Ngải trắng (Curcuma aromatica) là một vị thuốc nam phổ biến ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ với các tác dụng đáng chú ý như kháng viêm, kháng ung thư… Zedoarondiol là một trong những hoạt chất của Ngải trắng có tác dụng kháng viêm. Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định tiêu chuẩn cho dược liệu này. Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng zedoarondiol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và thẩm định.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ZEDOARONDIOL TRONG THÂN RỄ NGẢI TRẮNG (RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Võ Thanh Hóa*, Lê Nữ Huỳnh Như*, Nguyễn Thị Quỳnh Trang*, Nguyễn Đức Hạnh* TÓMTẮT Mở đầu – mục tiêu: Ngải trắng (Curcuma aromatica) vị thuốc nam phổ biến tỉnh miền Tây Nam Bộ với tác dụng đáng ý kháng viêm, kháng ung thư… Zedoarondiol hoạt chất Ngải trắng có tác dụng kháng viêm Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa quy định tiêu chuẩn cho dược liệu Nhằm mục tiêu đánh giá chất lượng dược liệu, quy trình định lượng zedoarondiol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao xây dựng thẩm định Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Các điều kiện khác quy trình xử lý mẫu quy trình sắc ký HPLC sàng lọc chọn lựa Quy trình định lượng zedoarondiol thẩm định tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại độ theo hướng dẫn ICH Kết quả: Phương pháp chuẩn bị mẫu chọn sử dụng dung môi methanol 100% để chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng phương pháp chiết Soxhlet Điều kiện sắc ký HPLC tối ưu bao gồm cột Hypersil gold C18 (250 x 4,6 mm, µm), bước sóng phát 258 nm, nhiệt độ cột 30 oC, tốc độ dòng ml/phút Hỗn hợp acetonitril - nước chọn làm dung môi pha động với tỷ lệ acetonitril 2%, 8%, 16% 18% thời điểm 0-3, 4-8, 9-18 22 - 30 phút Quy trình định lượng đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống Tính tuyến tính ghi nhận khoảng 7,47– 224,1 µg/mL (ŷ = 22,078x, R2=0,997) Độ lặp lại xác định 1,69% Độ đạt yêu cầu với độ phục hồi khoảng 91,02-100,78% Kết luận: Quy trình định lượng zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng phương pháp HPLC xây dựng Quy trình định lượng đạt yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn ICH ứng dụng để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu thân rễ Ngải trắng sản phẩm liên quan Từ khóa: Rhizoma Curcumae aromaticae, zedoarondiol, định lượng, HPLC ABSTRACT ZEDOARONDIOL DETERMINATION FROM RHIZOMA CURCUMAE AROMATICAE BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD Vo Thanh Hoa, Le Nu Huynh Nhu, Nguyen Thi Quynh Trang, Nguyen Duc Hanh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 249-255 Background – Objectives: Ngai trang (Curcuma aromatica) is a popularly medicine material of South Vietnam folk medicine Zedoarondiol, one of the major bioactive compounds of C aromatica, has been reported to possess the anti-inflammatory activity Until now Vietnamese Pharmacopoeia has no monograph on C aromatica The aim of this study was to develop an analytical procedure for zedoarondiol determination from C aromatica by using high performance liquid chromatography (HPLC) method Methods: The sample preparation methods and HPLC conditions were screened and selected The HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines including the specificity, suitability, linearity, precision and accuracy * Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0913576748 Chuyên Đề Dược Email: duchanh@ump.edu.vn 249 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Results: Methanol 100% and Soxhlet extraction