Góp phần nghiên cứu định lượng artesunate trong viên nén bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

Vì thế việc tìm kiếm và đưa vào sử dụng các thuốc mới trong điều trị sốt rét luôn là một vấn đề lớn được đặt ra với những nhà nghiến cứu [16].. Artesunate là một trong những dẫn chất của

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

=======oO o======

NGUYỄN QUỐC HOÀN

G Ó P PH Ầ N N G H IÊ N cứu Đ ỊN H LƯ Ợ N G A R T E SU N A T E

T R O N G V IÊN NÉN BANG PH Ư Ơ N G PH Á P

ĐO Q U A N G P H Ổ H Â P TH Ụ T Ử N G O Ạ I - K H Ả K IÊ N

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003)

Người hướng dẫn: PGS TS Trần Đức Hậu Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược

Thời gian thực hiện: 03/2003 - 05/2003

Lời cảm ơn

Sau quá trình nghiên cứu học tập tại trường tôi đã nhận được đề tài “ Góp phần nghiên cứu định lượng ffrtesunate trong viên nén bằng

TS Trần Đức Hậu trực tiếp hướng dẫn

Trước nhất xỉn cho tôi tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trần Đức Hậu - Người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khoá luận này.

Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên ở bộ môn Hoá Dược đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điêu kiện đ ể tôi hoàn thành tốt khoá luận của mình.

Nhân dịp này tôi cũng xin được bày tỏ lồng biết ơn tới những thầy cô đã dìu dắt, giảng dạy tôi trong những năm học tập tại trường.

Cuối cùng tôi vô cùng cám ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ tôi đ ể tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 5 năm 2003 Sinh viên: Nguyễn Quốc Hoàn

MỤC LỤC

Đặt vấn đ ề 1

Phần 1 - Tổng quan 3

1.1 - Vài nét về bệnh sốt rét, công tác phòng và điều trị sốt rét trong những năm qua 3

1.2 - Cây thanh hao hoa vàng và hoạt chất của nó 5

1.2.1 - Đặc điểm thực vật 5

1.2.2 - Phân b ố 5

1.2.3 - Tác dụng và công dụn g 6

1.2.4 - Thành phần hoá h ọ c 6

1.3 - Tổng quan về Artesunate 8

1.3.1 - Bán tổng hợp Artesunate .8

1.3.2 - Đại cương về Artesunate 10

1.3.3 - Điểm qua một số phương pháp định lượng hiện nay 14

1.4 - Nhận xét và lựa chọn 19

Phần 2 - Thực nghiệm và kết quả 20

2.1 - Nguyên liệu và trang thiết b ị 20

2.1.1 - Dụng cụ và thiết b ị 20

2.1.2 - Hoá chất 20

2.2 - Phương pháp nghiên cứ u 20

2.3 - Kết quả nghiên cứu 21

2.3.1 Khảo sát cơ sở 21

2.3.3 khảo sát các điều kiện định lượng 22

2.3.2 Xây dựng phương pháp 28

2.3.4 Áp dụ n g 29

2.3.5 Đánh giá phương pháp 30

Plasmodium ovale: tỷ lệ mắc bệnh rất thấp chỉ khoảng 0,5%.

Bệnh sốt rét phát triển ở nhiều nước trên Thế giới, đặc biệt là những nơi có khí hậu ẩm thấp (nóng, ẩm, mưa nhiều) như nước ta Tác nhân truyền bệnh là muỗi Bệnh sốt rét là bệnh gây nguy hại lớn đến sức khoẻ của con người, thể

ác tính có thể dẫn tới tử vong Dịch tễ bệnh rất phức tạp, bệnh có thể lan thành dịch nếu không được phát hiện và ngăn chặn kịp thời

Cho đến nay, mặc dù đã có rất nhiều đầu tư nghiên cứu nhưng việc kiểm soát bệnh vẫn rất khó khăn, do đó vai trò của thuốc trong điều trị và dự phòng sốt rét là hết sức quan trọng Nhưng một số loại thuốc trước đây được coi làđặc hiệu hiện đã bị kháng, đặc biệt là Chloroquin đã bị kháng trên 60 quốc giatrong đó có Việt Nam [11] Vì thế việc tìm kiếm và đưa vào sử dụng các thuốc mới trong điều trị sốt rét luôn là một vấn đề lớn được đặt ra với những nhà nghiến cứu [16]

