Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bài viết xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược.

tạp chí y - dợc học quân số 9-2019 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NIFEDIPIN TRONG MẪU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC DƯỢC CHẤT - TÁ DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Trần Quang Trung1; Nguyễn Thanh Hải2; Trịnh Văn Lẩu3; Trương Ngọc Hiển1 TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược Phương pháp: khảo sát điều kiện sắc ký: detector PDA, bước sóng phân tích, cột sắc ký thành phần pha động, tỷ lệ pha động Thẩm định tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ xác trung gian, độ đúng, khoảng xác định, giới hạn phát giới hạn định lượng Kết quả: xác định điều kiện sắc ký như: bước sóng, cột, pha động Phương pháp thẩm định đạt tiêu chí theo quy định Kết luận: xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược, làm sở cho nghiên cứu tiền công thức dạng thuốc chứa nifedipin * Từ khóa: Nifedipin; Sắc ký lỏng hiệu cao; Tương tác thuốc - tá dược ĐẶT VẤN ĐỀ Nifedipin thuốc chẹn kênh canxi thuộc nhóm dihydropyridin, sử dụng rộng rãi điều trị chứng đau thắt ngực, tăng huyết áp rối loạn mạch máu khác [2, 3] Tuy nhiên, hoạt chất nifedipin tương đối ổn định [4] tương tác làm giảm hàm lượng phối hợp với tá dược bào chế viên nén Vì vậy, để góp phần nghiên cứu xác định tương tác dược chất nifedipin tá dược nhằm lựa chọn tá dược phù hợp cho trình khảo sát xây dựng cơng thức viên nén nifedipin giải phóng kéo dài theo chế bơm thẩm thấu kéo-đẩy, tiến hành xây dựng thẩm định phương pháp định lượng nifedipin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược tạo cách phối hợp nifedipin với tá dược dự kiến sử dụng Học viện Quân y Đại học Quốc Gia Hà Nội Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung (tqt201316@gmail.com) Ngày nhận bài: 05/10/2019; Ngày phản biện đánh giá báo: 11/11/2019 Ngày báo c ng: 21/11/2019 TạP CHí Y - HọC QUÂN Sù Sè 9-2019 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị * Nguyên liệu, hóa chất: - Nifedipin chuẩn: hàm lượng 99,82% (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp) - Nifedipin Công ty Baoji Guokang Bio-Technology Co., Ltd (Trung Quốc) cung cấp (đạt tiêu chuẩn USP 38) - Các loại PEO: N10, N80, N750, 301, 303, Coagulant Công ty Colorcon Asia Pacific Pte., Ltd cung cấp - Lactose monohydrat, natri clorid, magnesi stearat, PVP K30, oxýt sắt đỏ có nguồn gốc từ Trung Quốc đạt tiêu chuẩn USP 38 - Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn HPLC - Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho HPLC tinh khiết phân tích * Thiết bị: Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D; detector 2998 dual α Absorbance (Mỹ); cột Phenomenex LUNA, Xbridge (RP-C18, µm, 250 x 4,6 mm); máy quang phổ EMC-61PC-UV Spectrophotometer, Emclab (Đức); máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ); cân phân tích Mettler Toledo có độ xác 0,1 mg (Thụy Sỹ) dụng cụ thí nghiệm khác đạt tiêu chuẩn phân tích Phương pháp nghiên cứu * Xây dựng phương pháp: - Pha dung dịch chuẩn: + Dung dịch chuẩn gốc: cân xác 50,0 mg nifedipin chuẩn cho vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 70 ml pha động methanol/nước (65/35), lắc siêu âm cho tan hoàn toàn 30 phút, để nguội nhiệt độ phòng, sau thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc thu dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml + Dung dịch chuẩn: lấy xác ml dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml cho vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc để dung dịch chuẩn có nồng độ nifedipin khoảng 150 µg/ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký - Pha mẫu thử: cân xác lượng hỗn hợp bột nifedipin tá dược (theo tỷ lệ 1/1) tương đương với khoảng 50,0 mg nifedipin cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml pha động