were chosen as the best solvent and method for the sample preparation The optimized HPLC condition employed Hypersil Gold C18 column (250 x 4.6 mm; µm), a detection wavelength of 258 nm, a column temperature of 30 oC, a flow rate of ml/min and a mixture of acetonitrile and water as a mobile phase The ratios of acetonitrile were 2%, 8%, 16% and 18% at 0-3 min, 4-8 min, 9-18 and 22 - 30 min, respectively The specificity and system suitability were found to meet the requirements The good correlations between peak areas and concentrations were obtained within a range of 7.47– 224.1 µg/mL (R2 = 0.997) The RSD value of precision and the recovery percentages were found to be at 1.69% and within a range of 91.02 – 100.78%, respectively Conclusions: The analytical procedure for zedoarondiol determination from rhizoma Curcumae aromaticae by using HPLC method has been successfully developed The quantitation method met the requirements of validation and could be useful for establishing the quality standard of rhizoma Curcumae aromaticae and its related products Keywords: Rhizoma Curumae aromaticae, zedoarondiol, quantitation, HPLC ĐẶTVẤNĐỀ ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Ngải trắng (Curcuma aromatica Salisb., Zingiberaceae) thành phần quan trọng thuốc chữa bệnh kinh nguyệt không đều, băng huyết, đau bụng kinh, viêm gan mạn tính, ho gà, sỏi tắc mật, bệnh mạch vành(1), tỉnh An Giang Với tác dụng dược lý quan trọng nêu trên, nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học xác định thành phần hóa học tác dụng dược lý Ngải trắng Zedoarondiol (Hình 1) hoạt chất Ngải trắng có nhiều tác dụng sinh học công bố kháng viêm(5), chống xơ vữa động mạch(3), bảo vệ tế bào gan(4)… Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu quy trình định lượng zedoarondiol dược liệu Vì vậy, đề tài thực nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng (Rhizoma curcumae aromaticae) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), góp phần phục vụ cơng tác kiểm sốt chất lượng dược liệu Đối tượng, nguyên liệu, hóa chất, thiết bị Hình 1: Cơng thức cấu tạo zedoarondiol 250 Thân rễ Ngải trắng (C aromatica) thu hái tỉnh An Giang định danh phương pháp giải trình tự gen Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Chất chuẩn làm việc zedoarondiol (hàm lượng nguyên trạng 98,6%) cung cấp khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Acetonitril (Labscan, Ireland) nước cất đạt yêu cầu HPLC Methanol, ethanol 96% (Labscan, Ireland) đạt yêu cầu phân tích Khảo sát quy trình xử lí mẫu Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol Bột thân rễ Ngải trắng (cân xác khoảng g) chiết xuất thiết bị Soxhlet, sử dụng methanol 100% ethanol 96% điều kiện nhiệt độ 100oC thời gian chiết xuất 120 phút Dịch chiết cô áp suất giảm tới cắn khơ Hòa cắn với methanol 30% cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm định lượng phương pháp HPLC Chọn dung môi chiết nhiều zedoaondiol tạp Khảo sát thời gian chiết Soxhlet Bột thân rễ Ngải trắng (cân xác khoảng g) chiết xuất thiết bị Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Soxhlet, sử dụng dung môi chọn thời gian chiết xuất khảo sát 60, 120 180 phút nhiệt độ 100oC Dịch chiết cô áp suất giảm tới cắn khơ Hòa cắn với methanol 30% cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm định lượng phương pháp HPLC Chọn thời gian khảo sát cho kết chiết xuât thu nhiều zedoaondiol Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng sử dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức), detector UVD 2.1L (Đức), cột sắc ký Hypersil gold C18 (250 mm × 4,6 mm, μm) tiền cột HQ 105 C18 (10 ×4,6 mm; μm) (Thermo Scientific, Mỹ), nhiệt độ cột 30oC, bước sóng phát 258 nm, tốc độ dòng ml/phút thể tích tiêm mẫu 20 μl Thăm dò chương trình gradient pha động sử dụng hỗn hợp acetonitril - nước làm dung môi rửa giải Chọn điều kiện HPLC cho pic zedoarondiol tách hoàn toàn khỏi pic tạp thông số sắc ký đạt yêu cầu Nghiên cứu Y học Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng theo hướng dẫn ICH(2) tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ KẾTQUẢ Khảo sát điều kiện HPLC định lượng zedoarondiol Khảo sát chương trình pha động với tỷ lệ dung mơi acetonitril – nước khác trình bày Bảng Kết khảo sát chương trình pha động trình bày Hình Bảng 1: Các chương trình pha động HPLC định lượng zedoarondiol Chương trình pha động I II III IV Thời gian tỉ lệ dung môi nước: acetonitril - 20 phút (90:10); 27 - 40 phút (10:90) - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (27:73) - 15 phút (98:2); 20 - 40 phút (85 : 15) - phút (98:2); - phút (92:8); - 18 phút (84:16); 22 - 30 phút (82:18) Zedoarondiol Zedaoarondiol Chương trình II Chương trình III Zedoarondio l Zedoarondi ol Chương trình I Chương trình IV Hình 2: Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với chương trình pha động khác Chuyên Đề Dược 251 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Chương trình I, II (Hình 2) cho pic zedoarondiol rửa giải thời gian lưu khoảng 25 phút, nhiên, pic zedoarondiol chưa tách hòa tồn khỏi pic liền trước sau Chương trình III cho pic zedoarondiol tách khỏi tạp, độ phân giải cao Tuy nhiên, thời gian lưu pic zedoarondiol kéo dài khoảng 33 phút Chương trình IV có pic zedoarondiol gọn, cân đối, độ phân giải cao, thời gian lưu khoảng 25 phút, thông số khác pic nằm khoảng cho phép Vì vậy, điều kiện IV chọn để tiến hành thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng Khảo sát quy trình xử lí mẫu Chọn loại dung môi chiết xuất zedoarondiol Bảng 2: Kết khảo sát dung môi chiết zedoarondiol (n=3) STT Dung môi chiết Methanol 100% Ethanol 96% Methanol 100% ethanol 96% chiết zedoarondiol Tuy nhiên, methanol 100% chiết nhiều zedoarondiol ethanol 96% (Bảng 2) Vì vậy, methanol 100% chọn làm dung mơi chiết xuất zedoarondiol từ thân rễ Ngải trắng Khảo sát thời gian chiết Soxhlet Bảng 3: Kết khảo sát thời gian chiết zedoarondiol (n=3) STT Thời gian chiết (phút) 60 120 180 Trung bình diện tích pic zedoarondiol (mAu.s) 1404,922 1699,891 1701,164 60 phút Zedoarondiol Nghiên cứu Y học Trung bình diện tích pic zedoarondiol (mAu.s) 1756,966 1418,551 Ethanol 96% Zedoarondiol 120 phút Zedoarondi ol 180 phút Zedoarondiol Zedoarondi ol Methanol 100% Hình 4: Kết sắc ký đồ HPLC khảo sát thời gian chiết zedoarondiol Hình 3: Sắc ký đồ HPLC khảo sát dung môi chiết zedoarondiol Kết sắc ký HPLC khảo sát thành phần dịch chiết thân rễ Ngải trắng chiết Kết sắc ký HPLC khảo sát thành phần phương pháp Soxhlet, sử dụng dung môi dịch chiết thân rễ Ngải trắng Soxhlet với chọn methanol 100% với thời gian dung môi methanol 100% ethanol 96% chiết khác trình bày Hình 120 phút trình bày Hình 252 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Bảng cho thấy thời gian chiết Soxhlet dài, lượng zedoarondiol thu lớn Tuy nhiên, sau chiết, diện tích pic zedoarondiol thu thay đổi khơng đáng kể (p>0,05) Vì vậy, 120 phút chọn thời gian chiết xuất phù hợp Soxhlet với dung mơi methanol 100% Quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng Mẫu thử Cân xác g bột thân rễ Ngải trắng cho vào bình chiết Soxhlet Tiến hành chiết với methanol 100% 100oC 120 phút Dịch Nghiên cứu Y học Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng Tính tương thích hệ thống