Artesunate là một trong những dẫn chất của Artemisinin thuộc nhóm thuốc điều trị sốt rét mới (Artemisinin được chiết xuất từ cây thanh hao hoa vàng) Nhiều nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới đã công nhận những ưu điểm của nhóm thuốc này: cắt sốt nhanh, ít độc cho cơ thể, có khả năng qua được hàng rào máu não để điều trị sốt rét thể não

Ở Việt Nam Artesunate đã được sản xuất và được sản xuất với quy mô ngày càng lớn, đồng thời đã được Bộ Y tế công nhận là thuốc điều trị sốt rét chủ yếu trong chương trình chống sốt rét quốc gia ở cả hai dạng viên nén và

1

dạng tiêm Chính vì vậy việc kiểm tra và đánh giá chất lượng của các sản phẩm bào chế này là rất quan trọng Để góp phần vào công tác này chúng tôi triển khai thực hiện nghiên cứu một phương pháp mới để định lượng Artesunate trong viên nén Với mong muốn tham gia xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho thuốc này

PHẦN 1 - TỔNG QUAN

trong những năm qua

Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, có tính chất dịch tễ quan trọng vì có thể lan thành dịch nếu không được phát hiện và ngăn chặn kịp thời Bệnh phát

triển ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những nước thuộc vùng khí hậu

nhiệt đới như châu Á, châu Phi, châu Mỹ Latinh Theo thống kê của tổ chức Y

tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 100 - 200 triệu người bị sốt rét thuộc 95 quốc gia trên tất cả các châu lục Bệnh sốt rét đã gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với sức khoẻ của nhân dân ở những vùng sốt rét lưu hành [3] Việt Nam là một nước nằm trong vùng sốt rét lưu hành mạnh của Thế giới Theo báo cáo của Viện sốt rét ký sinh trùng và côn trùng TW, hàng năm nước ta có khoảng 500.000 người mắc bệnh sốt rét và 200 - 5.000 người chết do sốt rét, hơn 30,1 triệu người đang sống trong vùng sốt rét lưu hành [12]

Từ những năm cuối thập kỷ 90, công tác phòng và chống sốt rét đã được

Bộ Y tế quan tâm hơn và cũng đã thu được nhiều thành tích đáng kể Tổng kết kết quả phòng chống sốt rét ở Việt Nam từ năm 1992 - 1997 cho thấy bệnh nhân sốt rét năm 1997 đã giảm 59% so với năm 1991, chết do sốt rét đã giảm 97%, đồng thời số vụ dịch sốt rét cũng đã giảm 92% Đầu tư hàng năm mua thuốc và hoá chất phòng chống sốt rét của Chương trình phòng chống sốt rét quốc gia khoảng 35 - 40 tỷ đồng [13]

Với tính chất nguy hiểm của bệnh, việc ngăn chặn và loại trừ sốt rét là một trong những nhiệm vụ hàng đầu của ngành Y tế Việc kiểm soát bệnh sốt rét là rất khó khăn, có tới 1,7 tỷ người hiện đang sinh sống trong những vùng mà

3

trước đó sốt rét đã bị đẩy lùi, nhưng giờ đây đang phát triển mạnh trở lại Hiện nay, ký sinh trùng sốt rét đã kháng hầu hết các thuốc quen thuộc vẫn dùng để phòng và điều trị trong thời gian qua Cloroquin đã bị Plasmodium falciparum kháng khoảng 60%, các thuốc như Fansida cũng đã bị kháng khoảng 30 - 35% Mefloquin tác dụng khá tốt nhưng giá thành cao và hiện cũng đã bắt đầu

bị kháng Quinin ít bị ký sinh trùng kháng hơn nhưng lại có một số tác dụng phụ gây khó khăn cho bệnh nhân Chính vì vậy, nhóm thuốc Artemisinin và dẫn chất khi mới được đưa ra áp dụng điều trị sốt rét đã gây được tiếng vang lớn và thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học [12,15]

Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết được từ lá cây thanh hao hoa vàng một loại hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét có tên gọi là Quinghao Su (QHS) hay là Artemisinin chất này đã được chứng tỏ hiệu lực chống sốt rét tốt kể cả với những bệnh nhân mắc chứng kháng thuốc Hơn thế nữa, Artemisinin và dẫn chất của nó có thể vượt qua hàng rào máu não nên rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [8] Tuy nhiên, do độ tan của Artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao nên tác dụng điều trị của Artemisinin phẩn nào còn bị hạn chế Để hoàn thiện khả năng của Artemisinin, những năm đầu thập kỷ 80, các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ Artemisinin như: Artesunate, Artemether, Arteether, acid Artelinic có tác dụng điều trị cao hơn chất gốc, đồng thời có thể sử dụng được cho cả đường tiêm Trong số đó thì Artesunate là chất được dùng phổ biến nhất Hiện nay, ở Việt Nam đã có nhiều cơ sở sản xuất Artemisinin dạng viên để uống và Artesunate dạng uống

và dạng tiêm để đáp ứng nhu cầu của nhân dân Vì vậy, vấn đề cần quan tâm của các nhà sản xuất và quản lý là đảm bảo công tác kiểm tra chất lượng thuốc Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong nước về các mặt khác nhau của nhóm thuốc này như tác dụng dược lý, độc tính, dạng bào chế, v.v v ề kiểm nghiệm, cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về định tính, định lượng

Artemisinin và Artesunate; hiện nay Dược điển Việt Nam III cũng đã có những chuyên luận về hai thuốc này.

1.2 - Cây thanh hao hoa vàng và hoạt chất của nó

1.2.1 - Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Artemisia annua L Asteraceae

Tên dân gian: ngải si, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng

Cây thảo, mọc hàng năm, thân cao tới lm, có rãnh, gần như không lông

Lá sẻ lông chim 2 lần thành dải hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm Chuỳ cao ở

ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8 - 2,0mm, lá bắc ngoài hẹp có lông xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng Hoa hoàn toàn hình ống, khoảng

15 cái, hoa trong lưỡng tính Quả bế nhấn, cao 0,5mm không có mào lông, hoa tháng 6 - 11, có quả tháng 1 0 - 3 thường lụi vào tháng 5 [2]

Theo thông báo của WHO, của Trung Quốc, của Mỹ, trong khoảng 40 loài thực vật thuộc chi Artemisia, qua chọn lọc chỉ có loài Artemisia annua L là

có chứa hoạt chất chữa sốt rét Theo T.D.HOOKER, M.H.LECOM 1992 và một số tài liệu khác thì trên Thế giới có khoảng 250 loài thuộc chi Artemisia,

ở Việt Nam đã biết khoảng 15 loài, trong đó có 4 loài là dễ nhầm lẫn với nhau,

đó là: Artemisia apiceaehance, Artemisia capilaris, Artemisia canpestric và Artemisia annua [2,9]

1.2.2 - Phân bô

Thanh hao hoa vàng phân bố ờ nhiều nơi trên Thế giới chủ yếu tập trung ở

những nơi có khí hậu nhiệt đới và ôn đới như Bắc Mỹ, Đông Âu, Nga, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Tại Việt Nam, cây mọc hoang dại thành từng cụm dọc ven sông, ven suối, chân đồi nơi ẩm thấp ánh sáng nhiều

Ta có thể gặp ở các tỉnh như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Cạn,

Thái Nguyên, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Hoà Bình, Thanh Hoá Nghệ A n Do vừa là dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao vừa dễ trồng, dễ thích nghi với điều

5

kiện khí hậu nên thanh hao hoa vàng đã được trồng với diện tích rộng, cho năng suất và hàm lượng hoạt chất cao hơn cây mọc hoang dại Thời gian thu hái vào tháng 8 - lúc cây chuẩn bị ra hoa [2]

1.2.3 - Tác dụng và công dụng

Theo YHCT Việt Nam, thanh hao hoa vàng có vị đắng (khổ), tính lạnh (hàn) quy vào hai kinh can, đởm Có tác dụng thanh thư tịnh uế, trừ phục nhiệt

ở âm phận dùng chữa những trường hợp cốt chưng lao nhiệt (đau xương,

nóng), đạo hãn (ra mồ hôi trộm), ngược tật (sốt rét), lở ngứa Còn dùng chữa mạo cảm, thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi gan mật Có thể dùng riêng hoặc phối hợp với các thuốc khác [9] Theo khoa học hiện đại, dùng làm nguyên liệu chiết Artemisinin để chữa bệnh sốt rét

1.2.4 - Thành phần hoá học

Tất cả các bộ phận của cây thanh hao hoa vàng đều chứa tinh dầu và hàm lượng tinh dầu trong cây rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi trồng, dao động từ 0,5 - 0,6% Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi long não với thành phần chủ yếu là Camphor, Artemisia ceton, P-myrcen [2,9,14]

