Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN MAI ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DỊ HUỲNH QUANG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA 2013 - 2018 HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC  TRẦN MAI ANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLURBIPROFEN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DỊ HUỲNH QUANG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA 2013 - 2018 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin cảm ơn thầy Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, Phòng ban Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội toàn thể thầy cô giáo Khoa cho kiến thức quý báu suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện Khoa Chúng xin cảm ơn Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.17.01) Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ tơi q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, tháng 05 năm 2018 Sinh viên Trần Mai Anh CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High – performance liquid chromatography) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) DAD Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector) FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) ICH Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) EMA Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency) BP Dược điển Anh Quốc (British Pharmacopoeia) EP Dược điển châu Âu (European pharmacopoeia) USP – NF Dược điển Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (United States Pharmacopoeia – National Formulary) Mã Giải phẫu – Điều trị – Hoá học (Anatomical – Therapeutic – ATC Chemical Code) NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm khơng steroid (Non–steroidal Anti– inflammatory Drug) Liều gây chết 50% sinh vật thí nghiệm (Lethal dose 50%) LD50 ACN Acetonitril RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung flurbiprofen 1.1.1 Cấu trúc, tính chất 1.1.2 Tác dụng dược lý 1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang 1.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang .8 1.3 Các phương pháp định lượng flurbiprofen 10 1.3.1 Phương pháp chuẩn độ 10 1.3.2 Phương pháp quang phổ phân tử 10 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 11 1.3.4 Phương pháp sắc ký khí 15 1.4 Thẩm định quy trình phân tích 16 1.4.1 Tính đặc hiệu 17 1.4.2 Độ xác 18 1.4.3 Độ 19 1.4.4 Tính tuyến tính 20 1.4.5 Miền giá trị 20 1.4.6 Giới hạn phát 21 1.4.7 Giới hạn định lượng 22 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 23 2.1.1 Dung mơi, hóa chất 23 2.1.2 Trang thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 24 2.2.2 Thẩm định quy trình phân tích 29 2.2.3 Ứng dụng định lượng flurbiprofen viên nén 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 31 3.1.1 Cài đặt thông số ban đầu 31 3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch khảo sát 31 3.1.3 Xác định bước sóng kích thích bước sóng phát xạ tối ưu 32 3.2 Thẩm định quy trình phân tích 35 3.2.1 Tính đặc hiệu 35 3.2.2 Tính tuyến tính miền giá trị 37 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng 38 3.2.4 Độ 39 3.2.5 Độ xác 39 3.3 Ứng dụng định lượng flurbiprofen viên nén 42 3.4 Bàn luận 42 CHƯƠNG KẾT LUẬN 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Công bố kết nghiên cứu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng Tên bảng Đặc điểm số đầu dò Số trang 11 Bảng Điều kiện chạy nguồn hố ESI 17 Bảng Chương trình pha động gradient 17 Bảng Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa lớn ống quang tử 30 