương pháp phân tích là khả năng xác định duy chỉ chất phân tích trong sự có mặt của các chất khác như: tạp chất, sản phẩm phân huỷ, chất chuyển hoá Với phương pháp HPLC xác định thông qua sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử

1.5.1.2 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính

Là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ đã biết (x) của chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b và hệ số tương quan

tuyến tính r Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số r phải

nằm trong khoảng 0,99 < r < 1

1.5.1.3 Độ đúng

Độ đúng của một phương pháp phân tích là 1 mức độ gần sát của kết quả phân tích thu được bởi phương pháp so với giá trị thực Độ đúng phải xác định trên suốt giới hạn nồng độ của nó Cách xác định với trường họp định lượng thành phẩm: áp dụng phương pháp phân tích để định lượng hỗn hợp tự tạo gồm tất cả các thành phần có trong công thức pha chế thuốc (trừ hoạt chất) Hoạt chất được thêm vào với số lượng đã biết trong toàn bộ khoảng nồng độ khảo sát Nếu không thể tạo được mẫu thử có đủ các thành phần thì

có thể chấp nhận thêm một lượng đã biết của chất phân tích vào thuốc thành phẩm Độ đúng được xác định bằng phần trăm tìm lại được khi định lượng một số lượng thêm vào đã biết của chất phân tích, trung bình tìm lại yêu cầu

1.5.1.1 Độ đặc hiệu

từ 98- 102% (với phương pháp phân tích dịch sinh học giá trị trung bình thu được cho phép sai lệch không quá 15% so với giá trị thực).

I.5.I.4 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp phân tích chế phẩm được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 6 phép thử song song ở nồng độ làm việc Yêu cầu RSD < 2%

1.5.2 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương

Ngoài các tiêu chí độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác tương

tự như trong phân tích chế phẩm thì thẩm định thêm các tiêu chí là: độ ổn định, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết

I.5.2.I Độ ổn định

Độ ổn định của chất phân tích được khảo sát cả trong dung dịch chuẩn gốc

và trong mẫu sinh học, trong điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản mẫu

- Xác định độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc ở điều kiện nhiệt độ phòng và bảo quản dài ngày trong tủ lạnh sâu

- Xác định độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông Một chu kỳ đông - rã đông được tính kể từ khi để mẫu đông lạnh ở nhiệt độ dự kiến (- 40°C) trong 24h và rã đông tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng lặp lại chu kỳ tiếp theo bằng cách

để mẫu đông lại trong vòng 12-24h

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng: độ ổn định của mẫu huyết

tương để rã đông ít nhất 6 giờ mới xử lý và độ ổn định của mẫu huyết tương

đã xử lý đang chờ tiêm sắc ký (độ ổn định trong autosampler)

+ Độ ổn định thời gian dài, bảo quản mẫu trong tủ lạnh sâu

1.5.2.2 Giói hạn định lưọng dưới

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác cho phép LLOQ được chấp nhận nếu đạt các điều kiện: Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng; pic của chất phân tích phải thấy rõ, riêng biệt và giá trị đáp ứng với độ đúng từ 80-120% và độ chính xác < 20%

1.5.2.3 Hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết biểu thị khả năng thu hồi chất cần phân tích khi áp dụng một kỹ thuật xử lý mẫu trong phương pháp phân tích và được tính bằng tỷ lệ phần trăm đáp ứng (diện tích pic) chất cần phân tích có trong mẫu qua chiết tách so với mẫu không qua chiết tách Hiệu suất chiết được xác định trên mức nồng độ (LQC, MQC, HQC) với 3 mẫu độc lập ở mỗi nồng độ Hiệu suất chiết không nhất thiết phải đạt mức cao (100%) nhưng kết quả giữa các lần chiết phải có độ lặp lại tốt (khác nhau không quá 15%) Không nên sử dụng phương pháp có hiệu suất chiết thấp hơn 30% hoặc cao hon 110%

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn etoricoxib hàm lượng 98,06% do Viện KNTTW cung cấp

- Chất chuẩn aspirin hàm lượng 100,08% do Viện KNTTW cung cấp

- Mầu thử: viên nén Etotab-60, chứa 60mg etoricoxib, nhà sản xuất Micro Labs., Ltd - Ấn Độ, số đăng ký: VN-6743-08

- Huyết tương người do viện huyết học truyền máu trung ương cung cấp.

- Huyết tương chó (mẫu trắng và mẫu thử) do phòng Dược lý- Viện KNTTW cung cấp

- Methanol, acetonitril dùng cho HPLC, acid acetic, acid percloric

- Nước cất 2 lần dùng cho HPLC

2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX - detector ƯV - PDA

- Máy quang phổ UV-VIS Lambda EZ210

- Máy siêu âm Sonorex

- Máy đo pH Meter 3305- Jenway

- Máy lọc chân không Satorius

- Máy ly tâm Hettich EBA 20

- Máy lắc xoay điện Velp- Zx3

- Cân phân tích Mettler 240

- Bình định mức, cốc có mỏ, pipet, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45|im, bơm tiêm, lọ đựng mẫu

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định Iuợng Etoricoxib trong chế phẩm và trong huyết tương

Lựa chọn điều kiện sắc ký: cột sắc ký, bước sóng phát hiện, thành phần và

tỉ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm, phương pháp xử lý mẫu huyết tương, lựa chọn chuẩn nội

2.2.2 Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

- Đối với phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm cần thẩm định

với các tiêu chí sau: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng

- Đối với phương pháp định lượng etoricoxib trong huyết tương cần thẩm định các tiêu chí: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định, hiệu suất chiết, giới hạn định lượng

2.2.3.ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Etoricoxib trong chế phẩm viên nén

Tiến hành định lượng mẫu chế phẩm viên nén Etotab-60 để xác định hàm lượng etoricoxib trong mỗi viên nén này

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Tham khảo các tài liệu liên quan đến phương pháp định lượng Etoricoxib, đặc biệt là các phương pháp định lượng Etoricoxib bằng HPLC đã công bố

- Dựa vào công thức cấu tạo, tính chất hóa lý của Etoricoxib, bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện của chương trình sắc ký và phương pháp xử

lý mẫu để xây dựng phương pháp định lượng etoricoxib

- Dựa vào tài liệu hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích để thẩm định phương pháp vừa xây dựng

- Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thực nghiệm thu được xử lý theo phương pháp xử lý số liệu thống kê.

* Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả [9]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Etoricoxib trong chế phẩm bằng HPLC

Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của Etoricoxib, kết hợp với các tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký HPLC pha đảo, sử dụng cột Nucleosil C18 Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như: lựa chọn bước sóng, pha động, tốc độ dòng

Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch này với dải sóng từ 200-500

nm, cuvet thạch anh dày lcm, mẫu trắng là dung môi methanol : nước (tỷ lệ 70:30) Kết quả ghi ở hình 3.1

200 300 400 500

Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Etoricoxib 10 Ịig/ml

Nhận xét: Phổ hấp thụ của dung dịch etoricoxib chuẩn 10 |!g/ml cho cực đại hấp thụ ở bước sóng 203,5; 234,0; 284,5 nm Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy của phương pháp chúng tôi chọn bước sóng đo là 234 nm

3.1.2 Khảo sát chọn thành phần pha động

Trong phương pháp HPLC pha động hay dùng nhất là methanol, acetonitril, nước hay hỗn hợp của chúng Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký với một số hệ dung môi như: Methanol:nước; Methanolracetonitril; Methanol:acetonitril:nước; Acetonitrihnước Chúng tôi nhận thấy hệ dung môi: methanol:nước và acetonitril:nước cho pic cân đối hon so với các hệ dung môi còn lại và sử dụng methanol kinh tế hơn acetonitril nên chúng tôi chọn hệ dung môi là methanol:nước Sau khi chọn được hệ dung môi, để cho pic được sắc nhọn, cân đối hơn nữa, chúng tôi tiến hành khảo sát pH của pha động bằng cách chạy sắc ký với hệ đung môi methanol và nước được điều chỉnh về pH 2,5; 3,0; 3,5 Sau khi tỉm được pH thích hợp (pH3), cố định pH

đó để khảo sát tỷ lệ giữa các thành phần trong pha động bằng cách phối họp

methanol và nước với tỷ lệ thay đổi là 60:40; 70:30; 80:20

Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi methanol: nước (điều chỉnh về

pH 3,0 bằng acid acetic) (tỷ lệ 70:30) là hệ dung môi cho thời gian lưu thích hợp, pic cân xứng nhất Do đó, chúng tôi chọn hệ dung môi này trong các nghiên cứu tiếp theo

3.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng

Tiếp tục tiến hành sắc ký với các điều kiện đã chọn ở trên nhưng tốc độ dòng thay đổi 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút nhằm chọn được tốc độ dòng thích họp đảm bảo việc phân tách tốt và định lượng Etoricoxib đồng thời rút ngắn được thời gian phân tích

Qua két quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy tốc độ dòng là 1,0 ml/phút cho pic gọn, khá cân đối, thời gian lưu thích hợp nhất Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn tốc độ dòng là 1,0 ml/phút để tiến hành sắc ký

Vậy từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký được lựa chọn là:

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng etoricoxib trong chế phẩm

Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng Etoricoxib vừa xây dựng với các chỉ tiêu sau:

thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều Lấy chính xác l,0m l dung dịch trên

pha loãng với pha động vừa đủ 50,0 ml, lắc đều được dung dịch có nồng độ 4

|xg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 |im được dung dịch chuẩn để tiến hành phân tích

Tiêm 5 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện

đã chọn Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của pic tạo bởi Etoricoxib Ket quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAƯ.min) Hệ số bất đối xứng (AF)

3.2.2 Đô đăc hiêu • • •

Mục đích: Chứng minh sự có mặt của chất khác hay dung môi pha động không ảnh hưởng đến việc định lượng Etoricoxib

Thực tế không có sẵn toàn bộ thành phần viên để khảo sát vì các tá dược trong viên khá nhiều và không có tỷ lệ các tá dược trong viên nên chúngtôi tiến hành sắc ký và ghi sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha động), mẫuchuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn Kết quả thể hiện ở các hình sau:

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Etoricoxib

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu thử Etoricoxib có thêm Etoricoxib chuẩn

Nhận xét:

- sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha động) không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích 10 phút.

- Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử có chứa etoricoxib, mẫu thử có thêm chất chuẩn etoricoxib đều cho lpic ở thời gian lưu tR= 5,84 phút

Điều này chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao