3.2.1. Độ chọn lọc
Phân tích đồng thời mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn nội tobramycin Sulfat 100 ụg/ ml, mẫu chuẩn chứa AMK 100 Mg/ ml có mặt chuẩn nội tobramycin Sulfat 100 ụg/ ml. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, sắc ký đồ thu được trình bày trong hình 8:
^ N ae
F^&lionTrie R tJ tn T n e N aeRtertanTne
8 10
(a) (b) (c)
Hình 8: sắc ký đồ (a):mẫu trắng; (b): mẫu trắng thêm chuẩn nội; (c); mẫu chuẩn AMK có thêm chuẩn nội
Các pic thu được sắc nét, cân xứng, tách khỏi nhau tốt, trong mẫu trắng không xuất hiện các píc tại vị trí của AMK và tobramycin sulfat. Chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc tốt trong định lượng AMK
3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính
Xác định mối quan hệ giữa tỷ số diện tích pic của AMK và IS với nồng độ AMK.
• Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký:
Pha dung dịch chuẩn nội IS (Img/ ml) và dung dịch chuẩn gốc theo chỉ dẫn của mục 2.3.1
Pha dãy các dung dịch chuẩn AMK nồng độ: 45,7; 68,55; 91,4; 114,25; 137,1 |ug/ ml có mặt chuẩn nội tobramycin sulfat 100 |0,g/ m l .
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã trình bày ở mục 2.3.2, kết quả thu được là diện tích pic được trình bày ở bảng 2:
Bảng 2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ
(|Lig/ml)
Diện tích pic Tỷ lệ diện tích pic (AMK/IS) Amikacin sulíat (AMK) Tobramycin sulíat (IS)
45,7 2588228 5282803 0,4899 68,55 4334830 4979607 0,8705 91,4 6078500 5145899 1,1812 114,25 7978124 5156122 1,5473 137,1 9652366 5035303 1,9169 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 R (AMK/IS) 50 y = 0.0155X -0.2111 R2 = 0.9991 100 150 c (mcg/ml)
Hình 9: Đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic AMK/ IS vào nồng độ AMK
Dùng chương trình excel tính được:
Phương trình hồi qui: y = 0,0155 X - 0.2111 với hệ số tương quan: r = 0,9995 Kết quả ở bảng 2 và hình 9 cho thấy hàm đáp ứng giữa tỷ số diện tích pic AMK/ IS và nồng độ AMK có quan hệ tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát. Trên cơ sở đó chúng tôi lựa chọn nồng độ định lượng AMK khoảng 100 ụg/ ml để tiến hành phân tích.
3.2.3. Độ chính xác của phương pháp
Độ chính xác của phương pháp được tiến hành trên mẫu thử Amikacin cùng với mẫu chuẩn được chuẩn bị như mục 2.3.1
Tiêm lần lượt mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, tính toán hàm lượng AMK trong mẫu thử theo công thức ở mục 2.3.3. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song. Kết quả được trình bày trong bảng 3
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
Mẫu 1 2 3 4 5 Lượng mẫu thử (ml) 1 1 1 1 1 1 Hàm lượng hoạt chất (mg/ ml) 225,38 225,68 232,26 229,93 227,99 ị ... ... Số liệu thống kê TB = 228,25 RSD%= 1,27
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD% = 1,27 (nhỏ hơn 2%) cho thấy phương pháp có độ chính xác đảm bảo. Kết quả này cho phép ta áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng hoạt chất AMK trong mẫu phân tích.
3.2.4. Độ đúng của phương pháp
Thêm vào mẫu thử (đã biết hàm lượng) một lượng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độ đúng của phương pháp được xác định từ tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn so với lượng chất chuẩn thêm vào.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu sắc ký có nồng độ AMK khoảng 100 ụg/ ml đã thêm một lượng chính xác chất chuẩn với sự có mặt của chất chuẩn nội nồng độ 100 ụg/ ml. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Lặp lại thực nghiệm 5 lần. Dựa vào
hàm lượng hoạt chất đã biết trong mẫu thử, hàm lượng của chất chuẩn thêm vào, từ kết quả tỷ số diện tích pic ta tính được hàm lượng các chất thu hồi lại. Kết quả được trình bày trong bảng 4
Báng 4: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
1 ị i Nồng độ (Mg/ml) Độ tìm lại (%) Kết quả thống kê Mẫu Mãu định lượng (Cp+AC) 1 Chất thử (Ct) Chuẩn thêm vào (Q ) Chuẩn tìm thấy (AC) 1 93,78 49,16 45,7 44,62 97,64 2 93,13 49,16 45,7 44,97 98,04 T B - 99,13% RSD%=2,50 3 96,15 49,16 45,7 46,99 102,82 4 93,7 49,16 45,7 44,54 97,46 5 94,04 49,16 45.7 44.88 98,21
* Nhận xét: Độ tìm lại của AMK đạt 99,13% và RSD%= 2,50 cho thấy phương pháp có độ đúng đảm bảo.