Bảng Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch chuẩn diện tích pic flurbiprofen 41 Bảng Kết xác định tỷ lệ phục hồi phương pháp 43 Bảng Kết xác định độ lặp lại phương pháp 44 Bảng Kết xác định độ xác trung gian phương pháp 45 Bảng So sánh kết độ xác phương pháp định lượng 45 Bảng 10 So sánh thơng số thẩm định quy trình định lượng flurbiprofen đầu dò DAD đầu dò FLD 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Số trang Hình Cơng thức cấu tạo flurbiprofen Hình Sơ đồ hệ thống HPLC Hình Minh hoạ thơng số sắc ký Hình Ngun tắc hoạt động đầu dò huỳnh quang 13 Hình Thang độ nhạy đầu dò FLD 29 Hình Sắc ký đồ dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 400 ng/ml 35 Hình Sắc ký đồ dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ 100 ng/ml 36 Hình Sơ khảo sát bước sóng kích thích bước sóng phát xạ tối ưu 37 Hình Khảo sát bước sóng phát xạ cực đại 37 Hình 10 Khảo sát bước sóng kích thích cực đại 38 Hình 11 Sắc ký đồ điều kiện tối ưu hóa với đầu dò FLD 38 Hình 12 Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) độ trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c) 40 Hình 13 Sắc ký đồ mẫu phân huỷ tác động tác nhân oxi hóa H2O2 với đầu dò FLD 41 Hình 14 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ flurbiprofen diện tích pic 42 MỞ ĐẦU Flurbiprofen dẫn xuất axit propionic thuộc nhóm thuốc chống viêm khơng steroid (NSAIDs) có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt Khi sử dụng đường uống, flurbiprofen thể hiệu điều trị công bệnh viêm gan cấp tính, viêm xương khớp cấp tính, đau thắt lưng [10] Viên nén gel dùng chứa flurbiprofen có tác dụng điều trị triệu chứng bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp viêm cột sống dính khớp [10] Thuốc sử dụng giảm đau trường hợp đau bụng kinh, đau nhẹ đến trung bình kèm với viêm (viêm bao hoạt dịch, viêm gân, chấn thương mô mềm) [13] Bên cạnh chống viêm, hạ sốt, giảm đau, flurbiprofen cho thấy tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu mạnh giảm nguy trì hồn xuất bện h Alzheimer sử dụng lâu dài [17, 23, 25, 32] Thuốc nhỏ mắt flurbiprofen sử dụng chỗ trước phẫu thuật nhãn khoa nhằm ngăn ngừa làm giảm co đồng tử lúc mổ [18] Trên giới, đặc biệt nước thuộc châu Âu Bắc Mỹ, flurbiprofen sử dụng rộng rãi nhiều tên thương mại khác Antadys, Amedolfen, Flufen, Maprofen, Ocufen, Zentofen,… Tuy nhiên thuốc chưa phổ biến Việt Nam, dược điển Việt Nam IV khơng có chun luận Flurbiprofen Phát triển nghiên cứu flurbiprofen hướng Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm lựa chọn thuốc điều trị, với thuốc có giá trị ứng dụng lâm sàng cao tác dụng đa dạng flurbiprofen Một tính chất đáng ý flurbiprofen tan nước, việc bào chế hệ thuốc dẫn nano có cấu trúc lipid nanolipid rắn, nhũ tương nano,… hướng nghiên cứu quan tâm giới [10, 18, 25, 35] Trong q trình tìm hiểu chúng tơi, thời điểm tại, giới chưa có nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để định lượng flurbiprofen dược phẩm tinh khiết dạng bào chế công bố Số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC ghép đầu dò huỳnh quang để xác định flurbiprofen dịch sinh học không nhiều Điều cho thấy tính cần thiết việc xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang Trong nghiên cứu trước, tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen viên nén bao phim 100mg phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò diode–array [2] Mục tiêu đề tài tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen viên nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang theo hướng dẫn Cơ quan quản lý thuốc châu Âu (European Medicines Agency – EMA) [8] Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) [33] Hình Phổ hấp thụ UV – VIS flurbiprofen khoảng 190 – 800 nm Trong trình khảo sát, sử dụng pha tĩnh silica gel C18 pha động hỗn hợp ACN : H2O với tỷ lệ tăng dần từ 60 : 40 đến 80 : 20, thời gian lưu flurbiprofen giảm dần từ 5,13 xuống 2,65 phút Tuy nhiên, pic có hình dạng khơng cân xứng với hệ số bất đối As = 0,69 – 2,02 Việc thêm 2,5% CH3COOH vào pha động có tác dụng chuyển flurbiprofen dạng khơng ion hóa, tình trạng kéo pic cải thiện khơng hồn tồn hẳn Thêm CH3COOH vào pha động đồng thời thay pha tĩnh silica gel C8 giúp giải tình trạng Qua khảo sát xác định thể tích tiêm mẫu cho tỷ lệ diện tích pic nồng độ chiều cao pic nồng độ lớn 10 μl Từ thực nghiệm chọn điều kiện sắc ký tối ưu sau: Pha tĩnh silica gel C8 μm, 120 Å cột 4,6 mm x 150 mm, pha động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), thể tích tiêm mẫu 10 μl, tốc độ dòng ml/phút, đầu dò ghi nhận tín hiệu bước sóng 247 nm, thời gian sắc ký phút Flurbiprofen có thời gian lưu 3,73 phút, pic cân xứng (As = 1,08), số đĩa lý thuyết 3491 Sắc ký đồ thể hình Hình Sắc ký đồ flurbiprofen điều kiện tối ưu 3.2 Tính đặc hiệu Khi xử lý mẫu với acid, base, chất oxy hoá, nhiệt độ ánh sáng điều kiện mô tả, flurbiprofen bị phân huỷ tác động tác nhân oxy hóa H2O2 Trên sắc ký đồ xuất thêm pic có thời gian lưu 1,68 phút, tách hoàn toàn khỏi pic flurbiprofen Độ phân giải hai pic 10,75 Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết thông qua trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu cho thấy hai pic tinh khiết với độ tương xứng đạt 999 (hình 4) Phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt thời gian lưu flurbiprofen mẫu xử lý mẫu chuẩn (t = 0,23 < t0,05(28) = 2,048) Các kết cho phép khẳng định tính đặc hiệu phương pháp phân tích Hình Sắc ký đồ mẫu xử lý với hydro peroxid (a) độ trùng phổ hấp thụ theo thời gian lưu pic: sản phẩm phân hủy (b), flurbiprofen (c) 3.3 Tính tuyến tính miền giá trị Phân tích mối tương quan diện tích pic y (mAU.min) nồng độ dung dịch flurbiprofen x (μg/ml) khoảng – 20 μg/ml thu phương trình y = 0,680x + 0,022 với hệ số xác định R2 = 0,9993, độ lệch chuẩn S = 0,00885 (bảng 1) Bảng Phân tích hồi quy tương quan diện tích pic nồng độ flurbiprofen STT Nồng độ flurbiprofen x (µg/ml) Diện tích pic y (mAU.min) 2,00 1,38 4,00 2,73 8,00 5,53 12,00 8,24 16,00 10,68 20,00 13,76 – 20 µg/ml Khoảng định lượng Phương trình hồi quy y = 0,680x + 0,022 Độ lệch chuẩn S (se slope) 0,00885 R2 0,9993 Qua trắc nghiệm Fischer, phương trình chứng minh có tính tương thích (F = 5907,328 > F0,05 = 10,13) Qua trắc nghiệm Student, hệ số a = 0,68 có ý nghĩa mặt thống kê (t = 76,86 > t0,05 = 2,132), hệ số b = 0,022 khơng có ý nghĩa mặt thống kê (t = 0,85 < t0,05 = 2,132) Từ đó, phương trình hồi quy đưa dạng y = 0,680x Như vậy, khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ flurbiprofen Độ lệch giá trị thực nghiệm so với giá trị hồi quy gần với chứng tỏ khoảng tin cậy phương trình hồi quy hẹp 3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng Bằng phương pháp pha loãng xác định giới hạn phát phương pháp LOD = 0,05 μg/ml giới hạn định lượng phương pháp LOQ = 0,15 μg/ml 3.5 Độ Tỷ lệ phục hồi dãy dung dịch flurbiprofen có nồng độ khoảng tuyến tính phân tích trình bày bảng Bảng Tỷ lệ phục hồi dãy dung dịch flurbiprofen chuẩn khoảng tuyến tính Nồng độ dung dịch Nồng độ thực Tỷ lệ phục hồi chuẩn nghiệm (µg/ml) STT (%) (µg/ml) 2,00 2,03 101,47 4,00 4,01 100,37 8,00 8,13 101,65 12,00 12,12 100,98 16,00 15,71 98,16 20,00 20,24 101,18 Kết thu cho thấy phương pháp đạt yêu cầu độ với