methanol/nước (65/35), lắc siêu âm 30 phút, để nguội nhiệt độ phòng, sau thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lấy thể tích khoảng 10 ml dung dịch bình định mức, đem ly tâm 4.000 vòng/phút 20 phút Lấy xác ml dung dịch ly tâm, cho vào bình định mức 10 ml thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký - Điều kiện sắc ký: Sử dụng dung dịch chuẩn nifedipin nồng độ 150 µg/ml để khảo sát Quét phổ hấp thụ dung dịch khoảng 200 - 500 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại Khảo sát điều kiện sắc ký khác như: pha tĩnh: cột silica gel pha đảo C18 Phenomenex LUNA, Xbridge; pha động: hỗn hợp dung môi MeOH, ACN, H2O với tỷ lệ khác Duy trỡ tc tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 9-2019 dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 25 µl Xác định điều kiện sắc ký cho píc đạt độ đối xứng tốt, tỷ lệ diện tích píc nồng độ chiều cao píc nồng độ lớn * Thẩm định phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược: Phương pháp đánh giá theo hướng dẫn ICH thông tư 32/2018 Bộ Y tế [1, 5], dựa khảo sát tiêu sau: độ đặc hiệu, độ tương thích hệ thống, tuyến tính, độ lặp lại, độ xác trung gian, độ đúng, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược * Bước sóng phân tích: Để xác định bước sóng thích hợp phân tích nifedipin, tiến hành ghi phổ UV mẫu nifedipin chuẩn 150 µg/ml máy quang phổ EMC-61PC-UV Spectrophotometer, Emclab Quét phổ tử ngoại dung dịch với bước sóng 200 - 500 nm, cuvet thạch anh dày cm Mẫu trắng hỗn hợp dung mơi pha động methanol/nước (65/35) Hình 1: Phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch nifedipin chuẩn 150 µg/ml Phổ đồ UV-Vis cho thấy cực đại hấp thụ nifedipin 237,2 nm 370 nm Từ đó, chọn bước sóng 237 nm để khảo sát phương pháp định lượng nifedipin HPLC * Khảo sát hiệu lực cột phân tích: Tiến hành phân tích mẫu loại cột silica gel pha đảo, phenomenex LUNA Xbridge T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019 Bảng 1: Kết khảo sát hiệu lực cột STT Tên cột Kết Hệ số bất đối xứng (AF) Số đĩa lý thuyết (N) Thời gian lưu (phút) Phenomenex LUNA 1,120 10600 8,965 Xbridge 1,049 19385 13,108 Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin sử dụng cột Xbridge Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin sử dụng cột Phenomenex LUNA Dựa vào kết hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, thời gian lưu sắc ký đồ nhận thấy cột cho píc khơng bị kéo đi, AF nằm giới hạn cho phép (0,8 ≤ AF ≤ 1,5), nhiên cột Phenomenex LUNA cho số đĩa lý thuyết nhỏ hơn, thời gian lưu ngắn nhiều so với cột Xbridge (13,108 phút), nên lựa chọn cột Phenomenex LUNA cho phân tích định lượng nifedipin * Khảo sát thành phần pha động: Dựa tài liệu tham khảo hóa chất dung mơi sẵn có phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát hệ pha động khác gồm: - Hệ 1: MeOH:nước (65/35, v/v) - Hệ 2: ACN:nước (65/35, v/v) - Hệ 3: ACN:methanol:nước (25/25/50, v/v) tạp chí y - dợc học quân sù sè 9-2019 Bảng 2: Kết khảo sát thành phần pha động Hệ pha động Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối xứng (AF) MeOH:nước (65/35, v/v) 8,965 1,120 ACN:nước (65/35, v/v) 5,187 1,261 ACN:methanol:nước (25/25/50, v/v) 1,050 1,040 Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động MeOH:nước (65/35, v/v) Hình 5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động ACN:nước (65/35, v/v) Hình 6: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động ACN:MeOH:nc (25/25/50, v/v) TạP CHí Y - HọC QUÂN Sù Sè 9-2019 Hệ dung môi ACN:nước (65/35, v/v) cho píc khơng cân đối hệ dung mơi lại với AF = 1,261, đường không ổn định hệ MeOH:nước (65/35, v/v) Hệ dung môi ACN:MeOH:nước (25/25/50, v/v) cho píc gọn, thời gian lưu ngắn (1,050 phút), khơng đảm bảo cho q trình tách Trong đó, hệ dung mơi MeOH: nước (65/35, v/v) cho đường ổn định, píc cân xứng, sắc nét với AF = 1,126, khả tách tốt * Khảo sát tỷ lệ pha động: Tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động MeOH:nước tỷ lệ: 50/50, 65/35, 60/40, 70/30, 80/20 Bảng 3: Kết khảo sát tỷ lệ thành phần pha động MeOH:nước MeOH:nước (v/v) Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (µV.s) Hệ số bất đối xứng (AF) 50/50 16,328 2500234 1,059 65/35 8,981 12823315 1,127 60/40 13,315 12833722 1,091 70/30 6,601 12894973 1,169 80/20 4,261 12810176 1,258 Hình 7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung mơi MeOH:nước (50:50, v/v) Hình 8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung mơi MeOH:nước (65:35, v/v) 10 t¹p chÝ y - dợc học quân số 9-2019 Hỡnh 9: Sc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (60:40, v/v) Hình 10: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung mơi MeOH:nước (70:30, v/v) Hình 11: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (80:20, v/v) Từ kết khảo sát nhận thấy tỷ lệ dung môi MeOH:nước (v/v) 65:35 cho thời gian lưu phù hợp, píc gọn, cân đối Kết quả: lựa chọn hệ dung môi MeOH:nước với tỷ lệ 65:35 (v/v) để phân tích định lượng nifedipin 11 T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019 Thẩm định phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược * Tính tương thích hệ thống: Tiêm lần mẫu nifedipin chuẩn 150 µg/ml vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Bảng 4: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Thời gian lưu (phút) Diện tích píc (µV.s) Hệ số bất đối xứng (AF) Số đĩa lý thuyết (N) 8,661 12287964 1,138 10873 8,718 12303091 1,137 10833 8,768 12318713 1,136 10814 8,794 12270688 1,136 10809 8,803 12260808 1,135 10795 8,795 12271121 1,136 10789 TBC 8,757 12285398 1,136 10819 0,6 0,2 0,1 0,3 Mẫu RSD (%) Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt Giá trị RSD (%) thời gian lưu, diện tích píc, hệ số bất đối xứng píc số đĩa lý thuyết nifedipin < 2,0% * Tính đặc hiệu: Nguyên tắc: chuẩn bị mẫu: mẫu trắng (hỗn hợp bột tá dược), mẫu chuẩn, mẫu thử Xử lý mẫu tiến hành sắc ký với điều kiện lựa chọn Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng hỗn hp bt tỏ dc 12 tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 9-2019 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu nifedipin chuẩn nồng độ 150 µg/ml Hình 14: Sắc ký đồ mẫu thử nifedipin nồng độ 150 µg/ml Píc mẫu chuẩn cân đối, sắc nét, có thời gian lưu 8,874 phút Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất píc khoảng thời gian - 10 phút Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn có píc thời gian lưu xấp xỉ 8,8 phút Từ đưa kết luận phương pháp có tính đặc hiệu cao * Khoảng tuyến tính: Pha mẫu nifedipin chuẩn, nồng độ từ 30 - 240 µg/ml, nồng độ phân tích lần, từ diện tích píc thu được, xây dựng phụ thuộc diện tích píc với nồng độ nifedipin Bảng 5: Kết xây dựng đường chuẩn (n = 3) Nồng độ (µ µg/ml) Diện tích píc (µV.s) Mẫu Nồng độ (µ µg/ml) Diện tích píc (µV.s) 30 2233484,5 ± 12920,5 150 12282186,4 ± 5241,4 60 4757893,5 ± 3141,6 180 14819683,6 ± 17694,6 90 7274879,5 ± 8018,9 210 17343338,7 ± 35401,3 120 9786676,6 ± 12100,6 240 19868707,9 ± 28642 Mẫu Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 83930x - 284700 Hệ số tương quan: R = 13 T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019 Kết khảo sát cho thấy giá trị r = chứng tỏ khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính nồng độ nifedipin với diện tích píc thu Khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược * Độ xác: - Độ lặp lại: Tiêm mẫu thử chuẩn bị theo quy trình tiêm vào hệ thống HPLC (do kiểm nghiệm viên làm) Tính hàm lượng phương pháp so sánh với chuẩn xác định độ lặp lại cách tính độ lệch chuẩn tương đối giá trị lần định lượng Bảng 6: Kết khảo sát độ lặp lại mẫu thử STT Khối lượng cân (g) Diện tích píc (µV.s) Hàm lượng (%) 0,6450 13239283 100,43 0,6560 13373746 99,75 0,6540 13291701 99,44 0,6528 13280630 99,54 0,6545 13349152 99,79 