Trong thành phần tinh dầu này thì hoạt chất chính có tác dụng điều trị sốt rét là Artemisinin đã được các nhà khoa học Trung Quốc chiết tách và xác định cấu trúc từ năm 1972, Artemisinin là một Secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân tử, chính nhóm này quyết định tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét Bên cạnh Artemisinin, người ta còn xác định được một loạt các hợp chất Secquiterpen khác như sau [14]

Artem isin D eo x y artemisinin Artem isitin

Arteannuin c Arteannuin B Epideoxyarteannuin B

Acid Artemisinic Arteannuin A Quinghao Su IV

(Quinghao Su I)CH3

trường Methanol và ở nhiệt độ 0 - 5°c

Sơ đồ phản ứng như sau:

Hình 1.2: Sơ đồ phản ứng khử Artemisinin thành DHA

DHA có tác dụng trị sốt rét mạnh gấp hai lần Artemisinin nhưng do ít tan trong nước nên bất tiện cho việc sử dụng Vì vậy người ta tiếp tục bán tổng hợp ra Artesunate

• Giai đoan II:

DHA được este hoá thành Artesunate khi có tác dụng với anhydrid Succinic, xúc tác là một amin bậc 3: Dimethylamino pyridin(DMAP) hay hỗn hợp DMAP và Dicyclohecxyl carbodiimid (DCC):

Sơ đồ phản ứng:

COOHHình 1.3: Sơ đồ tổng hợp Artesunate từ DHA

Ngoài Artesunate, từ DHA người ta còn bán tổng hợp ra nhiều chất khác

có hoạt lực tác dụng tương tự như: Artemether (AM) và Arteether (AE) bằng cách cho DHA tác dụng với Methanol hoặc Ethanol xúc tác là acid Lewis Artesunate kém bền vững hơn AM và AE do chất này có chức este dễ bị thuỷ phân, hơn nữa AM và AE lại tan tốt trong dầu và có hoạt tính chống sốt rét ngang với Artesunate[6,16]

Hình 1.4: Công thức của Artemether và Arteether Hiện nay người ta đã tổng hợp ra một dẫn chất mới có hoạt lực cao trên ký sinh trùng sốt rét đó là acid Artelinic Chất này vừa có hiệu lực cao hơn

9

Artesunate và AM, mặt khác muối Natri của nó lại tan tốt trong nước nên có thể chế được cả dạng uống lẫn dạng tiêm [1].

H^C

H i C

, - H ÓCH2— H ^ ) ^ C 0 0 R

Thuỷ Phân

Hình 1.5: Sơ đồ tổng hợp acid Artelinic

1.3.2 - Đại cương về Artesunate

Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C19H280g

- Trọng lượng phân tử: 384,42

- Tên khoa học: a-Dihydroartemisinin hydrosuccinic

- Tên khác: acid Artesunic

- Tính chất của Artesunate [4]

Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi và thực tế không vị.Rất khó tan trong nước, rất tan trong Dicloromethan, dễ tan trong Ethanol,Aceton, Chloroform và dung dịch kiềm Bền vững trong môi trường trungtính, trong nước dễ bị thuỷ phân đặc biệt trong môi trường kiềm Dạngmuối Natri dễ tan trong nước, do vậy để pha dung dịch thuốc tiêm

Năng suất quay cực của Artesunate là: +10° đến +14° (dung dịch 4% trongChloroform)

■ Tác dụng , cơ chế và dược động học của Artesunate:

- Tác dụng: diệt thể phân liệt của ký sinh trùng sốt rét trong máu, kể cả các trường hợp kháng Chloroquin Không có tác dụng đối với ký sinh trùng ở giai đoạn ngoại hồng cầu và thể giao tử Tác dụng nhanh, hiệu lực cao , độc tính thấp Hiệu lực cao với sốt rét ác tính thể não, sốt rét kháng Chloroquin và kháng cả thuốc sốt rét khác

- Tác dụng diệt ký sinh trùng của Artesunate mạnh gấp 5 lần so vớiArtemisinin Nó là một trong những thuốc điều trị sốt rét hiệu quả nhấthiện nay