3.3. ứng dụng phương pháp đă xây dựng để định lượng amỉkacỉn trong chế phẩm.
Áp dụng phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định lượng chế phẩm chứa AMK có trên thị trường. Kết quả trình bày trong bảng 5:
Bảng 5 : Kết quả định lượng amikacin Sulfat trong chế phẩm
Ị
Tên mẫu SKS Nơi sản xuất Kết quả % so với
lượng ghi trên nhãn
Amikacin 402001 IL.Dong pharm.Co., LTD 93,30
Nhận xét: Kết quả % so với lượng ghi trên nhãn nằm trong khoảng 90- 120 %, đạt yêu cầu qui định theo USP 27.
Từ kết quả khảo sát điều kiện sắc ký (phần 3.1), thẩm định phương pháp phân tích (phần 3.2) và kết quả định lượng chế phẩm thuốc, chúng tôi đề xuất qui trình định lượng AMK trong chế phẩm như sau:
*t* Chuẩn bị mẫu phân tích:
Dùng nước làm dung môi hòa tan và pha loãng.
* Dung dịch IS: Cân chính xác 25mg tobramycin sulfat chuẩn hoà tan trong bình định mức 25 ml. Được dung dịch có nồng độ 1 mg/ ml
* Dung dịch chuẩn gốc A: Cân chính xác khoảng 10 mg amikacin sulfat chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch, lắc đều.
* Dung dịch S: Hút chính xác 2 ml dung dịch A và 2 ml dung dịch IS cho vào bình định mức 20 ml, cho nước đến vạch, lắc đều. Thu được dung dịch đối chiếu là hỗn hợp amikacin sulfat chuẩn 100 Mg/ ml và tobramycin sulfat
100 ụg/ ml.
* Chuẩn bị mẫu thử • Dung dịch T 1:
Lấy chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với 250 mg amikacin sulfat cho vào bình định mức 25ml, thêm nước đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 2ml dung dịch này pha loãng trong bình định mức 20 ml được dung dịch Tl.
• Dung dịch phân tích: Lấy 1 ml dung dịch T l, Iml dung dịch IS cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước đến đủ thể tích, lắc đều.
• Điều kiện sắc ký:
• Cột Lichrosorb RP 18 (250 X 4mm, 10 ụm) • Detectơ ; Alltech ELSD 2000
• Pha động: CH3OH: 0,3% acid pentafluoropropionic / H2O = 50:50 • Tốc độ dòng : 0,8 ml/ phút
• Nhiệt độ detectơ : 105 °c • Tốc độ dòng khí: 2 1/ phút.
Tiến hành định lượng mẫu chuẩn, mẫu thử song song. Kết quả % so với lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức:
Rj X c X 2500
A % = --- X 100 Rc X 1000 X M Trong đó:
A: % so với lượng ghi trên nhãn
Rj, Rq. lần lượt là tỷ số diện tích pic AMK/ IS của dung dịch thử và
dung dịch chuẩn.
C: nồng độ của dung dịch chuẩn (Mg/ ml) M: Lượng ghi trên nhãn (mg/ ml).
BÀN LUẬN
Phương pháp HPLC ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong phân tích do ưu điểm nổi bật: có độ chọn lọc cao, ổn định, độ lặp lại, độ đúng tốt và thời gian phân tích nhanh. Tuỳ theo đặc điểm cấu tạo, tính chất lý hoá.... các chất phân tích sau khi qua cột sẽ được phát hiện nhờ các detectơ tương ứng.
Amikacin được định lượng theo nhiều phương pháp khác nhau: vi sinh, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, HPLC với detectơ u v ( tiến hành dẫn chất hoá trước cột hoặc sau cột), HPLC với detectơ điện hoá, điện di mao quản dùng detectơ huỳnh quang.... Sử dụng detectơ tán xạ bay hơi trong nghiên cứu này có ý nghĩa xây dựng một phưoỉng pháp mới nhằm mở rộng ứng dụng của phương pháp HPLC đồng thời khắc phục một số hạn chế gặp phải ở các phưcfng pháp khác như: tốn thời gian, kết quả định lượng độ chính xác không cao (vi sinh),
Chương trình sắc ký mà chúng tôi đã lựa chọn cho phép định lượng được AMK trong chế phẩm do tính thích hợp của hệ thống (RSD% < 2%), tính chính xác cao (RSD%= 1,27) và độ đúng đảm bảo (RSD% = 2,50). Thời gian lưu của AMK khoảng 4,76 phút, IS khoảng 7,32 phút là thích hợp, pic thu được trên sắc đổ tách tốt và có độ cân xứng cao.
