Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19 (746-750)), đột biến điểm trên Exon21 (L858R) của gene EGFR. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
24 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN KIỂU GENE VEGF VÀ KIỂU ĐỘT BIẾN GENE EGFR ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ PHỔI Ngô Tất Trung1, Đinh Ngọc Sỹ2, Nguyễn Viết Nhung2, Đặng Văn Khiêm2, Vũ Xuân Phú2, Nguyễn Chi Lăng2, Hàn Trung Điền2, Đào Thanh Quyên1 Lê Hữu Song1 Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Bệnh Viện Phổi Trung ương TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tiên lượng hiệu điều trị đích UTP phải dựa vào xét nghiệm xác định đột biến gene kiểu gene đích Mục tiêu: Xây dựng quy trình xét nghiệm phát kiểu gene VEGF kiểu đột biến đoạn (Del19 (746-750)), đột biến điểm Exon21 (L858R) gene EGFR Vật liệu phương pháp: Các dòng tế bào UTPKTBN mang đột biến gene EGFR nuôi cấy điều kiện chuẩn Tính đa hình gen VEGF xác định phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR Đột biến gene EGFR xác định PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp cơng nghệ ARMS kiểm tra lại giải trình tự gene Ngưỡng phát độ đặc hiệu phương pháp xác định cách pha loãng nồng độ tế bào theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 100:100, sau tiến hành tách DNA làm khn cho phản ứng PCR Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật động học allele đặc hiệu real-time PCR cho phép phát đồng thời thể đa hình Rs833061 Rs3025039 gene VGFR Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng allele cho phép xác định đột biến gene EGFR exon 19, exon 21 với ngưỡng phát 0,1% Độ đặc hiệu kỹ thuật 100% Giải trình tự gene khẳng định kết PCR đa mồi PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp cơng nghệ ARMS có ngưỡng phát thấp so với giải trình tự gene (0,1% so với 25%) Kết luận: Chúng xây dựng thành công phương pháp phát kiểu gene VEGF kiểu đột biến gene EGFR với ngưỡng phát (độ nhạy kỹ thuật) 0,1-1% độ đặc hiệu 100% Từ khóa: UTP, UTPKTBN, EGFR, VEGF, PCR đa mồi ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY Background: Personalised target therapies are widely approved for lung cancer, however, to optimize the therapeutic regimens, patients’ genetic background (EGFR, VEGF) must be clarified Người phản hồi: Ngô Tất Trung Email: ntatrung@yahoo.com Ngày nhận bài: 21/10/2013 Ngày báo đăng: 12/2013 Ngày phản biện đánh giá báo cáo: 11/2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Aims: To set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and genotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061 Materials and methods: Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays Mutations of EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100 On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger sequencing Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21 with sensitivity is 0,1%; 1% and 1%, respectively Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (>5%) The concordance was also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing Conclusion: We have successful established assays for detecting mutation of EGFR screening for allelic variants of VEGF Key words: Lung