Xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (nelumbo nucifera gaertn. nelumbonaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng qui trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (nelumbo nucifera gaertn. nelumbonaceae) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector dãy diod quang nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen rất phong phú và có giá trị sinh học này.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NEFERIN TRONG CAO CHIẾT ALKALOID TOÀN PHẦN TỪ TÂM SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMBONACEAE) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ*, Nguyễn Đức Tuấn**, Trần Hùng** TÓM TẮT Mục tiêu: Việc nghiên cứu định lượng alkaloid sen số tác giả giới thực hiện(1) Tuy nhiên Việt Nam chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng alkaloid tâm sen kỹ thuật phân tích dụng cụ, Dược điển Việt Nam IV vừa phát hành đề cập phương pháp định lượng alkaloid toàn phần sen phương pháp phân tích thể tích khơng có phương pháp định lượng alkaloid tâm sen Vì đề tài thực nhằm mục tiêu xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae ) kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với detector dãy diod quang nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen phong phú có giá trị sinh học Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen Qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid xây dựng thẩm định kỹ thuật HPLC với detector PDA Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp khảo sát pH dung dịch đệm phosphat tỷ lệ dung môi pha động(5) Kết quả: Xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký sau: cột Phenomenex Lunar RP18 (250 x 4,6 mm; μm), pha động đẳng dòng bao gồm ACN: nước: đệm phosphat 60 mM, pH (30:45:25), tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector PDA đặt 282 nm Qui trình định lượng đạt tiêu đánh giá tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ xác tính tuyến tính qui trình định lượng Kết luận: Đề tài xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen, làm sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm định nguyên liệu chế phẩm từ sen, góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu quí, sử dụng rộng rãi nước Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae; Tâm sen; Alkaloid, Neferin; Sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF NEFERINE IN TOTAL ALKALOIDS EXTRACT FROM LOTI EMBRYO (NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMNONACEAE) BY HPLC WITH PDA DETECTOR Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 628 - 632 Objectives: Several studies on quantitative determination of alkaloids in Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae were conducted in the world(1) In Vietnam, the studies on alkaloids quantitation in Loti embryo by instrumental analysis methods were limited, so far ‘Pharmacopoeia Vietnamica, editio IV’ has only a monograph in which the total alkaloids in leaf of Nelumbo nucifera Gaertn was determined by volumetric *Khoa Dược, Trường đại học Y Dược Cần Thơ **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com 628 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học titration Therefore, assay of neferine in total alkaloids extracts from loti embryo was developed by HPLC with PDA detector Subjects and Methods: Total alkaloids extracts from loti embryo Assay of neferine was developed and validated by HPLC with PDA detector Separation efficiency and selectivity were optimized using mobile phase containing acetonitrile, water, and 60 mM phosphate buffer of different basic pH’s in variable ratios(5) Results: A simple HPLC method was developed for quantitative determination of neferine in total alkaloidal extracts from loti embryo with following chromatographic conditions: Phenomenex Lunar RP18 column (250 x 4.6 mm; μm), mobile phase in isocratic mode including mixture of acetonitrile, water, and 60 mM phosphate buffer with pH adjusted to (30:45:25), flow rate of ml/min., detection wavelength of 282 nm This procedure meets all requirements of system suitability and quantitative method validation such as selectivity, precision, accuracy, and linearity Conclusion: The validated method enables a reliable statement concerning quantitative determination of neferine in total alkaloids extracts from loti embryo, contributes to control quality of herbal raw materials