giá trị độ phục hồi nằm khoảng ≤ 100 ± 2% 3.6 Độ xác Độ lặp lại Khi tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn có nồng độ 20, 8, μg/ml, dung dịch lần ngày, giá trị RSD lần đo nhỏ 1,71% (bảng 3) Bảng Độ lệch chuẩn tương đối lần đo ngày Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml) Diện tích pic (mAU.min) Diện tích pic trung bình (mAU.min) SD RSD (%) 1,35 0,02 1,71 5,53 0,03 0,46 14,00 0,22 1,57 1,38 2,00 1,34 1,34 5,55 8,00 5,53 5,50 13,78 20,00 14,22 13,99 Độ xác trung gian Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn có nồng độ 20, 8, μg/ml, ngày khác nhau, giá trị RSD ngày nhỏ 2,34% (bảng 4) Bảng Độ lệch chuẩn lần đo ngày khác Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml) Ngày Diện tích pic (mAU.min) 1,34 1,40 1,39 5,53 5,46 5,65 14,00 2,00 8,00 20,00 13,72 13,94 Diện tích pic trung bình (mAU.min) SD RSD (%) 1,38 0,03 2,34 5,55 0,10 1,71 13,89 0,15 1,06 Bảng thể độ xác số phương pháp định lượng flurbiprofen báo cáo đo độ hấp thụ quang [11], đo độ phát xạ huỳnh quang [11], sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần liên tiếp (LC– MS/MS) [13], sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ (GC–MS) [17] So với phương pháp này, giá trị RSD phương pháp xây dựng thấp hơn, điều cho phép khẳng định phương pháp có độ xác cao Bảng So sánh độ xác số phương pháp định lượng flurbiprofen Tên phương pháp Độ lặp lại Độ xác trung gian Đo độ hấp thu quang RSD ≤ 3,10 % RSD ≤ 3,20 % Đo độ phát xạ huỷnh quang RSD ≤ 2,05 % RSD ≤ 3,80 % LC–MS/MS RSD ≤ 2,20 % RSD ≤ 3,40 % GC–MS RSD ≤ 2,65 % RSD ≤ 3,64 % Phương pháp xây dựng RSD ≤ 1,71 % RSD ≤ 2,34 % 3.7 Định lượng flurbiprofen viên nén bao phim 100 mg Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng flurbiprofen viên nén bao phim Antadys 100 mg (Theramex, Pháp) USP 40 – NF 35 quy định viên nén flurbiprofen phải chứa 90 – 110% so với hàm lượng ghi nhãn [12] Theo tài liệu này, flurbiprofen viên nén chiết pha động sắc ký hỗn hợp ACN đệm phosphate pH 3,0 (43: 57) Sử dụng 25 ml pha động cho lượng bột thuốc tương đương 75 mg flurbiprofen, sau pha loãng phần dung dịch thu 20 lần pha động tiến hành sắc ký Trong nghiên cứu này, sử dụng tỷ lệ dung môi chiết cao gấp lần: 50 ml pha động cho lượng bột thuốc chứa tương đương 50 mg flurbiprofen Sau pha lỗng 1ml dung dịch 100 lần với pha động để thu dung dịch có nồng độ lý thuyết 10 μg/ml Tiến hành sắc ký lần, lấy diện tích pic trung bình để tính nồng độ C μg/ml dung dịch định lượng Lặp lại thí nghiệm lần, kết thể bảng Bảng Kết định lượng flurbiprofen viên nén bao phim Antadys 100 mg (Theramex, Pháp; lot: 2M653 05 2015) Lần Diện tích pic trung bình Nồng độ C Hàm lượng (%) (mAU.min) (µg/ml) 6,33 9,31 93,1 6,48 9,53 95,3 6,37 9,37 93,7 Như hàm lương flurbiprofen chế phẩm 94,0% hàm lượng ghi nhãn, đạt tiêu chuẩn USP 40 – NF 35 Kết luận Trong nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen dạng bào chế thông dụng viên nén bao phim 100 mg theo hướng dẫn ICH EMA Phương pháp HPLC – DAD sử dụng pha tĩnh cột silica gel C8 μm, 120 Å, kích thước 4,6×150 mm, pha động hỗn hợp ACN : H2O: CH3COOH với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v), tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl, thời gian sắc ký phút, bước sóng phát 247 nm Bằng cách xử lý mẫu với nhiều yếu tố khác để tạo sản phẩm phân hủy chứng minh tính đặc hiệu phương pháp Trong khoảng nồng độ – 20 μg/ml, có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ dung dịch theo phương trình y = 0,680x với hệ số xác định R2 = 0,9993 Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu xác định LOD LOQ 0,05 0,15 μg/ml So sánh với số nghiên cứu định lượng flurbiprofen khác công bố cho thấy phương pháp xây dựng có độ độ xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối độ lặp lại ≤ 1,71% độ lệch chuẩn tương đối độ xác trung gian ≤ 2,34% Nghiên cứu ứng dụng công tác kiểm nghiệm, đảm bảo chất lượng thuốc đồng thời tiền đề quan trọng để phát triển nghiên cứu định lượng flurbiprofen dạng bào chế khác, bào chế, đánh giá tương đương sinh học, dược động học thuốc giảm đau kháng viêm chứa flurbiprofen Lời cảm ơn Các tác giả xin cảm ơn Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phí cho nghiên cứu (đề tài mã số CS.17.01) Tài liệu tham khảo [1] Calapai G, Imbesi S, Cafeo V, Ventura SE, Minciullo PL, et al Fatal hypersensitivity reaction to an oral spray of flurbiprofen: a case report J Clin Pharm Ther 2013; 38(4): 337-338 [2] Geerts H Drug evaluation: (R)-flurbiprofen—an enantiomer of flurbiprofen for the treatment of Alzheimer's disease Idrugs 2007; 10 (2): 121-133 [3] Mironov GG, Logie J, Okhonin V, Renaud JB, Mayer PM, Berezovski MV Comparative study of three methods for affinity measurements: capillary electrophoresis coupled with UV detection and mass spectrometry, and direct infusion mass spectrometry J Am Soc Mass Spectrom 2012; 23 (7): 1232120 [4] Zhou SF, Zhou ZW, Yang LP, Cai JP Substrates, inducers, inhibitors and structure-activity relationships of human Cytochrome P450 2C9 and implications in drug development Curr Med Chem 2009; 16 (27): 34803675 [5] Drugbank http://www.drugbank.ca Flurbiprofen Consulted jun 20th 2017 [6] Bhaskar K, Anbu J, Ravichandiran V, Venkateswarlu V, Rao YM Lipid nanoparticles for transdermal delivery of flurbiprofen: formulation, in vitro, ex vivo and in vivo studies Lipids in health and disease 2009; 8: 6-21 [7] Gonzalez-Mira E, Egea MA, Souto EB, Calpena AC, Garcia ML Optimizing flurbiprofen-loaded NLC by central composite factorial design for ocular delivery Nanotechnology 2010; 22 (4): 045101 [8] Meister S, Zlatev I, Stab J, Docter D, Baches S, et al Nanoparticulate flurbiprofen reduces amyloid-β 42 generation in an in vitro blood-brain barrier model Alzheimer's research & therapy 2013: (6): 51-63 [9] Zhao X, Li W, Luo Q, Zhang X Enhanced bioavailability of orally administered flurbiprofen by combined use of hydroxypropyl-cyclodextrin and poly (alkyl-cyanoacrylate) nanoparticles European journal of drug metabolism and pharmacokinetics 2014; 39 (1): 61-67 [10] European Pharmacopoeia Commission European Pharmacopoeia 9th edition 2017 [11] Bilal Y, Emrah A Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations Journal of Pharmaceutical Analysis 2015; (4): 1-8 [12] United States Pharmacopeial Convention United States Pharmacopoeia 40–NF 35 2017 [13] Chenghan M, Bin L, Qiangfeng Y, Jing J, Ting X, et al Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence Journal of Chromatography B 2015; 993-994: 69-74 [14] Lee HI, Choi CI, Byeon CY, Lee JE, Park SY, et al Simultaneous determination of flurbiprofen and its hydroxy metabolite in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical application Journal of chromatography B 2014; 971: 58-63 [15] Murray KK, Boyd RK, Eberlin MN, Langley GJ, Li L, NaitoY Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013) Pure Appl Chem 2013; 85: 1515-1609 [16] Mano N, Narui T, Nikaido A, Goto J Separation and determination of diastereomeric flurbiprofen acyl glucuronides in human urine by LC/ESI-MS with a simple column-switching technique Drug Metabol Pharmacokin 2002; 17: 142-149 [17] Yilmaz B, Emrah A Determination of