- Cơ chế [8,16]: theo Gu và cộng sự, tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét của Artesunate là do cầu nối peroxyd nội phân tử tạo ra các gốc tự do Các gốc này tấn công vào các thành phần cơ bản của ký sinh trùng và tiêu diệt chúng Chính vì vậy, khi bị mất cầu nối peroxyd thì thuốc không còn tác dụng Ở pH cao, Artesunate tạo ra tức thì các dạng hoạt động Cơ chế này khác hẳn với các thuốc tổng hợp trước đây Bằng phương pháp đánh dấu dùng Triti các nhà khoa học nhận thấy rằng

11

nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm Plasmodium cao hơn hẳn so với hồng cầu bình thường Cơ chế cụ thể là: Artesunate tấn công vào màng Plasmodium Ngoài ra, Artesunate Natri còn ức chế hoạt tính của Cytocrom oxydase và hệ vận chuyển Glutathion trong hồng cầu.

- Dược động học: theo đường uống Artesunate hấp thu từ 24 - 64% Thời

gian bán thải T ị /2 bằng 41 phút Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyểnhoá tại gan Thuốc qua được hàng rào rau thai nên tránh dùng cho phụ

nữ có thai Artesunate thải trừ qua nước tiểu và các chất thải trừ tìm thấy trong nước tiểu gồm 9,10-Dihydroartemisinin, Deoxyartemisinin, Dihydrodeoxyartemisinin

- Tương tác thuốc: tác dụng của Artesunate là do cầu nối peroxyd đem lại Vì một lý do nào nào đó mà phân tử Artesunate bị mất cầu nối này thì nó không còn tác dụng nữa Do đó tác dụng của Artesunate sẽ bị giảm đi khi có mặt của chất xúc tác thuỷ phân như Catalase hay các chất khử như acid Ascorbic, Vitamin E, Glutathion dạng khử và tác dụng tăng lên khi có mặt các chất oxy hoá gây stress như Misconasol, Doxarubicin

- Các thuốc chống sốt rét khác như: Mefloquin, Primaquin, Chloroquin khi phối hợp với Artesunate cho tác dụng hiệp đồng tăng cường hay hiệp đồng cộng Ngược lại các chất kháng Folat như Pyrimithamin, Sulphamid lại có tác dụng đối kháng [8]

■ Chế phẩm và cách dùng Artesunate trong điều trị:

- Chế phẩm:

• Biệt dược: Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khoảng trên 10

biệt dược chế phẩm Artesunate ở hai dạng bào chế:

• Dạng bào chế:

Viên nén 50 mg

Bột pha tiêm: lọ chứa 60mg acid Artesunic ở dạng bột khô vô trùng

kèm ống tiêm có chứa lml dung dịch Natrihydrocarbonat 5% trong nước cất

- Chỉ định: Điều trị sốt rét do Plasmodium fanciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malarie, kể cả sốt rét do nhiễm Plasmodium fanciparum đã kháng các loại thuốc khác

- Liều dùng:

Dạng uống: Viên nén 50mg:

Điều trị: mỗi đợt 12 viên trong 6 ngày

Phòng bệnh: Uống 2 viên/ lần /tuần X 5 tuần

Dạng tiêm: hoà tan thuốc vào dung dịch Natrihydrocarbonat cho thêmdung dịch Glucose đẳng trương để có nồng độ 10mg/ml

- Độc tính bán cấp: Cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch Natri artesunate 2ml/kg/24h tương ứng với 20mg vào giờ nhất định trong ngày, cho uống liên tục trong 30 ngày chưa thấy có độc tính bán cấp.Những thay đổi cấu trúc vi thể ở gan và thận chuột nhắt trắng khi uốngArtesunate liều điều trị: cho chuột nhắt trắng uống Artesunate liều 4mg/kg thểtrọng trong 5 ngày liền:

Không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận Cấu trúc chung của gan và thận không thay đổi

Có hiện tượng xung huyết các mạch trong thận

13

- v ề khả năng gây đột biến: Artesunate không làm tăng tần số rối loạn nhiễm sắc thể ở tế bào tuỷ xương hoặc tế bào tinh hoàn, không làm xuất hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về sinh sản Các chuột con được đẻ ra không có dị tật bẩm sinh: quan sát được cả F1

và F2, số lượng cũng như trọng lượng của chuột con được đẻ ra bình thường Khi chuột chửa uống Artesunate không gây nên những bất thường ở thế hệ con [10]

Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thử nghiệm Artesunate trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân nhiễm Plasmodium faciparum không biến chứng Kết quả:

Khi thử trên người khoẻ mạnh không có sự thay đổi về huyết học, sinh hoá, điện tim trước và sau khi thử Tại chỗ tiêm không có phản ứng, không đỏ, không mẩn ngứa Thuốc khuyếch tán nhanh Dấu hiệu chủ quan: người tình nguyện không thấy có cảm giác gì đặc biệt sau khi tiêm

Với bệnh nhân nhiễm Plasmodium faciparum không biến chứng: thuốc có hiệu quả điều trị trên mọi đối tượng bệnh (cả người lớn và trẻ em) có tác dụng mạnh với ký sinh trùng sốt rét, làm giảm nhanh mật độ của ký sinh trùng (đa

số trong vòng 24 giờ đầu), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng Thuốc không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh hưởng gì đến hệ tim mạch

1.3.3 - Điểm qua một sô phương pháp định lượng hiện nay

1.3.3.1 - Các phương pháp định lượng Artesunate trên nguyên liệu

*Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại

Sau khi đun nóng trong môi trường kiềm, Artesunate chuyển thành Q289

là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm, do đó có thể định lượng Artesunate trong chế phẩm và trong nguyên liệu bằng phương pháp đo

độ hấp thụ cuả sản phẩm thuỷ phân này trên máy quang phổ tử ngoại ồ bước

sóng 289nm

Artesunate sau khi thuỷ phân trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm sau[ll,14,16]:

CH3

H :

coơI

h3c

COOH

KOH50°c

H3C c ° 2

coo

ồHình 1.7: Sơ đồ thuỷ phân Artesunate thành Q289

Nhận xét: phương pháp này dễ thực hiện trang thiết bị để định lượng các cơ

sở đều có được Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là Artesunate mà là sản phẩm biến đổi của nó trong môi trường kiềm - Q289 Theo [3] thì hàm lượng Dihydroartemisin (DHA) trong chế phẩm phải nhỏ phép định lượng mới cho kết quả đúng Tuy nhiên trong chế phẩm viên nén lượng DHA thường cao

* Phương pháp HPLC với detector u v [12,15,17]:

Định lượng Artesunate với pha động là Acetonitril - đệm phosphate pH5,l (38:62) hoặc với pha động Acetonitril - đệm acetat pH5,1(1:1), bước sóng phát hiện là 235nm Hoặc để định lượng Artesunate trong dược liệu, trong các dịch sinh vật, người ta đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trình sắc ký cột Lichrosorb Rp 60 (125 X 4mm; 5|u,m), pha động: 48% CH3CN 4- 32% dung dịch KH2P 0 4 0,05M trong nước + 20% nước, tốc độ dòng lml/phút, detector 210nm và thể tích tiêm 20|il, với chương trình trên, Artesunate có tR=21phút

Nhận xét: Artesunate chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng

ngắn, ở đây bước sóng phát hiện là 235nm, chất định lượng có thể không phải

là Artesunate, nên DHA(nếu có) có thể sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng

* Phương pháp HPLC với detector điện hoá [3,15]

Trong phân tử Artemisinin và dẫn chất của nó có chứa cầu nối peroxyd nội phân tử, cầu nối này quyết định tác dụng điều trị sốt rét của riêng chúng Đồng thời chính sự có mặt này mà người ta đã sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hoá để định lượng Artesunate

Quá trình xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau:

Nhận xét: phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp cho việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật Tuy nhiên, không phải cơ sở nào cũng có đủ trang thiết bị để áp dụng phương pháp này

*Phương pháp HPLC với detector khúc xạ k ế

Định lượng Artesunate với pha tĩnh là cột RP18 (12,5cmx3,5mm) cỡ hạt 5|um, pha động là acetonitril - đệm pH3 (l,36g KH2P 0 4 trong 11 nước, điều chỉnh tới pH3 bằng H3PO4) với tỷ lệ 1:1 Tốc độ dòng 0,6ml/phút, nồng độ dung dịch mẫu 4mg/ml, thể tích tiêm mẫu 20|ul, detector khúc xạ kế

* Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan [22]:

Dựa vào nhóm acid tự do còn lại trong phân tử Artesunate để tiến hành định lượng Chế phẩm (~ 0,2g) được hoà tan trong Ethanol tuyệt đối(50ml) Chuẩn độ bằng dung dịch Tetrabuthylaminonium hydroxyd trong 2-Propanol (0,lmol/l) Điểm kết thúc của phép định lượng xác định bằng chỉ thị tím tinh thể trong acid Acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm dừng