cancer, NSCLC, EGFR, VEGF, multiplex-PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi (UTP) bệnh gây tử vong cao số bệnh ung thư mà người biết giai đoạn muộn Gefitinib, Erlotinib Việc định sử dụng dược phẩm phụ thuộc vào trạng thái đột biến gene EGFR đến Dựa hình thái tế bào người ta chia UTP Nghiên cứu cho thấy cộng đồng dân cư thành UTP tế bào nhỏ (UTPTBN) UTP không tế khác có tần suất xuất đột biến EGFR bào nhỏ (UTPKTBN) UTPTBN chiếm 15-20% ca khác nhau: có 10-15% bệnh nhân ung thư, cịn lại 80-85% số ca UTP UTPKTBN UTPKTBN người Âu, Phi mang đột biến EGFR, Do phác đồ hóa trị xạ trị tương đối có hiệu tỷ lệ châu Á khoảng 40-60% (Takano, Fukui UTPTBN nên nghiên cứu lâm sàng tập et al 2008; Mok, Wu et al 2009) Đa số trường trung nhiều vào việc chữa trị cho bệnh nhân hợp đột biến gene EGFR xảy exon 18 (3%), UTPKTBN exon 19 (45-53%), exon 20 (4%), exon 21 (45%) Một đặc điểm bật UTPKTBN gia tăng mức độ biểu thụ thể biểu mô (epithelial growth factor receptor-EGFR), thụ thể mang hoạt tính tyrosine kinase Hoạt động enzyme lại phụ thuộc nhiều vào tương tác EGFR với phân tử ATP tự bào tương Một (Maemondo, Inoue et al 2010) Như vậy, có tỷ lệ tương đối lớn (40–90%) bệnh nhân UTPKTBN không mang đột biến phù hợp cho phác đồ điều trị đích sử dụng Gefitinib hay Erlotinib Vì vậy, việc tìm kiếm đích phân tử phù hợp cho nhóm bệnh nhân tiến hành EGFR thu nhận ATP, chuyển sang trạng Các nghiên cứu cho thấy tăng sinh mạch thái bị kích hoạt truyền tín hiệu sống sót tới nhân tính chất bệnh sinh ác tính điển bào, hỗ trợ cho trình tăng sinh tế bào đồng hình UTP: nhu cầu dinh dưỡng nhu cầu thời tăng khả di tế bào ung thư tới trao đổi chất cao mức bình thường, địi mơ lân cận Hiện thị trường dược phẩm tồn hỏi hình thành nhiều hệ thống mạch máu hai hợp chất có khả ức chế EGFR tế bào ác tính tiết tác nhân tăng sinh quan quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ mạch (Vascular endothelial growth factor VEGF) (FDA) cho phép sử dụng điều trị UTPKTBN Tuy nhiên, VEGF không bộc lộ bề mặt tế bào ISSN 1859 - 3925 Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI 25 26 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ác tính mà tuần hồn mơi trường tác động lên thụ thể đặc hiệu tế bào biểu mơ đích từ cảm ứng tế bào biểu mơ biệt hóa thành tế bào mạch máu Việc loại bỏ VEGF kháng thể đặc hiệu Benvacizumab gián tiếp ức chế tế bào ung thư thơng qua việc ức chế q trình tạo mạch nhờ mặt “ngây ngạt” cho khối u, mặt khác cắt nguồn dinh dưỡng nuôi khối u gây hoại tử khối u Một đặc điểm bật liệu pháp ức chế VGFR điều trị ung thư khơng phải bệnh nhân có biểu VGFR đáp ứng tốt với phác đồ điều trị sử dụng Bevacizumab: thể đa hình khác định hình kiểu gene VGFR khác với mức tiên lượng đáp ứng điều trị khác Cho đến người ta biết có thể đa hình khác khu vực mã hóa gene VGFR Tùy cộng đồng dân cư khác mà tần suất kiểu gene VGFR khác đồng thời đáp ứng thể mang kiểu gene tương ứng với phác đồ bevacizumab khác Cho đến nay, để xác định đột biến gene EGFR VGFR người ta chủ yếu dựa vào công nghệ giải trình tự gene mua Kit thương mại dựa nguyên lý Real Time PCR PCR kết hợp ELISA Do tính chất phức tạp đột biến gene EGFR VGFR nên phương pháp có nhiều hạn chế như: (i) giải trình tự gene phải nhân nhiều đoạn gene, độ nhạy kỹ thuật thấp (yêu cầu tối thiểu phải có 25% gene mang đột biến phát được); (ii) Kit thương mại có giá thành cao, địi hỏi trang thiết bị phù hợp, phụ thuộc nhập ngoại có hạn sử dụng ngắn Do đó, việc tìm hiểu thiết lập phương pháp phát kiểu gene VEGF xác định đột biến gene EGFR không sử dụng phản ứng sequencing điều cần thiết chúng tơi đặt nghiên cứu với mục tiêu: thiết lập quy trình phát kiểu gene VEGR kiểu đột biến gene EGFR ứng dung điều trị bệnh nhân UTPKTBN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Các dịng tế bào UTPKTBN mang đột biến TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 EGFR: PC9, NCI-1650, HCC827 (delE746-A750), H1975 (L858R) Các hóa chất chuẩn dùng realtime-PCR, gel-PCR hãng Invitrogen inc cung cấp 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp xác định đột biến gene EGFR: Các dịng tế bào ni cấy theo phương pháp chuẩn, sau 4-7 ngày kiểm tra đạt mật độ đạt khoảng 5-8x105 tế bào/ml Toàn tế bào, DNA tổng số tách chiết dùng làm khuôn cho phản ứng multiplex-PCR với mồi đặc hiệu cho thể hoang dại (wild type=WT) đột biến đoạn exon 19 (delE746-A750) đột biến điểm exon21 vị trí L858R Trình tự mồi chúng tơi tự thiết kế nên cung cấp bạn đọc quan tâm Specific signal Mismatch signal Hình 1: Cở sở lý thuyết phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR Phương pháp Soren Germer đề xướng (Germer, Holland et al 2000; O’Brien, Everhart et al 2011): đầu 3’ mồi xuôi (forward primer) bắt cặp xác với nucleotide vị trí SNP Để kiểm tra có mặt allele vị trí SNP, ta thực đồng thời phản ứng real – time PCR (tương ứng với bồi allele specific primer, allele specific primer nhận đường tín hiệu huỳnh quang) Trong trường hợp đồng hợp tử, xuất phổ huỳnh quang riêng biệt: đường sớm (specific signal) mơ tả tín hiệu đặc hiệu, đường muộn mơ tả tín hiệu bắt cặp lệch primer (mismatch siganl) Trong trường hợp dị hợp tử đường cong tín hiệu huỳnh quang gần trùng khít lên 2.2.2 Phương pháp phát kiểu gene VEGF: Tính đa hình gene VEGF xác định theo ISSN 1859 - 3925 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC nguyên lý động học allele đặc hiệu real-time PCR Phương pháp Søren Germer (Germer, Holland et al 2000) thiết lập lần vào năm 2000 Nguyên lý phương pháp tóm tắt sau: mồi đặc hiệu cho allele thiết kế cho đầu 3’ mồi xuôi (forward primer) bắt cặp xác với hai allele riêng biệt vị trí có SNP, mồi ngược (reverse primer) dùng chung cho allele Tại vị trí SNP, tồn trình tự nucleotide sau: đồng hợp tử allele trội (homozygous major alleles), dị hợp tử (heterozygous) đồng hợp tử allele (homozygous minor alleles) Khi tiến hành chẩn đoán SNP, ta tiến hành đồng thời phản ứng real time PCR (sử dụng Sybr green I để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tương ứng với allele vị trí nghi ngờ có SNP Lúc xảy khả năng: i) mẫu DNA đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh quang (trên lý thuyết) ghi nhận allele tương ứng Tuy nhiên, thực hành xảy tượng bắt cặp lệch (mismatch) primer, mẫu DNA đồng hợp tử tín hiệu huỳnh quang xuất allele tín hiệu giả chậm tín hiệu thật khoảng từ đến 15 chu kỳ (hình 1- panel trái) (Germer, Holland et al 2000; O’Brien, Everhart et al 2011) ii) trường hợp mẫu DNA dị hợp tử, tín hiệu huỳnh quang có mặt đồng hai allele, đường