flurbiprofen in pharmaceutical preparations by GC-MS Arabian Journal of Chemistry 2015; accepted [18] European Medicines Agency Guideline on bioanalytical method validation 2011; 9-10 [19] The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1) 2005; 6-13 Validation of a High-Performance Liquid Chromatographic Method with diod array detection for the Quantification of Flurbiprofen in 100 mg Film-coated Tablet Nguyen Thi Thanh Binh, Dang Ngoc Anh, Tran Mai Anh, Nguyen Thanh Hai VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: A high-performance liquid chromatographic method was developed for the quantification of flurbiprofen in 100 mg film-coated tablet in accordance with the direction of the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use 10 μl of flurbiprofen solution was injected onto a C8 reverse phase column (5 μm, 120 Å, 4.6×150 mm) The mobile phase employed was acetonitrile : water : glacial acetic acid (65 : 32.5 : 2.5, v/v/v) at a flow rate of ml/min The column effluent was monitored within minutes by diot array detection at 247 nm The retention time of flurbiprofen was found to be 3.73 minutes In the concentration range of - 20 μg/ml, there was a tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and sample concentration x (μg/ml) according to the equation y = 0,680x as the squared correlation coefficient R2 was 0.9993 The limit of detection and limite of quantification were respectively 0.05 and 0.15 μg/ml The method was specific to flurbiprofen with good precision and accuracy The percentage recovery was ≤ 100 ± 2%, the relative standard deviation of the repeatability was ≤ 1.71% and the relative standard deviation of the intermediate precision was ≤ 2.34% PHỤ LỤC Quy trình định lượng flurbiprofen viên nén đơn hoạt chất phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang Mục đích Định lượng flurbiprofen viên nén đơn hoạt chất phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang Đối tượng Viên nén flurbiprofen đơn hoạt chất Phạm vi áp dụng Các phòng thí nghiệm có trang thiết bị phân tích phù hợp Trách nhiệm - Nghiên cứu viên giao nhiệm vụ có trách nhiệm thực quy trình - Cán quản lý chất lượng, tổ trưởng chuyên môn chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ quy trình nhận định kết định lượng Khái niệm từ viết tắt HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High – performance liquid chromatography) DAD Đầu dò chuỗi diode (Diode Array Detector) FLD Đầu dò huỳnh quang (Fluorecence Detector) ACN Acetonitril Nguyên lý Flurbiprofen có danh pháp quốc tế – (3–flouro–4–phenylphenyl) propanoic acid Flurbiprofen chất thuộc nhóm acid phenylalkanoic, có cơng thức phân tử C15H13FO2, khối lượng mol phân tử 244,26 g/mol Trong tự nhiên, flurbiprofen tồn hai dạng đồng phân quang học (+) S (–) R Hai dạng đồng phân thể tính chất vật lý giống có độ hấp thụ quang cực đại bước sóng 247 nm [1,2] Hình Công thức cấu tạo flurbiprofen Hiện tượng huỳnh quang hấp thụ ánh sáng có bước sóng để phát ánh sáng có bước sóng khác thường miền ánh sáng nhìn thấy, thường xảy với chất lỏng chất khí phân tử hấp thụ lượng dạng nhiệt (phonon) dạng quang (photon) Hiện tượng phát huỳnh quang có thời gian phát quang ngắn, tắt sau ngừng kích thích khoảng từ 10-8 đến 109 s Trong thời gian tồn electron trạng thái kích thích huỳnh quang thấp, cỡ 10-9 giây Quy trình định lượng chia thành cơng đoạn sau: Viên nén flurbiprofen Tính khối lượng trung bình viên Xử lý mẫu Dung dịch flurbiprofen có nồng độ lý thuyết 50 ng/ml Sắc ký dung dịch HPLC – FLD Tính hàm lượng flurbiprofen viên nén Hình Sơ đồ quy trình