H3C

ÒRHình 1.8: Sơ đồ khử cực của Artesunate trên bề mặt điện cực

* Phương pháp chuẩn độ acid - base:

Cũng dựa vào nhóm acid tự do người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm chức này bằng dung dịch NaOH với chỉ thị là Phenolphtalein, từ đó suy ra hàm lượng Artesunate Hoặc có thể định lượng Artesunate bằng phương pháp chuẩn độ gián tiếp Cho Artesunate tác dụng với một lượng dư KOH rồi chuẩn

độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn acid

Nhận xét: phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng khi không có acid Succinic tự do trong chế phẩm, nên khó có thể áp dụng cho định lượng viên nén Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp dễ thực hiện song phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng nguyên liệu Artesunate, muốn áp dụng trong định lượng các dạng bào chế Artesunate thì cần được nghiên cứu thêm

* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ vùng khả kiêh[ 15]:

Dựa vào nhóm chức ester của Artesunate để làm phản ứng tạo Hydroxamat sắt(III) có màu và đo quang dung dịch thu được ở bước sóng 508nm

Nhận xét: phương pháp này không phụ thuộc sự có mặt của acid Succinic song DHA lại ảnh hưởng tới kết quả định lượng

*Các phương pháp khác[ 15]:

- Cầu nối peroxyd nội phân tử của Artesunate và Artemisinin còn thể hiện sự đáp ứng trên điện cực giọt thuỷ ngân, nên người ta còn dùng phương pháp cực phổ để định lượng

- Phương pháp phân tích phóng xạ miễn dịch đã được áp dụng để định lượng Artemisinin và các dẫn chất của nó

- Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để định lượng Artemisinin và các dẫn chất trong mẫu thử sinh học

- Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu bằng Tritium [11]

- Phương pháp đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng

17

- Định lượng Artesunate dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ

vùng khả kiến dựa vào phương pháp tách chiết (phân lập Artesunate

khỏi DHA) và phản ứng tạo Hydroxamat sắt có màu, khắc phục được

ảnh hưởng của DHA đến kết quả định lượng [15]

- Định lượng Artesunate dạng nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ

vùng tử tử ngoại ở bước sóng 289 nm, song khắc phục được ảnh hưởng

của DHA đến kết quả định lượng bằng cách tách chiết, phân lập

Artesunate khỏi DHA [17]

* Định lượng Artesunate trong nguyên liệu bằng phương pháp đo phổ hấp thụ ở bước sóng 345nm[l 1]:

Cân chính xác khoảng 0,lg Artesunate, hoà tan trong Ethanol tuyệt đối

chuyển vào bình định mức 50ml, thêm Ethanol tuyệt đối đến vạch (dung dịch

A), lắc đều Hút chính xác 5ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml

Thêm 10ml dung dịch NaOH 0,2N Đun cách thủy ở nhiệt độ 50°c±l°c trong

45 phút sau đó làm nguội nhanh bằng nước máy Thêm tiếp 4ml dung dịch

acid Acetic 1,1M, lắc đều Thêm 5ml dung dịch ZnCl2 0,5%, lắc đều Thêm

tiếp 10ml dung dịch thuốc thử Diazoni (mới pha khoảng 15 phút trước đó)

Thêm nước cất vừa đủ 50ml, trộn đều Để yên 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước

sóng 345nm Song song tiến hành với mẫu trắng (không có 5ml dung dịch A)

và mẫu t h ử

1.3.3.2 - Các phương pháp định lượng Artesunate trong viên nén đang

được áp dụng ở nước ta

*Phương pháp quang phổ [4]

Cân 0,130g chế phẩm chuyển vào bình định mức 100ml, hoà tan bằng

Ethanol tuyệt đối, thêm dung môi tới vạch và lắc đều Lọc, bỏ 10ml dịch lọc

đầu Lấy chính xác 5,0ml dịch lọc tiếp theo chuyển vào bình định mức 50ml,

thêm dunh dịch NaOH 0,1N đến vạch Làm ấm trong nồi cách thuỷ 50±l°c

trong 60 phút Làm nguội nhanh bằng nước lạnh Đo độ hấp thụ của dung dịch