Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746- 750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR.
TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 NGHIÊN CỨU ÂY DỰNG QUY TRÌNH PH T HI N KI U GEN VEGF V KI U T IẾN GEN EGFR ỨNG D NG TRONG IỀU TRỊ ÍCH UNG THƢ PHỔI Ngơ Tất Trung*; Định Ngọc S ** Ng Đặ g ă Khiêm**; ũ X â Phú** Ng iết Nhung** Chi Lă g** TĨM TẮT Xây dựng quy trình xét nghiệm phát kiểu gen VEGF kiểu đột biến đoạn (Del19(746750)), đột biến điểm exon 21 (L858R) gen EGFR Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi khơng tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR ni cấy điều kiện chuẩn Xác định tính đa hình gen VEGF phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR Xác định đột biến gen EGFR PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp cơng nghệ ARMS kiểm tra lại giải trình tự gen Xác định ngưỡng phát độ đặc hiệu phương pháp cách pha loãng nồng độ TB theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 100:100, sau tiến hành tách ADN làm khn cho phản ứng PCR Kết quả: hoàn thiện kỹ thuật động học alen đặc hiệu RT-PCR cho phép phát đồng thời hai thể đa hình Rs833061 Rs3025039 gen VGFR Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng alen cho phép xác định đột biến gen EGFR exon 19, exon 21 với ngưỡng phát 0,1% Độ đặc hiệu kỹ thuật 100% Giải trình tự gen khẳng định kết PCR đa mồi PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp cơng nghệ ARMS có ngưỡng phát thấp so với giải trình tự gen (0,1% so với 25%) * Từ khóa: Ung thư phổi; Ung thư phổi không tế bào nhỏ; EGFR; VEGF; PCR đa mồi ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY The aims of study are to set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and geneotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061 Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays Mutations of EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100 On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger sequencing Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21 with sensitivity is 0.1%; 1% and 1%, respectively Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (> 5%) The concordance was also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing * Từ khóa: Lung cancer; Non-small cell lung cancer; EGFR; VEGF; Multiplex-PCR * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Bệnh viện Phổi TW Người phả hồi (Corresponding): Ng Tất Tr g ( tatr g@ ahoo.com) Ngà hậ bài: 25/12/2013 Ngà phản biện đá h giá báo: 20/1/2014 Ngà bỏo c g: 21/1/2014 48 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng trình KHcn kc.10/11-15 T VN Ung th phi (UTP) bệnh gây tử vong cao số bệnh ung thư Dựa hình thái TB, chia UTP thành UTP TB nhỏ (UTPTBN) UTPKTBN UTPTBN chiếm 15 - 20%, lại 80 - 85% số ca UTP UTPKTBN Do phác đồ hóa trị xạ trị tương đối có hiệu UTPTBN, nên nghiên cứu lâm sàng tập trung nhiều vào việc chữa trị cho bệnh nhân (BN) UTPKTBN Một đặc điểm bật UTPKTBN gia tăng mức độ biểu thụ thể biểu mô (epithelial growth factor receptor EGFR), thụ thể mang hoạt tính tyrosine kinase Hoạt động enzym lại phụ thuộc nhiều vào tương tác EGFR với phân tử ATP tự bào tương Một EGFR thu nhận ATP, chuyển sang trạng thái bị kích hoạt truyền tín hiệu sống sót tới nhân bào, hỗ trợ cho trình tăng sinh TB đồng thời tăng khả di TB ung thư tới mô lân cận Hiện nay, thị trường dược phẩm tồn hai hợp chất có khả ức chế EGFR Cơ quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng điều trị UTPKTBN giai đoạn muộn gefitinib, erlotinib Việc định sử dụng dược phẩm phụ thuộc vào trạng thái đột biến gen EGFR Nhiều nghiên cứu cho thấy, tăng sinh mạch tính chất bệnh sinh ác tính điển hình UTP: nhu cầu dinh dưỡng nhu cầu trao đổi chất cao mức bình thường, đòi hỏi hình thành nhiều hệ thống mạch máu mới, TB ác tính tiết tác nhân tăng sinh mạch (Vascular endothelial growth factor VEGF) Tuy nhiên, VEGF khơng bộc lộ bề mặt TB ác tính mà tuần hồn mơi trường tác động lên thụ thể đặc hiệu TB biểu mơ đích, từ cảm ứng TB biểu mơ biệt hố thành TB mạch máu Việc loại bỏ VEGF kháng thể đặc hiệu benvacizumab gián tiếp ức chế TB ung thư thơng qua việc ức chế q trình tạo mạch mới, nhờ mặt “gây ngạt” cho khối u, mặt khác cắt nguồn dinh dưỡng nuôi khối u, gây hoại tử khối u Một đặc điểm bật liệu pháp ức chế VGFR điều trị ung thư khơng phải tất BN có biểu VGFR đáp ứng tốt với phác đồ điều trị sử dụng bevacizumab: thể đa hình khác định hình kiểu gen VGFR khác với mức tiên lượng đáp ứng điều trị khác Đến nay, người ta biết có thể đa hình khác khu vực mã hóa gen VGFR Tùy cộng đồng dân cư khác mà tần suất kiểu gen VGFR khác nhau, đồng thời đáp ứng thể mang kiểu gen tương ứng với phác đồ bevacizumab khác Để xác định đột biến gen EGFR VGFR, chủ yếu dựa vào công nghệ giải trình tự gen mua kít thương mại dựa nguyên lý RT-PCR PCR kết hợp ELISA Do tính chất phức tạp đột biến gen EGFR VGFR, nên phương pháp có nhiều hạn chế như: (1) giải trình tự gen phải nhân nhiều đoạn gen, độ nhạy kỹ thuật thấp (yêu cầu tối thiểu phải có > 25% gen mang đột biến phát được); (2) kít thương mại có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị phù hợp, phụ thuộc nhập ngoại có hạn sử dụng ngắn Do đó, việc tìm hiểu thiết lập phương pháp phát kiểu gen VEGF xác định đột biến gen EGFR khụng s 50 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng tr×nh KHcn kc.10/11-15 dụng phản ứng sequencing điều cần thiết Vì thế, chúng tơi nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Thiết lập quy trình phát kiểu gen VEGR kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng điều trị BN UTPKTBN Germer đề xướng (Germer, Holland CS, 2000 [3]; O'Brien, Everhart CS, 2011 [9]): đầu 3’ mồi xi bắt cặp xác với nucleotid vị trí SNP VẬT LI U V PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU vị trí SNP, thực đồng thời hai phản Vật liệu nghiên cứu Các dòng TB UTPKTBN mang đột biến EGFR: PC9, NCI-1650, HCC827 (delE746A750), H1975 (L858R) Các hóa chất chuẩn dùng RT-PCR, gel-PCR Hãng Invitrogene inc cung cấp Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp xác định đột biến gen EGFR: Ni cấy dòng TB theo phương pháp chuẩn, sau - ngày, kiểm tra đạt mật độ đạt khoảng - x 105 TB/ml Toàn TB, ADN tổng số tách chiết dùng làm khuôn cho phản ứng multiplex-PCR với mồi đặc hiệu cho thể hoang dại (wild type = WT) đột biến đoạn exon 19 (delE746-A750) đột biến điểm exon 21 vị trí L858R Trình tự mồi chúng tơi tự thiết kế Hình 1: Cở sở lý thuyết phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR Søren 51 Để kiểm tra có mặt alen ứng hai RT-PCR (tương ứng với hai mồi alen specific primer, alen specific primer nhận hai đường tín hiệu huỳnh quang) Trường hợp đồng hợp tử, xuất hai phổ huỳnh quang riêng biệt: đường sớm mơ tả tín hiệu đặc hiệu, đường muộn mơ tả tín hiệu bắt cặp lệch primer Trường hợp dị hợp tử hai đường cong, tín hiệu huỳnh quang gần trùng khít lên * Phương pháp phát kiểu gen VEGF: Xác định tính đa hình