and pharmaceuticals from Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae Keywords: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae; Loti embryo; Alkaloid; Neferine, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn) họ Nelumbonaceae số dược thảo mà tất phận vị thuốc quí chủ yếu chứa alkaloid (neferin, nuciferin, lotusin, liensinin, isoliensinin ) hay flavonoid (quercetin, kaemferol, rutin )(2,4) Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh tác dụng sinh học in vivo tâm sen như: an thần, chống oxi hóa, hạ cholesterol, hạ huyết áp, kháng HIV… Việc nghiên cứu định lượng thành phần sen số tác giả giới thực hiện(1) Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng alkaloid tâm sen kỹ thuật phân tích dụng cụ, Dược điển Việt Nam IV vừa phát hành đề cập phương pháp định lượng alkaloid toàn phần sen phương pháp phân tích thể tích khơng có phương pháp định lượng alkaloid tâm sen Vì chúng tơi tiến hành đề tài “Xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae ) kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với detector dãy diod quang” nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng cho nguồn nguyên liệu sen phong phú có giá trị sinh học Đối tượng nghiên cứu Chuyên Đề Dược Khoa Cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen thu hái Đồng tháp mua nhà thuốc đông dược Chất đối chiếu Chất đối chiếu neferin sulfat Trung tâm hóa học thuốc, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp Độ tinh khiết 97,2% tính chế phẩm trạng Hóa chất, dung mơi Tất dung mơi, hóa chất loại tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký (Merck, Đức) Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Alliance 2695, detector PDA 2996 (Waters, Mỹ) Phương pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc hóa học neferin sulfat base hữu dạng muối, phân cực có pKa trung bình nên kỹ thuật sắc ký pha đảo áp dung với hệ dung môi phân cực bao gồm acetonitril, nước dung dịch đệm phosphat 60 mM có pH khoảng 7,0 – 8,0 629 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh ml cao đặc tâm sen hưởng đến hiệu tách độ chọn lọc phương pháp khảo sát pH dung dịch đệm phosphat tỷ lệ dung mơi pha động Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp, Hòa vào H2SO4 2%, lọc qua giấy lọc Dịch alkaloid muối khảo sát tính phù hợp hệ thống, thẩm định Kiềm hóa với NH4OH 25% Chiết với CHCl3 đến phương pháp ứng dụng qui trình kiệt alkaloid Cơ dịch chiết đến cắn khô thẩm định để xác định hàm lượng neferin có cao chiết alkaloid tồn phần từ tâm sen thu hái Đồng Tháp mua nhà thuốc đơng Cắn alkaloid tồn phần Hòa vào H2SO4 2% lọc qua giấy lọc dược(3,5) Dịch alkaloid muối Chuẩn bị mẫu Mẫu đối chiếu: Cân xác 10 mg chất đối chiếu neferin sulfat, cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan nước cất lần, bổ sung nước đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch Kiềm hóa với NH4OH 25% Chiết với CHCl3 đến kiệt alkaloid Cô dịch chiết đến cắn Cắn alkaloid toàn phần tinh chế thu được, cho vào bình định mức 25 ml, thêm Hòa vào 25 ml MeOH, lấy ml dịch MeOH, nước cất lần vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc lọc qua SPE, cho vào bình định mức 10 ml, lọc qua Millipore 0,45µm Dung dịch thu có nồng màng lọc 0,45µm độ neferin 200 ppm Mẫu thử Mẫu thử: Được chuẩn bị theo sơ đồ KẾT QUẢ & BÀN LUẬN Sơ đồ Quy trình chuẩn bị mẫu thử Khảo sát điều kiện sắc ký Điều kiện sắc ký cố định: Cột Phenomenex (a) Luna RP18 (250 x 4,6 mm, µm) Detector PDA, bước sóng phát 282 nm Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm mẫu 20 µl Điều kiện khảo sát Điều kiện khảo sát 630 Pha động (ACN:H2O:đệm phosphat 60 mM) 60:40:0 70:25:5 68:25:7 55:35:10 30:45:25 (b) (c) (d) (e) Hình Sắc ký đồ dung dịch mẫu đối chiếu điều kiện khảo sát (a): điều kiện 1; (b): điều kiện 2; (c): điều kiện 3; (d): điều kiện 4; (e): điều kiện Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học neferin nằm khoảng 0,8 – 1,5 Độ phân giải pic neferin pic tạp lớn 1,5 Vậy quy trình định lượng neferin đạt tính phù hợp hệ thống Tính chọn lọc Hình Sắc ký đồ mẫu thử điều kiện Nhận xét Điều kiện 1: neferin rửa giải sớm, pic bất đối, chiều rộng pic lớn, chiều cao pic thấp Điều kiện 3: neferin rửa giải sớm vừa tách khỏi pic tạp Điều kiện 4: neferin rửa giải trễ tách hoàn toàn pic tạp, chiều cao pic thấp Điều kiện 5: neferin rửa giải khoảng 12 phút, tách hoàn toàn pic tạp, chiều cao pic tăng so với điều