0,6520 13277960 99,64 13302079 RSD = 0,53 Trung bình Với điều kiện sắc ký chọn, độ lặp lại kết định lượng ngày phân tích cho RSD đạt 0,53% nhỏ 2% Như vậy, phương pháp chọn đảm bảo độ xác - Độ xác trung gian: Tiêm mẫu thử chuẩn bị (do kiểm nghiệm viên khác thực hiện) (kiểm nghiệm viên hai) theo quy trình tiêm vào hệ thống HPLC Xác định độ xác cách tính độ lệch chuẩn tương đối giá trị lần định lượng Bảng 7: Kết khảo sát độ xác trung gian STT Khối lượng cân (g) Diện tích píc (µV.s) Hàm lượng (%) 0,6547 13366813 99,77 0,6565 13424439 99,92 0,6555 13451567 100,28 0,6534 13354395 99,87 0,6550 13420425 100,13 0,6538 13330146 99,63 Trung bình RSD = 0,24% Với điều kiện sắc ký chọn, độ lặp lại kết định lượng kiểm nghiệm viên phân tích cho RSD đạt 0,24% 0,53% nhỏ 2% hai kiểm nghiệm viên 0,3% nhỏ 3% Như vậy, phương pháp chọn đảm bảo độ xác 14 t¹p chí y - dợc học quân số 9-2019 * Độ đúng: Xác định tỷ lệ thu hồi (%) cách tính tốn lượng chất chuẩn chất cần phân phân tích thêm vào mẫu giả dược Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ (80%, 100%, 120%) Tại mức nồng độ, tiến hành mẫu độc lập điều kiện khảo sát Bảng 8: Kết khảo sát độ Mức nồng độ 80% 100% 120% Lượng chuẩn thêm vào (mg) Spíc thêm chuẩn (µV.s) Lượng tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 41,8 10211936 41,5 99,28 41,4 10140050 41,2 99,52 42,0 10212840 41,5 98,81 51,9 12564631 51,1 98,46 51,3 12521695 50,9 99,22 51,7 12558812 51,1 98,84 60,5 14916732 60,7 100,33 61,2 14985984 60,9 99,51 61,8 15066105 61,3 99,19 Kết Trung bình = 99,2 RSD = 0,36% Trung bình = 98,84 RSD = 0,38% Trung bình = 99,68 RSD = 0,59% Lượng chất chuẩn thu hồi mức nồng độ khác nằm khoảng 98 - 102% so với lượng chất chuẩn thêm vào, với RSD tỷ lệ thu hồi mức nồng độ < 2%, chứng tỏ phương pháp sử dụng có độ cao * Khoảng xác định: Kết độ cho thấy nồng độ nifedipin 80 - 120% so với nồng độ định lượng có độ độ lặp lại tốt Như vậy, khoảng xác định phương pháp giới hạn 120 - 180 µg/ml * Giới hạn phát giới hạn định lượng: Bằng phương pháp dựa vào tỷ số tín hiệu (S) nhiễu (N) xác định giới hạn phát phương pháp LOD = 0,0375 µg/ml giới hạn định lượng phương pháp LOQ = 0,105 µg/ml KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược phương pháp HPLC điều kiện sau: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, cột Phenomenex LUNA (RP-C18, µm, 100A0, 250 x 4,6 mm); detector: PDA 237 nm; pha động: MeOH:nước, tỷ lệ 65/35, v/v; thể tích tiêm 25 µl; tốc độ dòng ml/phút; nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng 15 T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019 Phương pháp thẩm định tiêu đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích theo quy định ICH thông tư 32/2018 Bộ Y tế Phương pháp áp dụng để định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược TÀI LIỆU THAM KHẢO Thông tư 32/2018/TT-BYT Quy định việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc 16 Uday Y.A et al Estimation of nifedipine by reverse phase high performance liquid chromatography tablet dosage form IJPLS 2011, pp.610-612 Sweetman S.C et al Martindale Pharmaceutical Press 2014, pp.1447-1455 Klaus Florey et al Analytical profiles of drug substances Academic Press InC 1989, Vol 18, pp.245-253 ICH Harmonised Tripartite Guideline Guidelines for validation of analytical procedures: Q2 (R1) Text and Methodology 2005  ... giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược * Bước sóng phân tích: Để xác định bước... tích định lượng nifedipin 11 T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2 019 Thẩm định phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược * Tính tương thích hệ thống: Tiêm lần mẫu nifedipin. .. phương pháp định lượng nifedipin mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược: Phương pháp đánh giá theo hướng dẫn ICH thông tư 32/2018 Bộ Y tế [1, 5], dựa khảo sát tiêu sau: độ đặc hiệu, độ tương