Mục tiêu của bài viết nhằm ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801 thông qua marker SNP rs9263726 (110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên BN sử dụng allopurinol.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SNP RS9263726 ĐỂ SÀNG LỌC ALEN HLA-B*58:01 BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Ngô Trường Giang*; Trần Văn Khoa* Nguyễn Minh Tâm*; Trần Thị Thu Huyền* TĨM TẮT Mục tiêu: ứng dụng quy trình phát SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 phương pháp PCR-RFLP Đối tượng phương pháp: 36 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại alen HLA-B tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng PCR-RFLP xác định kiểu gen SNP rs9263726, điện di sản phẩm gel agarose 2% phân tích kết để kết luận kiểu gen, giải trình tự gen PSORS1C1 10% số mẫu để kiểm chứng quy trình Kết quả: 36 mẫu AND, sàng lọc mẫu dương tính với HLA-B*58:01 Kết luận: ứng dụng quy trình phát SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 phương pháp PCR-RFLP * Từ khóa: HLA-B*58:01; rs9263726; PCR-RFLP Applying a Protocol to Detect SNP RS926726 for Screening HLAB*58:01 Allele Using PCR-RFLP Technique Summary Objectives: Applying a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique Subjects and methods: 36 blind blood samples with unknown HLA-B allelic types, total DNA was extracted, SNP rs9263726 was detected using PCR-RFLP technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis, sequencing 10% samples Result: We were able to detect HLA-B*58:01 in of 36 samples Conclusion: We have applied a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique * Key words: HLA-B*58:01; PCR-RFLP; rs9263726 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản ứng thuốc thể nặng ngày giảm nhờ nguyên tắc dùng thuốc hồn thiện theo hướng cá thể hố Tuy nhiên, số lượng dược chất đưa vào điều trị lâm sàng ngày tăng Khi phản ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân (BN) tử vong cao (30%) Do đó, dự phòng phản ứng thuốc thể nặng vấn đề đáng quan tâm Hiện nay, số kháng nguyên bạch cầu người (HLA) sử dụng marker để phát phản ứng thuốc nặng như: * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Ngô Trường Giang (legiangngo@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/03/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/05/2018 Ngày báo đăng: 09/06/2018 37 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 hội chứng Stevens Johnson hay nhiễm độc hoại tử Trong HLA này, HLAB*58:01 marker di truyền có liên quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng dùng thuốc allopurinol, đặc biệt cộng đồng người châu Do đó, cần sàng lọc HLA-B*58:01 trước dùng allopurinol để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng thuốc Tuy nhiên, việc phát trực tiếp HLA-B*58:01 đòi hỏi máy móc đại, tiêu tốn nhiều thời gian tiền bạc Gần đây, nghiên cứu phát số SNP liên kết chặt với HLA-B*58:01 [2] Trong số đó, SNP rs9263726 (110G>A) gen PSORS1C1 liên kết hồn tồn với HLA-B*58:01 Do đó, phát HLA-B*58:01 thông qua SNP PCR-RFLP kỹ thuật đơn giản, dễ triển khai, thời gian cho kết nhanh, giá thành rẻ hiệu để phát SNPs Trước thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801 thơng qua marker SNP rs9263726 (110G>A) kỹ thuật PCR-RFLP để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng BN s dụng allopurinol ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 36 mẫu máu chưa biết loại alen HLAB, chống đông EDTA thu thập Học viện Quân y mẫu ADN biết trước kiểu gen SNP rs9263726 phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng làm chứng âm (GG) chứng dương (GA) 38 Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN tổng số từ 36 mẫu máu thu thập được: tách chiết kít tách chiết ADN từ máu toàn phần Qiagen * PCR-RFLP phát gen HLAB*58:01: - Khuếch đại gen PSORS1C1: trình tự cặp mồi tham khảo theo Kaiko CS (2012) [5] Thành phần phản ứng PCR nhân gen: master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: μl; mẫu: μl, tổng thể tích 25 μl Chu trình nhiệt phản ứng PCR: phút; 30 chu kỳ: 30 giây, 600C 60 giây, 30 giây Cuối 720C phút 940C 940C 720C Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%, phân tích kết * X lý enzym giới hạn: - Các mẫu có kết nhân gen PSORS1C1 xử lý enzym Fok1 - Thành phần hỗn hợp xử lý enzym: sản phẩm nhân gen: μl; enzym Fok1: 0,4 ui - Chu trình nhiệt xử lý enzym: ủ hỗn hợp 37oC giờ, bất hoạt enzym 65oC 20 phút Sản phẩm thu điện di gel agarose 2%, phân tích kết * Giải trình tự Sanger: sản phẩm nhân gen PSORS1C1 tinh sạch, giải trình tự Sanger TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết nhân gen PSORS1C1 Sản phẩm nhân gen điện di gel agarose 2% 30 phút: Hình 1: Kết điện di sản phẩm nhân gen PSORS1C1 (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; dải lại: B ng gen PSORS C có kích thước 260 bp) Kết cho thấy băng xuất điện di sản phẩm nhân gen rõ ràng, kích thước thiết kế không xuất băng phụ Như vậy, điều kiện cho phản ứng nhân gen tối ưu Sản phẩm nhân gen xử lý enzym cắt giới hạn Kết xử lý enzym cắt giới hạn để phát SNP rs9263726 Sản phẩm nhân gen PSORS1C1 xử lý enzym cắt giới hạn Fok1 Sản phẩm xử lý enzym điện di gel agarose 2% Hình 2: Kết xử lý enzym sản phẩm nhân gen PSORS1C1 (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; dải lại: Sản phẩm x lý enzym mẫu nhân gen PSORS1C1) 39 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Dựa vào số vạch thu điện di sản phẩm xử lý enzym Fok1, kết luận kiểu gen: - Những mẫu xuất băng vị trí 260 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng đồng hợp tử GG, khơng mang gen HLA-B*58:01 - Những mẫu xuất băng 260 bp; 141 bp 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng dị hợp tử GA, mang gen HLA-B*58:01 dạng dị hợp tử - Những mẫu xuất băng 141 bp 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng đồng hợp tử AA, mang gen HLA-B*58:01 dạng đồng hợp tử Như vậy, 36 mẫu nghiên cứu, phát mẫu: 53; 57; 59; 70; 82 xuất băng Đây mẫu mang kiểu gen HLA-B*58:01 dạng dị hợp tử Bằng kỹ thuật này, bước đầu xác định 5/36 mẫu (13,9%) nghiên cứu có kiểu alen HLA-B*58:01 Kết giải trình tự Sanger Nghiên cứu thực 36 mẫu máu chưa biết kiểu gen SNP rs9263726 Để kiểm chứng quy trình, tiến hành chọn 10% tổng số 36 mẫu nghiên cứu tương ứng với mẫu để giải trình tự Sanger Trong mẫu, chọn mẫu âm tính với SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu gen GG mẫu dị hợp tử SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu gen GA xác định phương pháp PCR-RFLP Hình 3: Kết giải trình tự sản phẩm nhân gen PSORS1C1 mẫu 45; 52; 70 82 Tại vị trí 119 bp hai mẫu 45, 52 xuất đỉnh G màu đen Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 mẫu 45, 52 GG Tại vị trí 119 bp hai mẫu 70, 82 xuất đỉnh: đỉnh G màu đen, đỉnh A màu xanh Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 mẫu 70, 82 GA 40 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 BÀN LUẬN HLA-B*58:01 marker quan trọng tiên lượng phản ứng thuốc thể nặng dùng thuốc allopurinol Hung CS (2005) báo cáo mối liên hệ chặt chẽ HLA-B*58:01 dị ứng thể nặng dùng thuốc allopurinol người Hán - Trung Hoa với độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% số OR:580,3 [3] Các nghiên cứu cộng đồng người Thái, Hàn Quốc [9, 10] rõ điều Do đó, việc sàng lọc gen trước định allopurinol cho BN cần thiết Hiện nay, trực tiếp sàng lọc HLA-B*5801 kỹ thuật giải trình tự gen [2] hay đếm dòng chảy tế bào [8] Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi trang thiết bị máy móc phức tạp, kỹ thật viên có trình độ cao dẫn tới giá thành xét nghiệm cao nên khó triển khai rộng rãi Một số nghiên cứu HLAB*58:01 liên kết với số SNP Trong đó, SNP rs9263726 gen PSORS1C1 cách gen HLA-B 215 kb, liên kết hoàn toàn với gen HLA-B*58:01 (r2 = 1; D’ = 1) Do đó, gián tiếp sàng lọc HLAB*58:01 thơng qua SNP Hiện nay, sử dụng kít TaqMan SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP rs9263726 Mặc dù sàng lọc hiệu quả, kít có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị đại nên khó triển khai cộng đồng Trong nghiên cứu này, chúng tơi hồn thiện quy trình sàng lọc gián tiếp gen HLA-B*58:01 thông qua SNP rs9263726 phương pháp PCR-RFLP với nhiều ưu điểm như: không đòi hỏi máy móc q đại, đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp, từ triển khai rộng rãi Trong trình chọn mẫu làm chứng âm chứng dương cho PCR-RFLP phương pháp giải trình tự Sanger, chúng tơi phát kiểu gen SNP rs9263726 GG GA Kiểu gen đồng hợp tử AA cộng đồng, chưa phát thấy 36 mẫu nghiên cứu, 0/27 mẫu nghiên cứu Kaiko [5] hay 3/200 mẫu nghiên cứu Hung Do đó, số mẫu dương tính, có mẫu mang kiểu gen GA để giải trình tự đối chiếu Khi so sánh kết nghiên cứu với tác giả khác, nhận thấy tỷ lệ mang gen 13,9%, thấp so với nghiên cứu Hung CS người Hán - Trung Hoa (19,5%) , điều lý giải cỡ mẫu nhỏ, chưa đại diện cho cộng đồng Khi kiểm chứng quy trình giải trình tự Sanger ngẫu nhiên 10% số mẫu nghiên cứu, thu kết hoàn toàn đồng phương pháp PCR-RFLP sequencing Điều chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 hoạt động cắt enzym Fok1 hoàn toàn theo thiết kế KẾT LUẬN Chúng ứng dụng thành công quy trình phát SNP rs9263726 để sàng lọc alen HLA-B*58:01 kỹ thuật PCRRFLP, phát 5/36 mẫu nghiên cứu mang kiểu alen HLA-B*58:01 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T Human leukocyte antigens and drug hypersensitivity Curr Opin Allergy Clin Immunol 2007, 7, pp.317-323 41 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Tohkin M, Kaniwa N et al A wholegenome association study of major determinants for allopurinol-relates StevensJohnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Japanese patients Pharmacogenomics in Press 2011 Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T et al HLA-B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse reactions caused by allopurinol Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, pp.4134-4139 Kang H.R, Jee Y.K et al Positive and negative associations of HLA class alleles with allopurinol-induce SCARs in Korean Pharmacogenets Genomic 2011, pp.303-307 Kaiko M, Jun N et al Developed of a rapid and inexpensive assay for detecting a surrogate genetic polymorphism of HLAB*5801 Pharmacogenet 2012, pp.447-450 Bunce M, O’Neill C M, Barnardo M C et al Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 42 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCRSSP) Tissue Antigens 1995, 46, pp.355-367 Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Parham P, Marsh S.G The IMGT/HLA database Nucleic Acids Res 2011, 39, pp.D1171-1176 Kostenko L , Kjer-Nielsen L, Nicholson I, Hudson F et al Rapid screening for the detection of HLA-B57 and HLA-B58 in prevention of drug hypersensitivity Tissue Antigens 2011, 78, pp.11-20 Tassaneeyakul W , Jantararoungtong T, Chen P, Lin P.Y et al Strong association between HLA-B*5801 and allopurinol-induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in a Thai population Pharmacogenet/ 2009, pp.704-709 10 Kang H.R , Jee Y.K, Kim Y.S, Lee C.H, Jung J.W et al Positive and negative associations of HLA class I alleles with allopurinol-induced SCARs in Koreans Pharmacogenet 2011, pp.303-307 ... hiệu để phát SNPs Trước thực tiễn đó, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5 801 thơng qua marker SNP rs9263726 (110G>A) kỹ thuật PCR- RFLP để dự phòng phản ứng. .. đồng phương pháp PCR- RFLP sequencing Điều chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 hoạt động cắt enzym Fok1 hoàn toàn theo thiết kế KẾT LUẬN Chúng ứng dụng thành cơng quy trình phát SNP rs9263726 để sàng lọc alen. .. với gen HLA-B*58 :01 (r2 = 1; D’ = 1) Do đó, gián tiếp sàng lọc HLAB*58 :01 thông qua SNP Hiện nay, sử dụng kít TaqMan SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP rs9263726 Mặc dù sàng lọc hiệu quả, kít