gen VEGF theo ngun lý động học alen đặc hiệu RTPCR Phương pháp Søren Germer (Germer, Holland CS, 2000 [3]) thiết lập lần năm 2000 Nguyên lý phương pháp tóm tắt sau: hai mồi đặc hiệu cho alen thiết kế cho đầu 3’ mồi xi bắt cặp xác với hai alen riêng biệt vị trí có SNP, đó, mồi ngược dùng chung cho hai alen Tại vị trí SNP, tồn ba trình tự nucleotid sau: đồng hợp tử alen trội, dị hợp tử đồng hợp tử alen Khi chẩn đoán SNP, tiến hành đồng thời hai phản ứng RT-PCR (sử dụng Sybr green I để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tương ứng với hai alen vị trí nghi ngờ có SNP Lúc xảy hai khả năng: (1) mẫu ADN đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh quang (trên lý thuyết) ghi nhận t¹p chÝ y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng trình KHcn kc.10/11-15 nht mt alen tương ứng Tuy nhiên, thực hành xảy tượng bắt cặp lệch primer, đó, mẫu ADN đồng hợp tử tín hiệu huỳnh quang xuất hai alen, đó, tín hiệu giả chậm tín hiệu thật khoảng từ - 15 chu kỳ (hình 1, panel trái) (Germer, Holland CS, 2000 [3]; O'Brien, Everhart CS, 2011 [9]) (2) trường hợp mẫu ADN dị hợp tử, tín hiệu huỳnh quang có mặt đồng hai alen, đường cong phổ huỳnh quang hai alen gần trùng khít khác nhá h¬n chu kỳ (∆Ct ≤ 1) (hình 1) (Germer, Holland CS, 2000 [3]; O'Brien, Everhart CS, 2011 [9]) * Phương pháp đánh giá ngưỡng phát (độ nhạy) độ đặc hiệu kỹ thuật: Để xác định mật độ tối thiểu TB ác tính mà xét nghiệm có khả phát đột biến gen EGFR, tiến hành pha lỗng dòng TB mang đột biến gen vào mẫu TB thể hoang dại theo tỷ lệ: 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 100:100 Sau đó, tách ADN tống số làm khn cho phản ứng PCR * Giải trình tự gen: Các đột biến gen sau phát phương pháp giải trình tự theo phương pháp Sanger hệ thống CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) để khẳng định kết so sánh độ nhạy kỹ thuật KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết phát đột biến gen EGFR exon 19 21 Exon 19 deletion Exon 21 mutation Hình 2: Kết sau chạy PCR đa mồi điện di phát đột biến gen EGFR exon 19 21 Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gen EGFR vị trí exon 19 (băng có mũi tên đỏ hình bên trái) vị trí exon 21 (băng có mũi tên đỏ hình bên phải) Negative control: chứng âm, WT: thể dại, mutant: đột biến ADN ladder: thang chun 52 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng tr×nh KHcn kc.10/11-15 ộ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR exon 19 PCR đa mồi (delE746-A750) M 50% 25% 5% 1% 0.5% 0.1% 0% BT §B Hình 3: Kết minh họa phát đột biến gen EGFR theo nồng độ Mật độ băng điện di thể đột biến giảm dần theo nồng độ từ cao đến thấp Nồng độ cuối 0,1% TB đột biến nhìn thấy rõ băng điện di Kết chứng minh, nồng độ 0% TB mang gen đột biến, không nhìn thấy băng điện di Chứng tỏ độ nhạy phương pháp TB mang gen đột biến 1.000 TB bình thường độ đặc hiệu 100%, khơng có kết dương tính giả Khẳng định kết phƣơng pháp giải trình tự gen Hình 4: Kết giải trình tự gen EGFR theo nồng độ gen mang đột biến Khi có 25% gen đột biến tổng số gen khơng đột biến giải trình tự gen phát Tuy nhiên, nồng độ gen đột biến giảm 5%, giải trình tự khơng phát 52 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng trình KHcn kc.10/11-15 Hỡnh ảnh phƣơng pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR (kinetics alen specific RT-PCR) Delayed amplification Early amplification Hình 5: Kết xây dựng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR So với lý