Bài viết nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng amantadin hydrochlorid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả năng hấp thụ ánh sáng tại 408 nm.
Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 NGHIấN CU NH LNG AMANTADIN HYDROCHLORID BNG PHNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Thị Thanh Hằng*; Nguyễn Phương Dung** Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) để định lượng amantadin hydrochlorid (AM) mơi trường thử độ hòa tan Đối tượng phương pháp: khảo sát, lựa chọn điều kiện phản ứng tạo phức bromophenol blue (BB) với amantadin Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng với tiêu: độ đặc hiệu, độ xác, độ đúng, đường chuẩn khoảng tuyến tính theo hướng dẫn ICH Kết quả: lựa chọn điều kiện phù hợp cho quy trình định lượng như: pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch BB, thời gian phản ứng số lần chiết dẫn xuất tạo thành Phương pháp định lượng thẩm định với khoảng tuyến tính nồng độ 20 - 250 µg/ml Độ xác ngày khác ngày nhỏ 5,12% 5,31% Độ phương pháp khoảng 95,96 - 102,96% Kết luận: xây dựng phương pháp phù hợp để định lượng AM phép thử độ hòa tan * Từ khóa: Amantadin hydrochlorid; Bromophenol blue; UV-VIS; Phương pháp thử độ hoà tan Study on Spectrophotometric Method for Determination of Amantadine Hydrochloride Summary Objectives: To develop and validate an UV-VIS method for determination of amantadine hydrochloride (AM) in drug dissolution testing Materials and methods: Factors of complex reaction of amantadine with bromophenol blue (BB) were investigated and adapted Validation of the method was conducted with criteria of specificity, precision, accuracy, linearity and calibration curve, according to ICH guidelines Results: The appropriate procedure for the quantitation was adopted with regard to such factors as pH of buffer, concentration of BB, reaction time, and number of extraction The quantitative method was validated with a linear range from 20 to 250 µg/mL Intra- and inter-day precision were less than 5.12% and 5.31%, respectively The accuracy was from 95.96% to 102.96% Conclusion: The developed method is suitable for determination of AM in dissolution testing * Key words: Amantadine hydrochloride; Bromophenol blue; UV-VIS; Drug dissolution testing ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1966, Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận amantadin thuốc dự phòng cúm điều trị virut cúm A người lớn Năm 1969, thuốc sử dụng điều trị giảm triệu chứng bệnh Parkinson, hội chứng ngoại tháp thuốc chứng ngồi nằm không yên (akathisia) * Học viện Quân y ** Đại học Bách khoa Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh (thinhnguyenmp@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/08/2016 Ngày bỏo c ng: 07/09/2016 74 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Hin nay, trờn thị trường có số chế phẩm chứa AM amazolon (Sawai); mantadan (Boehringer, Ing.); mantadin (DuPont Pharma); mantadix (DuPont Pharma); symmetrel (DuPont Pharma) Việc định lượng thuốc gặp nhiều khó khăn amantadin khơng hấp thụ tia UV, khơng có khả phát xạ huỳnh quang Trên giới, có số nghiên cứu phương pháp định lượng AM đo quang phổ hấp thụ, quang phổ huỳnh quang [1], phương pháp HPLC [2], TLC [3], GC-MS [4] Phương pháp định lượng dựa phản ứng tạo dẫn xuất có khả xạ UV xạ huỳnh quang Các