Nghiên cứu trình bày về: Mã đề plantago major L. được sử dụng với nhiều mục đích trong Y học cổ truyền trên toàn thế giới. Tuy vậy, cho đến nay tại Việt Nam, việc sử dụng cao Mã ñề trong các chế phẩm trị liệu còn rất hạn chế, một phần có thể do cao mã đề chưa có tiêu chuẩn xây dựng để định lượng. Xây dựng phương pháp định lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp so màu, sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn.
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG POLYSACHARID TRONG CAO MÃ ĐỀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG Lê Thị Lan Phương∗, Lâm Ngọc Thọ∗∗, Nguyễn Ngọc Khơi** TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Mã ñề Plantago major L ñược sử dụng với nhiều mục đích Y học cổ truyền tồn giới Tuy vậy, Việt Nam, việc sử dụng cao Mã ñề chế phẩm trị liệu hạn chế, phần cao Mã đề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng Xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần phương pháp so màu, sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn Phương pháp: Polysaccharid chiết từ cao tồn phần nước nóng, sau ñó làm tủa polysaccharid ethanol 95% Tủa cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc Sau hòa tan ethanol 95% Đo sản phẩm tạo thành máy ño quang phổ UV-Vis cực ñại hấp thu 422 nm Phản ứng ñược thực song song với acid D (+) galacturonic chuẩn Kết quả: Kết thẩm định qui trình cho thấy ứng dụng ñể ñịnh lượng polysaccharid cao chiết mã ñề Kết luận: Xây dựng thẩm định qui trình định lượng polysaccharid tồn phần cao mã đề, sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn Từ khóa: Mã ñề Plantago major L., polysaccharid, acid D (+) galacturonic ABSTRACT QUANTITATIVE ANALYSIS OF POLYSACCHARIDES FROMPLANTAGO MAJOR EXTRACT Le Thi Lan Phuong, Lam Ngoc Tho, Nguyen Ngoc Khoi Background and aims: Plantago major L has been used as a medicinal material for many years The biological activity of this type of plant material is due to a complex of biologically active compounds in which the polysaccharides are particularly noteworthy The present study was undertaken to develop and validate quantitative method for analysis the total content of polysaccharides in Plantago major extracts Methods: The polysaccharides from P major extracts were developed by Dreywood method, converted to galacturonic acid Results: This quantitative determination is inexpensive, simple, sensitive, and reproducible Conclusion: This method is appliable to determine the polysaccharide content of Plantago major extracts Key words: Plantago major L., polysaccharide, D (+) galacturonic acid, quantitative analysis ĐẶT VẤN ĐỀ Mã ñề Plantago major L ñược sử dụng với nhiều mục ñích Y học cổ truyền tồn giới có tác dụng tốt ñối với bệnh lao, ung thư ñặc biệt ñối với thể nặng loét dày Cao chiết từ khơ có tác dụng kích thích tái sinh tất lớp da, tác dụng lợi tiểu, làm tăng lượng nước tiểu, ure, acid uric muối nước tiểu Cao cồn có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt ñối với tổn thương gan gây CCl4 ñộng vật Hoạt chất aucubin phân lập từ hạt mã đề có tác dụng bảo vệ gan chống ngộ ñộc nấm Amanita [1],[3],[5],[6].Tuy vậy, cho ñến Việt Nam, việc sử dụng cao mã đề chế phẩm có mục đích trị liệu hạn chế, phần cao mã ñề chưa có tiêu chuẩn xây dựng ñể ñịnh lượng Trong nghiên cứu này, xây dựng phương pháp ñịnh lượng polysaccharid toàn phần phương pháp so màu sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn theo phương pháp D N Olennikov [4] NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất, dung mơi: Dung mơi sử dụng chiết xuất loại dược dụng, dung môi hóa chất dùng phân tích, định lượng dùng loại PA (Pure Analysis) AR (Analysis Reagent): anthron PA (Merck), acid sulfuric PA, acid hydrocloric PA (Prolabo), acid D (+) galacturonic PA (Fluka-Slovakia), ethanol PA (Merck), Thiết bị: Máy ño quang phổ UV-Vis Hitachi U-1900, máy ly tâm Sigma ∗ Khoa Y học Cổ Truyền- Đại học Y Dược Tp HCM Khoa Dược – Đại học y Dược Tp HCM Địa liên hệ: DS Lê Thị Lan Phương ĐT:0907748591 ∗∗ Email: lanphuongd04@yahoo.com 147 Cao chiết Mã ñề: Thu mua Mã đề tươi vào tháng 03/2009 chợ Nguyễn Văn Trỗi, loại bỏ thân, bị sâu bệnh, rửa sạch, bỏ rễ, phơi âm can xay thơ Bột Mã đề sau ngấm kiệt cồn 50% với tỷ lệ dung môi: dược liệu 10:1 Tất dịch chiết sau cách thủy ñến ñược cao chiết với ñộ ẩm 12,43%, hiệu suất chiết sau ñã trừ ẩm 20% Phương pháp xử lý mẫu: Cân xác khoảng g cao cho vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước nóng Đun cách thủy giờ, làm lạnh Lọc vào bình định mức 50 ml Thêm khoảng 20 ml nước nóng chiết thêm lần ñiều kiện tương tự Bổ sung nước vạch (dung dịch A) Lấy ml dung dịch A, thêm ml ethanol 95%, khuấy ñều cách thủy 10 phút Sau để nguội ly tâm 3000 vòng/10 phút Gạn bỏ dịch Thêm vào tủa ml ethanol 95%, tiến hành bước tương tự Sau ly tâm bỏ dịch, dùng nóng loại bỏ vết ethanol Thêm ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc, ñem cách thủy hỗn hợp phản ứng 10 phút Để nguội, cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung ethanol 95% ñến vạch (dung dịch B) Mẫu chuẩn ñược thực ñồng thời với mẫu thử cho phản ứng với dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 ñậm ñặc Dung dịch mẫu trắng ml dung dịch 0,2% anthron/H2SO4 đậm đặc bình định mức 25 ml, bổ sung ethanol 95% ñến vạch Quét phổ mẫu thử mẫu chuẩn từ 700 – 350 nm tìm đỉnh hấp thu cực ñại ñể tiến hành ñịnh lượng Thẩm ñịnh qui trình: Bao gồm: khảo sát ñộ lặp lại, ñộ xác phương pháp khoảng tuyến tính nồng độ định lượng Từ suy lượng polysaccharid tồn phần có cao chiết quy acid D (+) galacturonic KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phổ UV-Vis tìm bước sóng hấp thu cực đại Hình Bước sóng hấp thu cực đại chuẩn mẫu thử Mẫu chuẩn (1) thử (2) có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 422 nm, chọn bước sóng để định lượng Theo tác giả D N Olennikov mẫu chuẩn thử có ñỉnh hấp thu cực ñại 424 nm [5] Khoảng tuyến tính Khảo sát tuyến tính lượng acid D (+) galacturonic ñộ hấp thu theo phương pháp tiến hành với lượng mẫu từ 160 – 560 µg, sau sử dụng MS-Excel để phân tích hồi quy (regression analysis) ta có dạng ước tính phương trình tương quan tuyến tính Ŷ = 0,0014 X – 0,0085 Trắc nghiệm tính tương thích phương trình ý nghĩa hệ số hồi quy cho thấy phương trình hồi quy tuyến tính lượng acid D (+) galacturonic ñộ hấp thu Y = 0,0014X [2] Khoảng tuyến tính 160 – 560 µg để tính lượng mẫu thử cần thiết cho định lượng, đồng thời tiến hành thử độ độ xác qui trình khoảng tuyến tính 148 Bảng Sự tương quan lượng acid D (+) galacturonic độ hấp thu Lượng acid D (+) galacturonic (µg) (X) 160 240 320 400 480 560 Độ hấp thu (Y) 0,208 0,307 0,44 0,543 0,632 0,753 Độ xác: Bảng Kết khảo sát độ xác Lần thử Độ hấp thu Hàm lượng (%) 0,568 100,0 0,564 99,29 0,567 99,82 0,562 98,94 0,56 98,59 0,563 99,12 Trung bình X = 99,29 ; SD = 0,487 ; CV = 0,49% Kết khảo sát độ xác cho thấy qui trình định lượng polysaccharid mã đề có độ xác cao (CV = 0,49% < 2%), ñáp ứng yêu cầu ñối với phương pháp ñịnh lượng Độ ñúng: Thực cách thêm vào mẫu thử lượng chất chuẩn 100% ± 10% hàm lượng chất có mẫu Bảng Kết khảo sát ñộ ñúng Lượng Lượng Tổng mẫu thêm (µg) lượng (µg) (µg) 207,5 Độ hấp Lượng Tỷ lệ thu tìm thấy phục hồi (%) 0,282 207,5 160 367,5 0,493 150,7 94,1 207,5 160 367,5 0,495 152,1 95,1 207,5 160 367,5 0,498 154,2 96,4 207,5 190 397,5 0,550 191,4 100,8 207,5 190 397,5 0,545 187,8 98,9 207,5 190 397,5 0,546 188,6 99,2 207,5 224 431,5 0,587 217,9 97,3 207,5 224 431,5 0,578 211,4 94,4 207,5 224 431,5 0,590 220 98,2 Trung bình: 97,16 Qui trình định lượng có tỷ lệ phục hồi trung bình 97,16% (ñạt yêu cầu từ 98-102%) Tỷ lệ phục hồi chấp nhận qui trình định lượng dược liệu Kết thẩm ñịnh qui trình cho thấy phương pháp vừa xây dựng ứng dụng để định lượng polysaccharid cao chiết mã đề Hàm lượng polysaccharid Polysaccharid tồn phần có cao chiết tính theo cơng thức sau: AC/AT = CC/CT Trong đó: Nồng độ CC = 400 µg Độ hấp thu mẫu chuẩn AC = 0,543 149 Độ hấp thu mẫu thử AT = 0,568 CT = (0,568 x 400) /0,543 = 418,4 µg Từ CT tính % polysaccharid có cao chiết X = (CT x 25 )x(100/m)/106 25 nồng độ pha lỗng, 106 hệ số đổi µg gam m lượng cân mẫu (1 gam) X= (418,4 x 25) x (100/1) / 106 = 1,046% tính theo cao tồn phần Kết lặp lại lần, lấy số trung bình KẾT LUẬN Phương pháp định lượng polysaccharid tồn phần cao mã đề sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn xây dựng thẩm ñịnh nêu cho thấy với phương pháp tương đối đơn giản, nhanh chóng từ cách xử lý mẫu đến điều kiện phân tích, đảm bảo tính tuyến tính, độ xác Phương pháp hồn tồn áp dụng việc định lượng cao chiết Mã đề, nhằm tiêu chuẩn hóa cơng thức có sử dụng cao Mã đề mục đích ñiều trị TÀI LIỆU THAM KHẢO Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Ng L.T., Lin C.C (2002), Antiviral activity of Plantago major extracts and related compounds in vitro, Antiviral Research, pp 55, 53–62 Đặng Văn Giáp (2003),Trắc nghiệm giả thuyết nghiên cứu khoa học, ĐHYD Tp HCM khoa Dược Lezama R.V., Aguilar R T., Ramos R R., Avila E V., Gutiérrez M P (2006), Effect of Plantago major on cell proliferation in vitro, Journal of Ethnopharmacology, pp 103, 36-42 Olennikov D.N., Tankhaeva L M and Samuelsen A B (2006), Quantitative analysis of polysaccharides from Plantago major leaves using the Dreywood method, Chemisty of Natural Compounds, 42, No 3, pp 265-268 Samuelsen A.B,(2000),The traditional uses, chemical constituents and biological activitives of Plantago major L A review, Journal of Ethnopharmacology, pp 71, 1-21 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc ñộng vật làm thuốc Việt Nam, tập 1,NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.345-349, 419-424 150 ... Qui trình định lượng có tỷ lệ phục hồi trung bình 97,16% (đạt u cầu từ 98-102%) Tỷ lệ phục hồi chấp nhận qui trình định lượng dược liệu Kết thẩm định qui trình cho thấy phương pháp vừa xây dựng. .. số trung bình KẾT LUẬN Phương pháp định lượng polysaccharid tồn phần cao mã ñề sử dụng acid D (+) galacturonic làm chất chuẩn xây dựng thẩm ñịnh nêu cho thấy với phương pháp tương ñối ñơn giản,... tương thích phương trình ý nghĩa hệ số hồi quy cho thấy phương trình hồi quy tuyến tính lượng acid D (+) galacturonic độ hấp thu Y = 0,0014X [2] Khoảng tuyến tính 160 – 560 µg để tính lượng mẫu