Tuy nhiên cũng cần phải thấy rằng đáp ứng của ELSD chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: đặc điểm của chất phân tích, thành phần, khả năng bay hơi của pha động, mức độ tinh khiết tốc độ dòng khí, nhiệt độ của detectơ.... Chính vì thế việc lựa chọn được các điều kiện cơ bản để nâng cao độ tin cậy của phép phân tích là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu định lượng khi sử dụng detectơ này. Phương pháp chuẩn nội là một trong các biện pháp khắc phục nhằm giảm thiểu các sai số xảy ra.
Định lượng kháng sinh không chỉ đơn giản là đánh giá hàm lượng của chúng có trong chế phẩm, mà kết quả định lượng sẽ có ý nghĩa hơn khi đánh giá được hoạt lực tác dụng của chúng, đây là ưu điểm nổi bật của phương pháp vi sinh. Đối với các kháng sinh đa thành phần trong họ aminoglycosid (gentamicin, ...), đã có nghiên cứu sử dụng HPLC- ELSD để xác định tỷ lệ mỗi thành phần trong hỗn hợp [10]. Như vậy, HPLC- ELSD kết hợp phương pháp vi sinh sẽ giúp ta sơ bộ đánh giá được hoạt lực tác dụng của mỗi thành phẩn .
ELSD ngày càng được sử dụng phổ biến trong hệ thống HPLC do có tính ưu viêt và nhiều đăc điểm khác biêt so với các detectơ khác.
Với detectơ UV- VIS:
Detectơ u v - VIS Detectơ ELSD
- Chỉ phát hiện các chất hấp thụ ánh
sáng tử ngoại hoặc khả kiến
i - Đường nền bị ảnh hưởng khi chạy j gradient bước sóng thấp
- Dung môi hoà tan không được hấp
thụ tử ngoại.
- Phát hiện các chất ít bay hơi hơn pha động
- Đường nền ít bị ảnh hưởng khi chạy gradient.
- Thích hơp với các dung môi có nhiệt độ bay hơi nhỏ hơn 100°c.
Với detectơđo chỉ số khúc xạ (RI):
Detectơ RI Detectơ ELSD
- Khi thay đổi nhiệt độ đường nền thay đổi
- Có thể cho pic dương hay âm - Không chạy được gradient.
- Không ảnh hưởng nhiều khi có sự dao động nhiệt độ
- Luôn cho đáp ứng pic dương - Chay đươc gradient.
L......
Vói detectơ huỳnh quang (Fluorescence detectơ ):
Detectơ Fluorescence Detectơ ELSD
- Thường đòi hỏi dẫn chất hoá trước cột hoặc sau cột.
- Không cần dẫn chất hoá.
Kết quả của nghiên cứu mở ra một hướng mới trong phân tích kháng sinh aminoglycosid, các dược chất không hấp thụ tử ngoại và ít bay hơi hơn pha động... nâng cao hơn nữa hiệu quả phân tích của phương pháp HPLC.
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XưẤT
1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được chúng tôi đi đến một số kết luận:
* Đã xây dựng được một chương trình sắc ký phù hợp định lượng AMK. • Cột Lichrosorb RP 18 (250 X 4mm, 10 Mm)
• Detectơ : Alltech ELSD 2000
• Pha động: CH3OH; 0,3% acid pentaAuoropropionic / H2O = 50:50 • Tốc độ dòng : 0,8 ml/ phút
• Nhiệt độ detectơ : 105 • Tốc độ dòng khí: 2 1/ phút
• Với sự có mặt của chất chuẩn nội tobramycin sulíat
* Thẩm định phương pháp phân tích AMK cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, độ đúng đảm bảo và sự tương quan tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic của AMK và IS với nồng độ AMK.
* Áp dụng qui trình đã xây dựng tiến hành định lượng đại diện mẫu chế phẩm
chứa AMK có trên thị trường.
* Kết quả nghiên cứu mở ra một hướng mới trong kiểm nghiệm mẫu dược chất mà chất phân tích không hấp tụ tử ngoại, không phát huỳnh quang... và ít bay hơi hơn pha động. Là phương pháp hiệu quả để xác định tạp chất trong mẫu kiểm nghiệm .
2. ĐỂ XUẤT
Tiếp tục nghiên cứu định lượng các kháng sinh trong nhóm aminoglycosid và các dược chất khác nhằm mở rộng hơn nữa phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC và ELSD.