thuyết, hình ảnh chúng tơi thu hồn tồn phù hợp cho tín hiệu rõ ràng VP1 Rs3025039 Major allele C VP1 Rs3025039 Major allele C VP-2 RS833061 heterogenous allele C/T VP-2 RS833061 heterogenous allele C/T Hình 6: Kết giải trình tự gen SNP rs3025039 RS833061 mẫu VP1 VP2 Kết giải trình tự gen hồn tồn phù hợp với phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR Mẫu bệnh phẩm VP1 chẩn đoán đồng hợp tử C/C (hình đầu mũi tên panel trái) mẫu VP2 chẩn đoán dị hợp tử C/T (hình đầu mũi tên panel phải) SNP RS833061 53 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng trình KHcn kc.10/11-15 N LUẬN Ung thư phổi bệnh ác tính có thời gian tiến triển bệnh nhanh gây tử vong cao số nhóm bệnh ung thư Nếu áp dụng phác đồ kinh điển sử dụng carboplatinpaclitaxel, thời gian sống không bệnh thời gian sống thêm BN UTPKTBN tương ứng 5,4 tháng 23,6 tháng Trong đó, BN điều trị dược phẩm tyrosine kinase inhibitor (gefitinib erlotinib) ức chế thụ thể biểu mô tương ứng 10,8 30,5 tháng (Caicun Zhou*, 2010 [2]; Maemondo, Inoue CS, 2010 [7]) Tuy nhiên, đáp ứng điều trị BN UTPKTBN với dược phẩm nói hồn tồn khác nhau: (1) có cá thể mang đột biến (delE746A750) (L858R) exon 18 21 đáp ứng tốt với phác đồ này; (2) BN khác không đáp ứng điều trị (nếu mang thụ thể EGFR hoang dai); (3) bệnh trở nên tồi tệ (đối với thể mang đột biến exon 18 20) Vì thế, việc sàng lọc đột biến EGFR có ý nghĩa điều trị UTPKTBN Trên thực tế, văn hướng dẫn điều trị UTP Mạng lưới Ung thư Quốc gia Mỹ ban hành năm 2013 khuyến cáo thực xét nghiệm sàng lọc đột biến (delE746-A750) (L858R) trước cân nhắc phác đồ điều trị thích hợp cho BN UTPKTBN Tuy nhiên, xét nghiệm có giá thành cao sử dụng kít thương mại (mặc dù độ nhạy kít cho phép phát phân tử ADN đột biến quần thể chúng đạt ngưỡng > 1%) Chi phí cho lần xét nghiệm - 10 triệu đồng/BN, mức giá cao đa số BN Do đó, Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108 nghiên cứu xây dựng xét nghiệm chẩn đoán hai dạng đột biến (delE746-A750) (L858R) gen EGFR Kết cho thấy, độ nhạy kỹ thuật - 0,1%, tức phát đột biến có phân tử ADN mang đột biến gen EGFR exon 19 tổng số 1.000 phân tử ADN bình thường phân tử ADN mang đột biến gen EGFR exon 21 tổng số 100 phân tử ADN bình thường Độ đặc hiệu 100%, khơng có tượng dương tính giả Kết tương đương với khuyến cáo kít thương mại sử dụng công nghệ Scopion Qiagene So với giải trình tự gen, độ nhạy phương pháp xây dựng cao rõ rệt (1% so với 25%) Về mặt kinh tế, theo tính tốn chúng tôi, lần xét nghiệm gen EGFR, BN phải toán 200.000 - 400.000 VNĐ, rẻ nhiều so với sở khác khu vực Hà Nội Bevacizumab Cơ quan Quản lý Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép điều trị UTP Tuy nhiên, ngồi kiểu gen VEGF, chưa có dấu hiệu giúp tiên lượng đáp ứng BN với dược phẩm Vì thế, cần thiết lập phương pháp phù hợp cho phát kiểu gen VEGF Đến nay, Sanger sequencing coi phương pháp chuẩn phát kiểu gen Tuy nhiên, thể đa hình gen lớn nằm rải rác cách xa nhau, thiết kế phản ứng giải trình tự gen cho nhiều thể đa hình lúc Hơn nữa, giải trình tự gen có chi phí lớn thời gian cho kết dài Sau cân nhắc phương pháp thay trang thiết bị sẵn có, chúng tơi tiến hành thiết lập phương pháp “động học alen đặc hiệu RT-PCR - kinetics alen specific RT-PCR” Phương pháp Søren Germer thiết lập lần vào năm 2000 (Germer, Holland CS, 2000 [3]), ngun lý mơ hình So với phương pháp xác định kiểu gen truyền thống như: cắt enzym giới hạn (RFLP) hay đọc trình tự, phương pháp mà chúng tơi sử dụng có ưu