định lượng flurbiprofen viên nén đơn hoạt chất Nguyên vật liệu trang thiết bị 7.1 Dung mơi, hóa chất Acid acetic từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn HPLC Nước (H2O) tinh chế thiết bị Thermo Scientific GenPure UV-TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m Giấy lọc Whatman® 40, đầu lọc cellulose tái sinh Minisart® RC 0,45µm, Sartorius, Đức… Mẫu viên nén flurbiprofen định lượng 7.2 Trang thiết bị Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 – Dionex tập đoàn Thermo Scientific Hoa Kỳ gồm hệ thống bốn bơm cao áp phận tiêm mẫu tự động Đầu dò FLD Fluorecence Detector: FLD - 3100 Dionex sử dụng đèn Xenon, khoảng bước sóng đo 200 – 880 nm Cột Thermo Scientific Acclaim C8 120 kích thước μm, 4,6 × 150mm Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows có trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên 7.1.2.1478 Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản Pipetman Finnpipette F3, Thermo Scientific, Hoa Kỳ Bình định mức, ống đong, cối chày, An toàn Áp dụng biện pháp an toàn chung xử lý mẫu thực xét nghiệm theo quy trình an tồn xét nghiệm Quy trình thực Bước Thu thập xử lý mẫu viên nén Lấy 20 viên nén flurbiprofen vỉ Tính khối lượng trung bình viên Cạo lớp bao film (nếu có) nghiền mịn cối sứ Cân xác lượng bột viên tương ứng với 10 mg flurbiprofen cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) đến vạch Siêu âm khoảng 15 phút Lọc qua giấy lọc Whatman® 40 Pha loãng dung dịch pha động acetonitril : nước : acid acetic băng tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) đến nồng độ khoảng 50 ng/ml Lc qua u lc cellulose tỏi sinh Minisartđ RC 0,45àm Lấy khoảng 1ml dung dịch thu lọc qua u lc cellulose tỏi sinh Minisartđ RC 0,45àm, bm vo lọ thủy tinh sắc ký V = 1,5 ml Bước Sắc ký dung dịch flurbiprofen xử lý phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh cột silica gel pha đảo C8 (5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm) - Pha động hỗn hợp acetonitril : nước : acid acetic băng với tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v) - Tốc độ dòng ml/phút - Thể tích tiêm mẫu 10 μl - Thời gian sắc ký phút - Hệ thống sử dụng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích λEx = 247nm bước sóng phát xạ λEm = 312nm - Nhiệt độ buồng đo 45˚C - Độ nhạy = Số lần sắc ký: lần Tính diện tích pic (counts.min) lấy giá trị trung bình Bước Xác định hàm lượng flurbiprofen viên nén Xác định nồng độ x (ng/ml) flurbiprofen dung dịch sắc ký theo công thức: x= � − 896 1509 (ng/ml) Nếu x có giá trị nằm khoảng – 100ng/ml, hàm lượng C (%) flurbiprofen viên nén hàm lượng lý thuyết tính theo cơng thức: � C= × 100 (%) 50 Nếu x có giá trị không nằm khoảng – 100 ng/ml, tiến hành pha loãng dung dịch mẫu với hệ số pha loãng a lần Hàm lượng C (%) flurbiprofen viên nén tính theo cơng thức: � ×  C= (%) 50 Trong đó: a hệ số pha lỗng × 100 10 Tài liệu tham khảo Brittain Harry G (2013), Profiles of drug substances, excipients, and related methodology, Academic Press Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ... lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang 1.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang .8 1.3 Các phương pháp định lượng flurbiprofen. .. hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen viên nén bao phim 100mg phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò diode–array [2] Mục tiêu đề tài tiến hành Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen. .. tổng diện tích tất pic thành phần sắc ký đồ 1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa chế hấp phụ – chất tan bị