Nghiên cứu định lượng metronidazol bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại trong môi trường kiềm

Bộ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘITRẦN THỊ ĐẢM NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL BANG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HÂP THỤ TỬ NGOẠI TRONG MÔI TRƯỜNG KIỂM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KH

Bộ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN THỊ ĐẢM

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL BANG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HÂP THỤ TỬ

NGOẠI TRONG MÔI TRƯỜNG KIỂM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHOÁ (1997 - 2002)

Ngưòi hướng dẫn : TS T R Ầ N đ ứ c h ậ u Nơi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ Dược

Thòi gian thực hiện : 03 / 2002 05 / 2002

HÀ NỘI, THÁNG 05 - 2002

h ê íy t ồ i æ iit h à ụ ^ Í Ả Im iụ h iê í đ tL S Â U s ắ e n h ấ t t ố i ÇîfÎîcÆQl 'X)cÂ(ÌẨ.f nạuằi thầụ irựe iìêịi hưầềỉg dẫn, ỉtă dành nhiều eồnạ iứe ạẦúệL ĩtẵ im tv4ujjềềL đạ i nhữníẬ kình Míịhiêm

q u í háu trs*iạ »nối qitá trình- tồi thựe hiên Uítéa luăểi ỉế í ngJUtêfL.

Çîèi ddn ehăn thành eăwt đtL eáe thầiẬ eA íịĩáí%^ eáe eê kụ thuật úiĩn â hẠ wimi hjấ€L dượ^ đã ạiúfL đẵ tọí% m ọi điều kiên đê tồi oá ihê kữàn thành tế t khóa luản.

Q uếi eùnựf tồi úẠ eùtiíỊ eArn đếi ạia Ểtinh^ imn lứ oủ n íịu ồì

thân ¿tã ĩtẵnạ úỉẻn ŨỈ! hêí iầềiụ ụiÚỊL ítẵ ỉtê tồi hũìin thĩinh Ulióíi

luận tất nghiêfL nàij

'Tõà nài, nạàụ 20 tháníỊ 05 năm 2002

Sink úìêềt Çîvun Çîhi <ĩ>ảm

1.2 Điểm qua một sô'phương pháp định lượng M etronidazol 1

1.2.1 Phương pháp định lượng Metronidazol trong nguyên liệu 71.2.2 Phưoỉng pháp định lượng Metronidazol trong viên nén 8

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 11

2.3.1 Khảo sát các điều kiện định lượng 122.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ hấp thụ của dung dịch 142.3.3 Theo dõi độ ổn định của dung dịch sản phẩm cuối cùng 15

ĐẶT VẤN ĐỂ •

Metronidazol là một dẫn chất imidazol của ethanol, thường được sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn, kị khí do tác dụng rất nhanh và ổn định với Bacteroides fragilis (là khuẩn kị khí chủ yếu gây ra bệnh) Mặt khác do Metronidazol khuyếch tán ở mọi mô, nên được dùng tốt nhất trong nhiễm khuẩn toàn thân, viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn thần kinh trung ương (áp

xe não, viêm màng não mủ ) nhiễm khuẩn vùng đầu cổ, viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường tiết niệu [2] Ngoài ra, Metronidazol còn được dùng phối hợp với một số thuốc khác trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng

Metronidazol nhờ nhóm thế Imidazol có hoạt tính dược lý kháng ký sinh đơn bào ( Protozoa ) như Entamoeba, Trichomonas, Giardia trong khoang phủ tạng, trong mô và kháng vi khuẩn kỵ khí Trong pH sinh lý ( pH = 6,6 ), Metronidazol không bị ion hoá và được hấp thu bỏfi các vi sinh vật do tính thân mỡ cao của phân

tử Cơ chế tác dụng chính là bẻ gãy các DNA mới của vi smh vật [6]

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều dạng bào chế của Metronidazol như: viên nén, thuốc mỡ, thuốc tiêm, thuốc đặt trực tràng, thuốc đặt âm đạo

V V với nhiều biệt dược khác nhau Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như thành phẩm là nhiệm vụ rất quan trọng Trong DĐVN III đã có chuyên luận về Metronidazol dạng nguyên liệu và viên nén Song để mở rộng thêm các phưcỉng pháp định lượng Metronidazol, góp phần

làm cơ sở cho công tác kiểm nghiệm thuốc, trong khuôn khổ khoá luận tôì

nghiệp này chúng tôi dự định và tiến hành nghiên cứu nội dung sau:

Nghiên cứu định lượng Metronidazol (nguyên liệu và viên nén) bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại trong môỉ trường kiềm.