cong phổ huỳnh quang allele gần trùng khít khác chu kỳ (∆Ct ≤1) – (hình 1) (Germer, Holland et al 2000; O’Brien, Everhart et al 2011) 2.2.3 Phương pháp đánh giá ngưỡng phát (độ nhạy) độ đặc hiệu kỹ thuật: Để xác định mật độ tối thiểu tế bào ác tính mà xét nghiệm có khả phát đột biến gene EGFR, tiến hành pha lỗng dịng tế bào mang đột biến gene vào mẫu tế bào thể hoang dại theo tỷ lệ: 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 100:100 Sau tiến hành tách DNA tống số làm khuôn cho phản ứng PCR 2.4 Giải trình tự gene: Các đột biến gene sau phát phương pháp giải trình tự theo phương pháp Sanger hệ thống CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) để khẳng ISSN 1859 - 3925 định kết so sánh độ nhạy kỹ thuật III KẾT QUẢ 3.1 Kết phát đột biến gene EGFR exon 19 21 Hình 2: Kết sau chạy PCR đa mồi điện di phát đột biến gene EGFR exon 19 21 Nhận xét: Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gene EGFR vị trí exon 19 (băng có mũi tên đỏ hình bên trái) vị trí exon 21 (băng có mũi tên đỏ hình bên phải) Negative control: chứng âm, WT: thể dại, mutant: đột biến DNA ladder: thang chuẩn 3.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật xác định đột biến gene EGFR exon19 PCR đa mồi (delE746-A750) Hình 3: Kết minh họa phát đột biến gene EGFR theo nồng độ Nhận xét: Mật độ băng điện di thể đột biến (ĐB) giảm dần theo nồng độ từ cao đến thấp Nồng độ cuối 0,1% tế bào đột biến nhìn thấy rõ băng điện di Kết chứng minh nồng độ 0% tế bào mang gene đột biến khơng nhìn thấy băng điện di Chứng tỏ độ nhạy Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI 27 28 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC phương pháp tế bào mang gene đột biến 1000 tế bào bình thường độ đặc hiệu 100%, khơng có kết dương tính giả 3.3 Khẳng định kết phương pháp giải trình tự gene Hình 4: Kết giải trình tự gene EGFR theo nồng độ gene mang đột biến Nhận xét: có 25% gene đột biến tổng số gene khơng đột biến giải trình tự gene phát Tuy nhiên, nồng độ gene đột biến giảm cịn 5% giải trình tự khơng phát 3.4 Hình ảnh phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR (kinetics allele specific realtime PCR) TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình 5: Kết xây dựng phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR Nhận xét: So với lý thuyết mà hình ảnh mà chúng tơi thu hồn tồn phù hợp cho tín hiệu rõ ràng Hình 6: Kết giải trình tự gene SNP rs3025039 RS833061 mẫu VP1 VP2 Nhận xét: Kết giải trình tự gene hồn toàn phù hợp với phương pháp động học allele đặc hiệu realtime PCR Mẫu bệnh phẩm VP1 chẩn đoán đồng hợp tử C/C (hình đầu mũi tên panel trái) mẫu VP2 chẩn đoán dị hợp tử C/T (hình đầu mũi tên panel phải) SNP RS833061 IV BÀN LUẬN UTP bệnh ác tính có thời gian tiến triển bệnh nhanh gây tử vong cao số nhóm bệnh ung thư Nếu sử dụng phác đồ kinh điển sử dụng carboplatin–paclitaxel thời gian sống khơng bệnh thời gian sống thêm bệnh nhân UTPKTBN tương ứng 5,4 tháng 23,6 tháng Trong đó, số bệnh nhân điều trị dược phẩm tyrosine kinase inhibitor (Gefitinib Erlotinib) ức chế thụ thể biểu mô tương ứng 10,8 30,5 tháng (Caicun Zhou* 2010; Maemondo, Inoue et al 2010) Tuy nhiên, đáp ứng điều trị bệnh nhân UTPKTBN với dược phẩm nói hồn tồn khác nhau: i) Chỉ có cá