chất phản ứng tạo dẫn xuất sử dụng gồm iod [1], 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol [2], 2,3-diphenylquinolizinium bromid [5] Nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết quả: Nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp định lượng AM phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả hấp thụ ánh sáng 408 nm Phương pháp xây dựng có độ xác cao, đơn giản, phù hợp cho phép thử độ hòa tan bào chế viên nén nghiên cứu định lượng khác ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat axít boric, axít chlohydric, natri hydroxyd * Thiết bị nghiên cứu: - Máy đo quang phổ hấp thụ UV-VIS (Biochrom Ltd, Anh) - Máy đo pH (Mettler - Toledo group, Thụy Sỹ) Phương pháp nghiên cứu * Xây dựng quy trình định lượng dựa vào phản ứng AM BB: Vì độ hấp thụ dẫn xuất tạo thành phản ứng AM BB định đến độ đúng, độ xác phương pháp nên cần khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng gồm: pH môi trường phản ứng, nồng độ thuốc thử, thời gian thực phản ứng, phương pháp chiết xuất dẫn chất thu sau phản ứng Để tiến hành khảo sát, chuẩn bị dung dịch sau: - Chuẩn bị dung dịch chuẩn: pha dung dịch chuẩn có nồng độ 250 µg/ml, 200 µg/ml, 150 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 20 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc - Pha dung dịch đệm: pha dung dịch đệm có nồng độ 0,1 M gồm: đệm phosphat H3 PO 4/KH2 PO có pH 2,5; đệm acetat CH3COOH/CH3COONa có pH 3,5, 4,5; 5,5; đệm KH2PO4/Na2HPO4 có pH 7,5, đệm borat NaOH/H3BO3 có pH 9,5; 10,5 AM chuẩn (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Nhật Bản, số lô: AWF0974), thuốc thử BB (Merck, Đức) - Pha dung dịch thuốc thử BB: cân 0,15 g BB vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml dung dịch NaOH 0,05 M Lắc phút tới tan hoàn toàn Thêm nước cất tới vạch định mức, thu dung dịch BB có nồng độ 0,15% Các hóa chất tinh khiết khác: dichloromethan, natri acetat, axít phosphoric, - Khảo sát quy trình định lượng trong: lấy xác ml mẫu thử pha loãng Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị * Nguyên liệu, hóa chất: 75 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 v khong nng nh lng vo bỡnh gạn, thêm ml dung dịch BB 0,15% ml đệm acetat pH 3,5 Lắc phút Thêm 10 ml CH2Cl2, lắc, gạn lấy phần dung dịch CH2Cl2, đem đo lại bước sóng 408 nm Khảo sát lựa chọn điều kiện thích hợp pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch BB, thời gian lắc phản ứng, số lần chiết với CH2Cl2 * Thẩm định quy trình định lượng AM: Thẩm định phương pháp định lượng xây dựng theo hướng dẫn ICH Q2(R1) theo tiêu: độ đặc hiệu, độ đúng, độ xác, đường chuẩn khoảng tuyến tính [6] pH phản ứng tạo phức ảnh hưởng lớn tới độ hấp thụ sản phẩm sau phản ứng Khoảng pH từ 2,5 - 4,5 cho kết độ hấp thụ cao Với pH > 4,5 độ hấp thụ giảm mạnh Ở pH 3,5, độ hấp thụ cao * Khảo sát nồng độ BB: Pha mẫu thuốc thử BB có nồng độ khác từ 0,05 - 0,2% Thực phản ứng với dung dịch AM nồng độ 250 µg/ml xử lý mẫu theo quy trình Bảng 2: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch BB tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3) Số thứ tự Nồng độ BB (%) Độ hấp thụ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 0,050 0,332 ± 0,015 0,075 0,639 ± 0,032 Kết xây dựng quy trình định lượng 0,100 0,945 ± 0,028 0,125 1,257 ± 0,039 0,150 1,299 ± 0,036 0,175 1,310 ± 0,045 0,200 1,297 ± 0,031 * Khảo