• Dang muối hvdroclorid:

- Công thức phân tử: QH9N3O3.HCI

- Phân tử lượng : 207,6

• Dang muối benzoat:

- Công thức phân tử: QH9N3O3.C7H4O

nước, kiềm hoá dịch chiết rồi chiết bằng cloroform Bốc hơi cloroform được Metronidazol thô, đem kết tinh lại trong ethyl acetat.

H

— N

,o+ C I - C H 2- C H 2- O H

• Nhiệt độ nóng chảy: 159 - 163°c

• ít tan trong nước (1/100), ethanol (1/200), cloroform (1/250) và ether Hơi tan trong aceton và dicloromethan, ít tan trong dimethyl formamid, tan trong dung dịch acid loãng [9] Độ tan của Metronidazol được cải thiện khi dùng chất làm tăng độ tan hoặc hỗn hợp dung môi tan trong nước

• Phổ tử ngoại: Metronidazol hấp thụ cực đại ánh sáng trong môi trường

acid ở bước sóng 277nm, trong môi trường kiềm là 319nm [9] và trong

nước là 324nm [8]

• Một số tác giả nhận xét rằng: các chế phẩm chứa Metronidazol có độ ổn định tốt nhất khi pH « 5 [8]

1.1.5 Tác dụng dược lý: [5,10]

• Dược lực ( phổ kháng khuẩn, cơ chế tác dụng ):

- Metronidazol là thuốc có tác dụng trên các nguyên sinh động vật ( như Trichomonas vaginalis, Amip, Giardia lambia ) và nhiều vi khuẩn kị khí ( gồm cả Bacteroides ữagilis, Eusobacterium sporulae, Clostridium perfrungens ), cầu khuẩn kỵ khí

- Có tác dụng diệt vi khuẩn Helicobacter pylori gây bệnh viêm dạ dày mạn tính và loét dạ dày tá tràng.

- Cơ chế tác dụng: sau khi uống, Metronidazol bị các vi khuẩn ở ruột đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí khử nhóm nitro, tạo thành một sản phẩm trung gian gắn vào các vị trí quan trọng trong tế bào của các vi khuẩn cùng với sự phá vỡ và ức chế tổng hợp các ADN Quá trình oxy hoá khử chịu ảnh hưởng rõ rệt của các protein vận chuyển điện tử có thế oxy hoá khử thấp đóng vai trò chính trong việc chuyển hoá của các

vi khuẩn kị khí Tác dụng của Metronidazol đối với Trichomonas, Amip và Giardia lambía là do phá vỡ và ức chế sự tổng hợp ADN

• Dược động học:

- Hấp thu: thuốc hấp thu nhanh khi uống, khi tiêm tĩnh mạch hay đặt trực tràng Dạng thuốc đặt âm đạo hấp thu rất ít Dạng thuốc mỡ bôi da hấp thu tốt Chế phẩm gel bôi âm đạo có thể đạt sinh khả dụng khoảng 56% [10]

- Phân bố: trong cơ thể, Metronidazol phân bố rộng rãi có mặt trong

nhiều mô và dịch cơ thể ( như mật, xương, sữa mẹ, dịch não tuỷ, áp xe gan, nước bọt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo ) với nồng độ tương tự trong huyết tương Thuốc cũng qua nhau thai và đi vào tuần hoàn thai nhi nhanh chóng Liên kết với protein huyết tưcmg không quá 20%

- Chuyển hoá: Metronidazol được chuyển hoá qua gan bằng cách oxy hoá mạch nhánh và liên hợp glucuronic

- Thải trừ: thải trừ chính qua nước tiểu, chủ yếu ở dạng chất chuyển hoá trong thời gian 48 giờ, một lượng nhỏ thải trừ qua phân Thời gian bán huỷ khoảng 8 giờ và lâu hơn ở những người bị bệnh gan

• Chỉ định [5]:

- Viêm niệu đạo và âm đạo do Trichomonas, lỵ amip, viêm miệng, nhiễm khuẩn do vi khuẩn kị khí

- Tiêm truyền tĩnh mạch trong trường hợp bệnh nhân không dùng được thuốc uống để điều trị các nhiễm khuẩn máu do vi khuẩn kị khí và các

nhiễm khuẩn ở ngực, bụng, đường sinh dục và tiết niệu của phụ nữ, áp

xe não và màng não, ở xưcmg khớp, viêm màng trong tim và nhất là các nhiễm khuẩn do Bacteroides fragilis kháng Penicillin và Aminosid

- Phòng tái phát ở bệnh loét tá tràng Uống kết hợp với Amoxyciclin và

Bismuth nitrat kiềm

- Điều trị mụn trứng cá thông thường và mụn trứng cá đỏ, mụn mủ và các viêm nhiễm dưới da, vết thương, vết bỏng đang lên da, hăm da ở trẻ em

• Liều dùng [10,15,16]:

- Amip ruột gây lỵ: Người lớn: l,5g/ngày chia 3 lần

Trẻ em: 30 - 40mg/kg/ngày chia 3 lần

- Amip gan gây áp xe gan, dẫn lưu mủ song song với điều trị bằng Metronidazol l,5g/ngày liên tục trong 7 ngày

- Bệnh do Trichomonas: gây viêm âm đạo ở phụ nữ hoặc đường niệu

ở nam Liều duy nhất 2g hoặc 250mg/lần X 2 lần/ngày điều trị trong 10 ngày

- Bệnh do Giardia intertinalis: điều trị trong 5 ngày Tuỳ theo tuổi

Người lớn: 0,75 - Ig/ngàyTrẻ em: 10 - 15 tuổi: 500mg/ngày

- Dự phòng nhiễm khuẩn vi khuẩn kị khí trong phẫu thuật: phối hợp Metronidazol SOOmgAần X 3 lần/ngày với 1 thuốc đặc hiệu trên vi khuẩn đường ruột Bắt đầu dùng từ 48 giờ, trước khi phẫu thuật Với trẻ em: 20 - 30 mg/kg/ngày.

- Với phụ nữ có thai: những nghiên cứu trên động vật cho thấy Metronidazol không gây quái thai và không độc đối với phôi thai, ở phụ nữ có thai 3 tháng đầu cũng không thấy độc và không có trường hợp dị dạng nào, do đó không chống chỉ định với phụ nữ có thai 3 tháng đầu trừ trường hợp cần thiết

- Disulfuram: có thể gây cơn hoang tưởng, rối loạn tâm thần

- Với alcol: gây hiệu ứng anabuse ( nóng, đỏ, nôn mửa, tim đập nhanh )

- Thuốc chống đông máu và tăng nguy cơ xuất huyết ( do giảm chuyển

hoá ở g a n ).

- Với Vecuromin ( dẫn chất cura không khử cực ) Metronidazol làm tăng tác dụng của nó

- Với 5 - fluoro uracil: làm tăng độc tính của 5 - fluoro uracil do làm

giảm sự thanh thải.

- Metronidazol có thể làm tăng nồng độ Lithium huyết

1.1.7 Dạng bào chế: [10,16]

• Dạng viên nhộng: Metronidazol capsule 500mg

Biệt dược: Flagyl

• Dạng viên nén: Metronidazol tablets 250mg

Biệt dược Metrosole, Neo - metic

• Dạng tiêm:

- Metronidazol injection 5mg/ml lOOml

Biệt dược: Flagyl I.V.R.T.U, Metronidazol LV.Methyl I.v

- Metronidazol hydrocloride 500mg base/ lOOml

Biệt dược: Flagyl I.v

1.2 ĐIỂM QUA MỘT s ố PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL

1.2.1 Phương pháp định lượng Metronidazol nguyên liệu:

• Phươns pháp đinh lươns trone môi trườns khan: [7,12,14]

Trong phân tử Metronidazol có chứa dị vòng imidazol, dị vòng này có 2 nitơ nên mang lại tính base ( do còn cặp điện tử tự do có thể hút nguyên tử hydưo của nước về phía dị tố và ion -OH được phân ly biểu hiện tính base ), tuy nhiên 1 nitơ cạnh nhóm nitro có tính base rất yếu Vì vậy khi tác dụng vói acid chỉ có một Nitơ tham gia phản ứng tạo muối Dựa vào tính chất này dược điển dùng phương pháp định lượng trong môi trường khan

Cân chính xác khoảng 0,35g nguyên liệu hoà tan trong 30ml acid acetic băng Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M Điểm kết thúc của phép định lượng được xác định bằng chỉ thị 1 - naphtholbenzen trong acid acetic băng hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ điện thế

Iml dung dịch acid percloric 0,1M tương ứng với 17,12 mg Q H9N3O3

Nhân xét:

- Phuofng pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao

- Khi chuẩn độ không cần chất chuẩn

- Quá trình tiến hành trong môi trường khan cần phải chú ý đến các yếu

tố tác động gây ra sai số

1.2.2 Phương pháp định lượng viên nén Metronidazol:

• Phươn 2 pháp đinh lươns bằn 2 sắc ký lỏns cao áy pha đảo: [6, 13]

Định lượng Metronidazol bằng sắc ký lỏng cao áp với chương trình sắc ký:

- Cột Supelco IC - AB2 (150 X 4,6mm, 5|Lim )

- Detector UV đặt ở bước sóng 292nm, độ nhạy 0,05AUFS, Intergator: Attenuation = 1; Minimum area = 1000, Speed 2 Stop time = 6

- Pha động: acid phosphoric 0,0IM : CH3CN : CH3OH với tỷ lệ ( 1000 : 225 ; 25 )