thể mang đột biến (delE746-A750) (L858R) exon 18 21 đáp ứng tốt với phác đồ ii) Các bệnh nhân khác không đáp ứng điều trị (nếu mang thụ thể EGFR hoang dại) iii) Hoặc bệnh trở nên tồi tệ (đối với các thể mang đột biến exon 18 20) Chính lẽ việc sàng lọc đột biến EGFR việc có ý nghĩa điều trị UTPKTBN Trên thực tế văn hướng dẫn điều trị UTP mạng lưới ung thư quốc gia Mỹ ban hành năm 2013 khuyên cáo thực xét nghiệm sàng lọc đột biến (delE746-A750) (L858R) trước cân nhắc phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân UTPKTBN Tuy nhiên, xét nghiệm có giá thành cao sử dụng kit thương mại (mặc dù độ nhạy ISSN 1859 - 3925 kít cho phép phát phân tử DNA đột biến quần thể chúng đạt ngưỡng 1%) Chi phí cho lần xét nghiệm 5-10 triệu đồng/bệnh nhân số sở có triển khai xét nghiêm nước ta Đây mức giá cao, sức chịu đựng đa số bệnh nhân Xuất phát từ ý nghĩa đó, Khoa sinh học phân tử, BV TƯQĐ 108 nghiên cứu xây dựng xét nghiệm chẩn đốn dạng đột biến (delE746-A750) (L858R) gene EGFR Kết cho thấy độ nhạy kỹ thuật 1% đến 0,1%, tức phát đột biến có phân tử DNA mang đột biến gene EGFR exon 19 tổng số 1000 phân tử DNA bình thường phân tử DNA mang đột biến gene EGFR exon 21 tổng số 100 phân tử DNA bình thường Độ đặc hiệu 100%, khơng có tượng dương tính giả Kết tương đương với khuyến cáo Kit thương mại sử dụng công nghệ Scopion Qiagen So với giải trình tự gene độ nhạy phương pháp xây dựng cao rõ rệt (1% so với 25%) Về mặt kinh tế, theo tính tốn lần xét nghiệm gene EGFR bệnh nhân phải toán 400 000 VNĐ rẻ nhiều so với xét nghiệm sở khác khu vực Hà Nội Bevacizumab quan quản lý dược phẩm thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép điều trị UTP (http://www.fda.gov/drugs/informationondrugs/ approveddrugs/ucm336763.htm) Tuy nhiên, ngồi kiểu gene VEGF, chưa có dấu hiệu giúp Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI 29 30 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC tiên lượng đáp ứng bệnh nhân với dược phẩm Vì thế, việc thiết lập phương pháp phù hợp cho phát kiểu gene VEGF điều cần thiết Cho đến Sanger sequencing coi phương pháp chuẩn phát kiểu gene, nhiên thể đa hình gene lớn nằm rải rác cách xa khơng thể thiết kế phản ứng giải trình tự gene cho nhiều thể đa hình lúc Hơn giải trình tự gene có chi phí lớn thời gian cho kết dài Sau cân nhắc phương pháp thay trang thiết bị sẵn có chúng tơi tiến hành thiết lập phương pháp “động học allele đặc hiệu real-time PCR-kinetics allele specific real-time PCR”, Phương pháp Søren Germer thiết lập lần vào năm 2000 (Germer, Holland et al 2000) nguyên lý mơ hình So với phương pháp xác định kiểu gene (genotyping) truyền thống như: cắt enzyme giới hạn (RFLP) hay đọc trình tự (Sanger sequencing) phương pháp mà chúng tơi sử dụng có ưu là: (i) Quy trình xét nghiệm đơn giản: RFLP bao gồm bước chạy PCR, cắt enzyme chạy điện di agarose cịn đọc trình tự (Sanger sequencing) phải cần tới lần chạy PCR phân tích số liệu sau giai trình tự, kinetics allele specific real-time PCR có bước chạy RT-qPCR; (ii) Rẻ tiền tính trung bình phản ứng real time PCR có giá thành cao phản ứng PCR thơng thường, RFLP địi hỏi thêm bước cắt enzyme giới hạn chạy điện di agarose, nên thực tế phương pháp kinetics allele specific real-time PCR kinh tế Kết luận: Chúng xây dựng thành công phương pháp xác định đột biến gene EGFR phát kiểu gene VEGF với ngưỡng phát 0,11% (độ nhạy kỹ thuật) có độ đặc hiệu 100% TÀI LIỆU THAM KHẢO Alan Sandler, M D., Robert Gray, Ph.D., Michael C Perry, M.D., Julie Brahmer, M.D., Joan H Schiller, M.D., Afshin Dowlati, M.D., Rogerio Lilenbaum, M.D., and David H Johnson, M.D (2005) “Paclitaxel–Carboplatin Alone or with Bevacizumab for Non–Small-Cell Lung Cancer.” The new england journal o f medicine Caicun Zhou*, Y.