thế: (1) quy trình xét nghiệm đơn giản: RFLP bao gồm ba bước chạy PCR, cắt enzym chạy điện di agarose, đọc trình tự phải cần tới hai lần chạy PCR phân tích số liệu sau giai trình tự kinetics alen specific RTPCR có bước chạy RT-qPCR; (2) rẻ tiền tính trung bình phản ứng RTPCR có giá thành cao phản ứng PCR thơng thường, RFLP đòi hỏi thêm bước cắt enzym giới hạn chạy điện di agarose, nên thực tế, phương pháp kinetics alen specific RT-PCR kinh tế hn KT LUN 54 tạp chí y d-ợc học quân số 2-2014 - kết nghiên cứu ch-ơng trình KHcn kc.10/11-15 Đã xây dựng thành công phương pháp xác định đột biến gen EGFR phát kiểu gen VEGF với ngưỡng phát 0,1 - 1% (độ nhạy kỹ thuật) độ đặc hiệu 100% T I LI U THAM KHẢO Alan Sandler, Robert Gray, Michael C Perry, Julie Brahmer, Joan H Schiller, Afshin Dowlati, Rogerio Lilenbaum, David H Johnson Paclitaxel - carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer The New England Journal of Medicine 2005 Caicun Zhou*, YLW, Gongyan Chen, Jifeng Feng, Xiao-Qing Liu, Changli Wang, Shucai Zhang, Jie Wang, Songwen Zhou, Shengxiang Ren, Shun Lu, Li Zhang, Chengping Hu, Chunhong Hu, Yi Luo, Lei Chen, Ming Ye, Jianan Huang, Xiuyi Zhi, Yiping Zhang, Qin gyu Xiu, Jun Ma Li Zhang, Changxuan You Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase study Lancet Oncol 2010, pp.2735-2042 Germer S, MJ Holland et al High-throughput SNP alen-frequency determination in pooled ADN samples by kinetic PCR Geneome Res 2000, 10 (2), pp.258-266 Jemal A, R Siegel et al Cancer statistics CA Cancer J Clin 2009, 59 (4), pp.225-249 Klaus Podar, GT, Martin Sattler, Yu-Tzu Tai, Steven LeGouill, Hiroshi Yasui, Kenji Ishitsuka, Shaji Kumar, Rakesh Kumar, Lini N Pandite, Teru Hideshima, Dharminder Chauhan, Kenneth C Anderson The small-molecule VEGF receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma PNAS 2005, 103 Lucio Crinò, ED, Pilar Garrido, Frank Griesinger, Janessa Laskin, Nick Pavlakis, Daniel Stroiakovski, Nick Thatcher, Chun-Ming Tsai, CZ Yi-long Wu Safety and effi cacy of fi rst-line bevacizumab-based therapy in advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (SAiL, MO19390): a phase study Lancet Oncol 2010, pp.733-740 Maemondo M, A Inoue et al Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR N Engl J Med 2010, 362 (25), pp.2380-2388 Mok TS, YL Wu et al Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma N Engl J Med 2009, 361 (10), pp.947-957 O'Brien TR, JE Everhart et al An IL28B geneotype-based clinical prediction model for treatment of chronic hepatitis C PLoS One 2011, (7), p.20904 10 Takano T, T Fukui et al EGFR mutations predict survival benefit from gefitinib in patients with advanced lung adenocarcinoma: a historical comparison of patients treated before and after gefitinib approval in Japan J Clin Oncol 2008, 26 (34), pp.5589-5595 55 ... gen Hình 4: Kết giải trình tự gen EGFR theo nồng độ gen mang đột biến Khi có 25% gen đột biến tổng số gen khơng đột biến giải trình tự gen phát Tuy nhiên, nồng độ gen đột biến giảm 5%, giải trình. .. kc.10/11-15 dng phn ng sequencing điều cần thiết Vì thế, chúng tơi nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Thiết lập quy trình phát kiểu gen VEGR kiểu đột biến gen EGFR ứng dụng điều trị BN UTPKTBN Germer đề... TWQĐ 108 nghiên cứu xây dựng xét nghiệm chẩn đốn hai dạng đột biến (delE746-A750) (L858R) gen EGFR Kết cho thấy, độ nhạy kỹ thuật - 0,1%, tức phát đột biến có phân tử ADN mang đột biến gen EGFR exon