Metronidazol là một base Lewis, nên dùng pha động pH = 2,4 (<3) có lọi hơn pH trung hoà Metronidazol rất dễ tan trong môi trưòíig acid^bề rộng của pic sẽ hẹp và túứi đối xứng được đảm bảo ( hệ số cân đối từ 0,9 -1,1)

Nhân xét: phương pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao Nhưng

để thực hiện theo phương pháp này đòi hỏi phải có máy HPLC

• Phươn 2 vháv đinh lươns trons môi trườns khan: [7, 12, 14]

Dựa trên nguyên tắc Metronidazol là một base yếu để tiến hành định lượng trong môi trường khan

Lấy 20 viên nén đem cân Tính khối lượng trung bình của một viên Nghiền 20 viên thành bột mịn trong cối sứ, trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,2g Metronidazol cho vào bình định mức và chiết 6 lần, mỗi lần lOml aceton nóng Tập trung dịch chiết lại, để nguội Thêm vào dịch chiết 50ml anhydrid acetic và 0,1 ml

chỉ thị xanh Briliant 1% trong acid acetic khan Định lượng bằng acid percloric 0,1M cho đến khi xuất hiện màu ánh vàng Song song tiến hành như trên đối với mẫu trắng.

Iml dung dịch acid perdone o ,IM tương ứng với 17,12 mg Q H9N3O3

• Phươns pháp đo phổ hấp thu tử nsoaỉ trons môi trườns acid: r 1 n

Trong phân tử Metronidazol có chứa dị vòng imidzol, dị vòng này hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại Người ta ứng dụng tính chất này để định lượng Metronidazol bằng phương pháp đo phổ tử ngoại Trong môi trường acid HCl, Metronidazol phản ứng với HCl thành muối và đồng thời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 277nm

Cân 10 viên nén Tính khối lượng trung bình của một viên Nghiền

10 viên thành bột mịn trong cối sứ, trộn đều Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 50mg Metronidazol, cho vào bình định mức lOOml Lấy 80ml dung dịch HCl 0,1M cho vào bình định mức và lắc cho tan hoàn toàn, thêm dung dịch HCl 0,1M vừa đủ đến vạch, trộn đều Lọc bằng giấy lọc, loại bỏ 20ml dịch lọc đầu Hút chính xác 5ml dịch lọc trên cho vào bình định mức dung tích 200ml, sau đó thêm dung dịch HCl 0,1M vừa đủ đến vạch Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 277 ± Inm Độ hấp thụ riêng của dung dịch ở 277nm là 377

Nhân xét: phương pháp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị có ở mọi cơ sở đều có thể có được

A Ba phương pháp trên hiện nay đang được sử dụng làm tiêu chuẩn để định lượng Metronidazol ở các cơ sở Song để góp phần làm phong phú thêm các phương pháp định lượng Metronidazol, dựa vào cấu trúc hoá học của Metronidazol chúng tôi nghiên cứu định lượng Metronidazol bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại trong môi trường kiềm.

- Metronidazol dạng nguyên liệu do bộ môn hoá dược cung cấp.

- Metronidazol chuẩn đối chiếu hoá học hàm lượng 99,3% ( SKS

019361 ) do Viện kiểm nghiêm cung cấp

- Viên nén Metronidazol 250mg của xí nghiệp Dược phẩm Hà Nội ( SKS 02090801 )

2.3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Khảo sát các điều kiện định lượng:

Để khảo sát các điều kiện định lượng, chúng tôi tiến hành như sau:

Cân một lượng Metronidazol nguyên liệu, hoà tan trong dung dịch NaOH và đo phổ hấp thụ của dung dịch tạo thành từ bước sóng 220nm đến 500nm Kết quả cho thấy trong môi trưòỉng kiềm, Metronidazol có cực đại hấp

thụ ở 319nm, ở bước sóng này trong môi trường acid, Metronidazol không có

cực đại hấp thụ Từ đó, chúng tôi tiến hành các khảo sát sau:

* Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ hấp thụ của dung dịch:

Để tiến hành khảo sát này chúng tôi làm các thực nghiệm sau:

• Thực nghiệm 1: Cân chính xác 0,lg Metronidazol, cho vào bình định

mức có dung tích lOOml Thêm 15ml dung dịch NaOH 0,01N, lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó bổ sung dung dịch NaOH 0,0IN vừa đủ đến vạch, trộn đều Hút chính xác Iml dung dịch trên cho vào bình định mức có dung tích lOOml, bổ sung dung dịch NaOH 0,0IN vừa đủ đến vạch, lắc đều

Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 319nm, cuvet

dày Icm Mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,0IN

Kết quả được ghi ở bảng 1