-L W., Gongyan Chen, Jifeng Feng, Xiao-Qing Liu, Changli Wang, Shucai Zhang, Jie Wang, Songwen Zhou, Shengxiang Ren, Shun Lu, Li Zhang†, Chengping Hu, Chunhong Hu, Yi Luo, Lei Chen, Ming Ye, Jianan Huang, Xiuyi Zhi, Yiping Zhang, Qin gyu Xiu, Jun Ma,Li Zhang‡, Changxuan You (2010) “Erlotinib versus chemotherapy as fi rst-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, openlabel, randomised, phase study.” Lancet Oncol 2011; 2012: 2735–2042 Germer, S., M J Holland, et al (2000) “Highthroughput SNP allele-frequency determination in pooled DNA samples by kinetic PCR.” Genome Res 10(2): 258-266 Jemal, A., R Siegel, et al (2009) “Cancer statistics, 2009.” CA Cancer J Clin 59(4): 225-249 Klaus Podar, G T., Martin Sattler, Yu-Tzu Tai, Steven LeGouill, Hiroshi Yasui, Kenji Ishitsuka, Shaji Kumar, Rakesh Kumar, Lini N Pandite, Teru Hideshima, Dharminder Chauhan, and Kenneth C Anderson (2005) “The small-molecule VEGF TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma.” PNAS 103 Lucio Crinò, E D., Pilar Garrido, Frank Griesinger, Janessa Laskin, Nick Pavlakis, Daniel Stroiakovski, Nick Thatcher, Chun-Ming Tsai, and C Z Yi-long Wu (2010) “Safety and effi cacy of fi rst-line bevacizumab-based therapy in advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (SAiL, MO19390): a phase study.” Lancet Oncol 733– 740 Maemondo, M., A Inoue, et al (2010) “Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.” N Engl J Med 362(25): 2380-2388 Mok, T S., Y L Wu, et al (2009) “Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.” N Engl J Med 361(10): 947-957 O’Brien, T R., J E Everhart, et al (2011) “An IL28B genotype-based clinical prediction model for treatment of chronic hepatitis C.” PLoS One 6(7): e20904 10 Takano, T., T Fukui, et al (2008) “EGFR mutations predict survival benefit from gefitinib in patients with advanced lung adenocarcinoma: a historical comparison of patients treated before and after gefitinib approval in Japan.” J Clin Oncol 26(34): 5589-5595 11 WHO (2013) http://www.who.int/csr/disease/ hepatitis/world_hepatitis_day/question_answer/en ISSN 1859 - 3925 ... lập quy trình phát kiểu gene VEGR kiểu đột biến gene EGFR ứng dung điều trị bệnh nhân UTPKTBN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Các dòng tế bào UTPKTBN mang đột biến TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI... giải trình tự gene Hình 4: Kết giải trình tự gene EGFR theo nồng độ gene mang đột biến Nhận xét: có 25% gene đột biến tổng số gene khơng đột biến giải trình tự gene phát Tuy nhiên, nồng độ gene đột. .. 3.1 Kết phát đột biến gene EGFR exon 19 21 Hình 2: Kết sau chạy PCR đa mồi điện di phát đột biến gene EGFR exon 19 21 Nhận xét: Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gene EGFR vị