sát pH dung dịch đệm phản ứng AM BB tới độ hấp thụ: Pha dung dịch đệm có pH khoảng 2,5 - 10,5 Thực phản ứng tạo dẫn xuất với dung dịch AM 250 µg/ml dung dịch BB 0,15% theo quy trình Đo độ hấp thụ mẫu thu Bảng 1: Ảnh hưởng pH dung dịch đệm tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3) Số thứ tự pH Độ hấp thụ 2,5 0,810 ± 0,025 3,5 1,279 ± 0,035 4,5 0,774 ± 0,021 5,5 0,087 ± 0,023 7,5 0,037 ± 0,013 9,5 0,005 ± 0,002 10,5 0,005 ± 0,002 76 Kết khảo sát cho thấy tăng nồng độ BB, độ hấp thụ tăng Từ nồng độ 0,125%, độ hấp thụ tăng không đáng kể, lượng BB đủ dư cho phản ứng tạo dẫn xuất Dựa vào kết bảng 2, lựa chọn nồng độ 0,15% để thực phản ứng tạo dẫn xuất * Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến độ hấp thụ: Thực phản ứng tạo dẫn xuất dung dịch AM 250 BB 0,15% theo quy trình xử lý Lắc kỹ khoảng thời gian khác Sau chiết với CH2Cl2 đo quang bước sóng 408 nm T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Bng 3: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thụ CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ phút Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2 đo độ hấp thụ bước sóng 408 nm Từ quy trình xây dựng được, chúng tơi tiến hành thẩm định phương pháp để định lượng AM Số thứ tự Thời gian Độ hấp thụ phút 1,285 ± 0,025 phút 1,293 ± 0,048 Thẩm định phương pháp định lượng phút 1,304 ± 0,022 * Độ đặc hiệu, chọn lọc: 10 phút 1,296 ± 0,011 Phản ứng tạo dẫn xuất xảy nhanh, giá trị độ hấp thụ đo không khác biệt nhiều khoảng thời gian phản ứng Dựa vào kết đo được, lựa chọn khoảng thời gian thực phản ứng phút Tiến hành pha dung dịch chuẩn AM Cho dung dịch phản ứng chiết xuất theo quy trình a * Khảo sát hiệu suất chiết quy trình định lượng: Thực đo quang phổ mẫu xử lý theo quy trình lựa chọn Chiết lần mẫu đo 10 ml CH2Cl2 Bảng 4: Hiệu suất chiết dẫn xuất tạo thành phản ứng (n = 3) b Số thứ tự Độ hấp thụ Hiệu suất chiết (%) Lần chiết 1,326 ± 0,050 85,23 ± 4,09 Lần chiết 0,182 ± 0,064 11,73 ± 3,88 Lần chiết 0,041 ± 0,021 2,65 ± 1,27 Lần chiết 0,006 ± 0,002 0,39 ± 0,13 Kết cho thấy lần chiết 1, phần lớn dẫn xuất tạo thành chiết khỏi dung dịch phản ứng (85,23%) Từ kết khảo sát trên, chúng tơi lựa chọn quy trình định lượng sau: lấy ml mẫu thử pipet xác vào bình gạn, thêm ml dung dịch BB 0,15% ml đệm acetat pH 3,5, lắc phút Thêm xác 10 ml Hình 1: Phổ hấp thụ mẫu trắng (a) mẫu thử (b) Kết cho thấy phổ hấp thụ mẫu thử sau trình xử lý mẫu có cực đại 408 nm So với mẫu trắng, khơng có đỉnh cực đại bước sóng Do đó, dựa vào bước sóng để định lượng AM mẫu thử 77 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 * ng chun v khong tuyn tớnh: Pha dung dịch AM chuẩn có nồng độ khoảng 20 - 250 µg/ml Tiến hành xử lý mẫu điều kiện chọn Bảng 5: Đường chuẩn khoảng tuyến tính phương pháp định lượng Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ Độ (%) 250 1,296 98,23 200 1,053 98,65 150 0,820 100,66 100 0,570 101,30 50 0,317 102,05 20 0,160 99,11 Kết khảo sát cho thấy: độ hấp thụ (A) nồng độ (C, µg/ml) mẫu đo có tương quan tuyến tính với hệ số tương quan R 0,999 Phương trình đường chuẩn xây dựng: A = 0,005043C + 0,06026 Độ điểm nồng độ đường chuẩn xác định từ 98,23 102,05% Như vậy, phương pháp định lượng có độ tuyến tính cao độ hấp thụ nồng độ từ 20 - 250 µg/ml với độ 98,23 - 102,05% * Độ xác: Xác định cách đo dung dịch chuẩn AM nồng độ 50, 100, 150 µg/ml Mỗi