*> Bổ xung phần giới thiệu chung về ELSD vào chuyên luận HPLC của dược
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Bộ y tế, Dược thư quốc gia Việt Nam, lần xuất bản thứ nhất- 2002, tr. 130-132
2. Phạm Gia Huệ- Trần Tử An, Hoá phân tích- Tập 2, Đại học Dược Hà Nội 1998, tr. 55- 84.
3. Kiểm nghiệm thuốc, Trường đại học dược Hà nội, tr. 81- 96.
4. Phạm Luận, (1999), Cơ sở lý thuyết sắc kỷ lỏng hiệu năng cao, Trường đại học Khoa học tự nhiên, đại học Quốc gia HN.
5. Đào Hùng Phi (1995), sắc kỷ lỏng hiệu năng cao, Tập huấn kỹ thuật kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp phân tích dụng cụ, Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế, tr. 5-30.
Tiếng Anh:
6. Alltech Catalog 550,(2004), Alltech Chromatography Sourcebook, p.2- 7, p .ll.
7. Argekar, A. p.; Raj, s. V.; Kapadia, s. u.; (1996), ''Determination o f amikacin in parenteral dosage forms by high- performance thin- layer
chromatography", J. Planar Chromatogr- Mod TLC, 9 ( 6), 459- 461.
8. Authority of the Board of Directors of the American society of Health- System pharmacists, Drug Information, vol I, p.71- 72, p. 65- 70.
9. British pharmacopoeia 2001, p. 101.
10. Clarot I.;Chaimbault p.; Hasdenteufel F.; Netter p.; Nicolas A.,(2004),”
Determination o f gentamicin sulfate and related compounds by high- performance liquid chromatography with evaporative light scattering
detection". Journal of Chromatography A, 1031, 281- 287.
11. Feng C.H.; Lin S.J.; Wu H.L.; Chen S.H.;(2001), " Trace analysis o f
amikacin in human plasma by high- performance liquid
12. Lung, K. R.; Kassal, K.R.; Green, J.S.; Hovsepian, P.K.;( Jan 1998), "
Catalytic precolumn derivatization o f amikacin ", J. Pharm. Biomed.
Anal, 16(5), 905-910.
13. Merck & Co., Inc, The Merck Index, (1996) Edition, p. 404
14. Nikolaos C. Megulas, Michael A. Koupparis (2004)," Enhancement o f evaporative light scattering detection in high- performance liquid chromatographic determination o f neomycin based on highly volatile mobile phase, high- molecular- mass ion-pairing reagent and
controlled peak shape”. Journal of Chromatography A, 1057, 125- 131
15. Oguri Shigeyuki, Miki Yasuyoshi,(1996)," Determination o f amikacin in human plasma by high- performance capillary electrophoresis with
fluorescence detection', Journal of Chromatography B, 6 8 6, 205-210.
16. Parriott D (1993 ), A Practical Guide to HPLC Detection, Academic Press, EviC. Harcourt Brace Jovanovich, p. 256- 261.
17. Pharmacopoeia o f the people's republic o f china- vol II, p. A76- A78
Appendix XL
18. Quanyun A. Xu, Lawrence A. Trissel {1999),"Stability- Indicating
HPLC methods for drug analysis ", American Pharmaceutical
Association, p. 13-14.
19. Santos, B.; Sayalero, M. L.; Zarzuelo, A.; Lanao, J. M., (2002),
"Determination o f amikacin in biological tissues by HPLC", J. Liq.
Chromatogr & Rel. Technol, 25 (3), 463- 473.
20. The United States pharmacopoeia 27, p. 111- 112; 2278- 2281.
21. Wichert B, Schreier H, Derendorf H.,(1991)," Sensitive liquid chromatography assay for the determination o f amikacin in human
Phụ lục 1: Một số sác ký đồ khảo sát khoảng tuyến tính
Khảo sát khoảng tuyến tính Amikacin Sulfat: 45,7 Mg/ml 140 120 N a m e R e te n tio n T im e C 'oTO 140 120 100 100 8 0 80 6 0 60 >E 4 0 4 0 ỊD iDIT> 20 CO sCO c o 2 0 0 £ CTJ ß 0 0 2 4 6 8 10 Minutes ELSD 2000 Results
Name Retenti Area Height Widt Start Stop
on Time h Time Time
Amikacin 4 . 793 2588228 104448 1.43 4.25 5 . 69
Tobramycin 7 .361 5282803 137730 2 .42 6 . 67 9 . 10
Totals
7871031 242178
N a m e 1 7 5 R e te n tio n T im e 150 CO Q 'p E co ß 150 125 125 100 100 7 5 75 IE 50 50 CD 2 5 o ơ ) 0 òó 2 5 c Õ E < 0 2 4 6 Minutes 8 10 ELSD 2 0 0 0 Results Name R e t e n t i on Time
Area Height widt
h Start Time Stop Time Amikacin T o b r a m y c i n 4 . 783 7 .403 4334830 4979607 1 6 9 6 1 5 130643 1 . 6 9 2.30 4 .17 6 . 64 5 . 86 8 . 93 Totals 9314437 300258