kiện Chọn điều kiện với hệ pha động ACN: H2O: đệm phosphat 60 mM (30:45:25) điều kiện sắc ký thích hợp thỏa mãn thời gian lưu, hình dạng pic, độ phân giải độ đáp ứng pic neferin Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp (n=6) Mẫu Giá trị tR S thống kê (phút) Đối XTB 11,88 11.841.48 chiếu SD 0,00 148.382 RSD 0,01% 1,25% Thử XTB 11,89 36.645.73 SD 0,02 32.900 RSD 0,16% 0,09% Nbk Rs As 7811 10,4 1,3 66 0,2 0,0 0,85% 2,00% 1,27% 7801 1,9 1,3 75 0,1 0,0 0,97% 1,59% 1,13% tR: thời gian lưu; S: diện tích đỉnh; Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến; Rs: độ phân giải; As: hệ số đối xứng Nhận xét: RSD thông số sắc ký cho lần tiêm lặp lại mẫu đối chiếu mẫu thử nhỏ 2% Hệ số đối xứng pic Chuyên Đề Dược Khoa Hình Sắc ký đồ mẫu trắng (a), pha động (b) dung dịch mẫu thử (c) Điều kiện sắc ký: hình 1e Nhận xét: Kết khảo sát tính chọn lọc cho thấy mẫu trắng (methanol) mẫu pha động khơng có pic trùng với pic neferin Thời gian lưu pic sắc ký đồ mẫu thử tương đương với thời gian lưu pic neferin sắc ký của mẫu đối chiếu Khi thêm chất đối chiếu neferin vào mẫu thử, chiều cao diện tích đỉnh pic neferin tăng lên so với trước thêm Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic cho kết pic neferin khơng có thành phần khác mẫu đối chiếu mẫu thử Như qui trình định lượng neferin đạt tính chọn lọc qui trình định lượng Độ đúng, độ lặp lại khoảng tuyến tính Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại khoảng tuyến tính Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính (μg/ml) Độ lặp lại (n=6) Độ (n=9) Neferin Y = 3086,9x; R2 = 0,9997 20 - 140 RSD = 1,89% RTB = 98,03 % RTB: tỷ lệ hồi phục trung bình 631 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nhận xét: Kết thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm khoảng 98% - 102% RSD < 2% độ lặp lại Xác định hàm lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen thu hái Đồng Tháp mua từ nhà thuốc bắc Bảng Kết định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen tâm sen (n=6) Hàm lượng neferin Đồng Tháp Nhà thuốc bắc Cao chiết Tâm sen Cao chiết Tâm sen 2,8 0,32% 0,95 0,15% mg/ml (g/g) mg/ml (g/g) Tháp cao mua nhà thuốc đông dược Trên sắc ký đồ mẫu thử tâm sen mua từ nhà thuốc đông dược có xuất pic lạ có diện tích đỉnh lớn pic neferin Nguyên nhân mẫu tâm sen thu hái lâu bảo quản không qui định nên dẫn đến làm giảm hàm lượng neferin KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector dãy diod quang, xây dựng qui trình định lượng neferin cao chiết alkaloid tồn phần từ tâm sen Phương pháp có tính đặc hiệu, xác, ứng dụng để định tính, định lượng neferin nguyên liệu số chế phẩm bào chế từ sen theo dõi độ ổn định xây dựng qui trình định tính điểm chất tâm sen Việt Nam vùng miền mùa thu hái khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (a), mẫu thử tâm sen thu hái Đồng tháp (b) mẫu thử tâm sen mua từ nhà thuốc bắc (c) Điều kiện sắc ký: hình 1c Kết khảo sát cho thấy hàm lượng phần trăm neferin có tâm sen thu hái Đồng 632 Chen Yi, Luo Shun-De (2004), “Quantitative analysis of three main alkaloids in plumula nelumbinis and the study on characteristic chromatogram”, Chin Hosp Pharm J, 24(4), pp 205-208 Đỗ Tất Lợi (2005), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất Y học, tr 783- 786 Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu (2009), Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược đại học Y- Dược TP.HCM Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ (1998), “Nghiên cứu thành phần hóa học sen”, Tạp chí dược học, tháng nǎm 1998, tr 13 - 18 Trịnh Văn Lẩu, Trần Việt Hùng, Phạm Thanh Kỳ (2009), ‘Nghiên cứu chiết xuất phân lập tinh khiết nuciferin, linarin, chlorogenic acid myricetin từ thuốc để làm chuẩn”, Pharma Indochina VI, tr 587-592 Chuyên Đề Dược Khoa ... tâm sen thu hái Đồng Tháp mua từ nhà thuốc bắc Bảng Kết định lượng neferin cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen tâm sen (n=6) Hàm lượng neferin Đồng Tháp Nhà thuốc bắc Cao chiết Tâm sen Cao chiết. .. chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae ) kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao với detector dãy diod quang nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lượng. .. mẫu tâm sen thu hái lâu bảo quản không qui định nên dẫn đến làm giảm hàm lượng neferin KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector dãy diod quang, chúng tơi xây dựng qui trình định