điểm nồng độ làm lặp lại lần Xử lý mẫu theo quy trình lựa chọn Thực phân tích mẫu ngày khác ngày để xác định độ xác ngày (độ lặp lại) độ xác khác ngày (độ xác trung gian) Bảng 6: Độ đúng, độ xác ngày khác ngày Trong ngày Mẫu Nồng độ ( X ± SD) RSD (%) Khác ngày Độ Nồng độ ( X %) ( X ± SD) RSD (%) Độ ( X %) LQC (µg/ml) 50,38 ± 2,58 5,12 100,99 49,90 ± 2,65 5,31 100,01 MQC (µg/ml) 102,73 ± 3,46 3,37 102,96 101,92 ± 3,64 3,57 102,14 HQC (µg/ml) 143,62 ± 4,35 3,03 95,96 144,39 ± 4,98 3,45 96,47 Tại nồng độ (50; 100 150 µg/ml), phương pháp cho độ tốt (96,96 103,96%) độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,45 - 5,31%), chứng tỏ phương pháp định lượng có độ đúng, độ xác, đảm bảo yêu cầu cho phân tích định lượng mẫu thử độ hòa tan nghiên cứu định lng khỏc 78 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 KT LUN TI LIU THAM KHẢO Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng AM dựa phản ứng tạo dẫn xuất amantadin BB Các điều kiện khảo sát cho quy trình định lượng là: lấy ml mẫu thử pipet xác vào bình gạn, thêm ml dung dịch BB 0,15% ml đệm acetat pH 3,5 Lắc phút Thêm xác 10 ml CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ phút Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2, đem đo độ hấp thụ bước sóng 408 nm IA Darwish et al Simple and sensitive spectrophotometric methods for determination of amantadine hydrochloride Journal of Applied Spectroscopy 2006, 73 (6), pp.792-797 Phương pháp định lượng thẩm định có độ đặc hiệu, độ độ xác cao Độ hấp thụ (A) nồng độ (C) mẫu đo có tương quan tuyến tính khoảng nồng độ 20 - 250 µg/ml với hệ số tương quan R 0,999, phương trình đường chuẩn xây dựng: A = 0,005043C + 0,06026 Kết cho thấy phương pháp xây dựng thẩm định phù hợp cho định lượng AM mẫu thử độ hòa tan nghiên cứu định lượng khác Y Higash et al Simultaneous liquid chromatographic assay of amantadine and its four related compounds in phosphate-buffered saline using 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole as a fluorescent derivatization reagent Biomedical Chromatography 2006, 20 (5), pp.423-428 HF Askal et al Quantitative thin-layer chromatographic method for determination of amantadine hydrochloride International Journal of Biomedical Science 2008, (2), pp.155-160 HJ Leis, G Fauler, W Windischhofer Quantitative analysis of memantine in human plasma by gas chromatography/negative ion chemical ionization/mass spectrometry Journal of Mass Spectrometry, 2002, 37 (5), pp.477-480 MA Martin, B Del Castillo 2,3-diphenylquinolizinium bromide as a fluorescent derivatization reagent for amines Analytica Chimica Acta 1991, 245 (2), pp.217-223 ICH Q2(R1) International Conference on Harmonisation Validation of analytical procedures Methodology 2005 79 ... Việc định lượng thuốc gặp nhiều khó khăn amantadin khơng hấp thụ tia UV, khơng có khả phát xạ huỳnh quang Trên giới, có số nghiên cứu phương pháp định lượng AM đo quang phổ hấp thụ, quang phổ. .. bromid [5] Nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết quả: Nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp định lượng AM phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả hấp thụ ánh... hydroxyd * Thiết bị nghiên cứu: - Máy đo quang phổ hấp thụ UV-VIS (Biochrom Ltd, Anh) - Máy đo pH (Mettler - Toledo group, Thụy Sỹ) Phương pháp nghiên cứu * Xây dựng quy trình định lượng dựa vào phản