Kết khảo sát tính tương thích hệ thống trình bày Bảng Các thơng số thời gian lưu, diện tích pic có RSD% ≤ 2% Hệ số bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu phân tích Vậy, phương pháp xây dựng đạt tính tương thích hệ thống Bảng 4: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Rt S (mAU.s) N (phút) Trung bình 25,461 1723,782 815726 SD 0,029 14,156 2965 RSD (%) 0,114 0,821 0,360 AS RS 0,800 1,980 0,004 0,028 0,544 1,400 chiết cô áp suất giảm tới thu Tính đặc hiệu cắn khơ Hòa tan cắn với methanol 30% Hình cho thấy sắc ký đồ mẫu trắng (dung mơi methanol 30%) khơng có pic xuất khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic zedoarondiol mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu thử có pic có thời gian lưu tương ứng với pic zedoarondiol mẫu chuẩn Khi thêm chuẩn vào mẫu thử chiều cao diện tích pic zedoarondiol mẫu thử tăng lên Độ tinh khiết pic zedoarondiol (trên hệ thống máy HPLC Alliance Water, đầu dò PDA 2969, phần mềm Empower) đạt yêu cầu cho vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ, lọc qua màng lọc 0,22 μm Mẫu đối chiếu Dung dịch chuẩn đối chiếu zedoarondiol nồng độ 100 μg/ml methanol Điều kiện sắc ký HPLC: Điều kiện IV Hàm lượng zedoarondiol (%) thân rễ Ngải trắng đươc tính theo cơng thức sau: X St V CC k SC m 1 h 10000 X: % zedoarondiol dược liệu St, Sc: diện tích pic zedoarondiol dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu Cc: nồng độ zedoarondiol dung dịch đối chiếu (μg/ml) V: thể tích dung dịch thử (ml) Kết khảo sát mối tương quan diện tích pic nồng độ zedoarondiol trình bày Hình Kết xử lý thống kê cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ zedoarondiol khoảng nồng độ 7,47– 224,1 (R2=0,997) Độ lặp lại m: khối lượng cân dược liệu (g) Kết khảo sát độ lặp lại (Bảng 5) cho h: độ ẩm dược liệu thấy %RSD=1,69% < 2% Vì vậy, quy trình đạt k: độ tinh khiết chuẩn yêu cầu độ lặp lại Bảng 5: Kết độ lặp lại STT Rt (phút) Diện tích pic (mAU.s) Chuyên Đề Dược 25,533 1757,0 25,583 1706,4 25,733 1749,1 25,217 1689,5 25,583 1710,2 25,433 1692,1 Trung bình 25,514 1716,9 RSD (%) 0,69 1,69 253 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Mẫu trắng Zedoarondiol Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu thử thêm chuẩn Hình 5: Kết HPLC khảo sát độ đặc hiệu (Rt pic zedoarondiol ≈ 25 phút)Khoảng tuyến tính Nồng độ (µg/ml) 7,47 44,82 89,64 134,46 179,28 224,10 Diện tích pic (mAU.s) 121,6 979,0 1854,3 2927,5 4102,1 4795,2 Hình 6: Tương quan nồng độ diện tích pic zedoarondiol khảo sát độ trình bày Độ Bảng Bảng 6: Kết khảo sát độ Ứng dụng quy trình định lượng để khảo Mức nồng độ Tỷ lệ phục hồi Số liệu thống kê thêm vào (%) sát hàm lượng zedoarondiol mẫu thân 94,27 TB = 96,73 rễ Ngải trắng X thu hái tỉnh An SD = 2,18 80% 97,55 Giang Kết trình bày bảng 100% 120% 98,39 100,78 94,05 94,92 100,69 96,64 91,02 RSD = 2,25% TB = 96,65 SD = 3,77 RSD = 3,91% TB = 96,12 SD = 4,86 RSD = 5,05% Độ tiến hành cách thêm chất chuẩn vào mẫu dược liệu mức 80%, 100% 120% so với nồng độ định lượng zedoarondiol Mỗi mức chuẩn bị mẫu Kết đánh giá dựa vào tỷ lệ phục hồi Kết 254 Bảng 7: Hàm lượng zedoarondiol mẫu X STT Hàm lượng (%) 0,246 0,239 0,245 STT Hàm lượng Trung bình (μg/g) 0,236 TB = 0,241 % 0,239 0,237 BÀNLUẬN Quy trình xử lý mẫu định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng khảo sát dựa yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến lượng zedoarondiol chiết Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 loại dung môi chiết thời gian chiết xuất phương pháp Soxhlet Dung môi methanol 100% chọn làm dung môi chiết xuất cho lượng zedoarondiol chiết nhiều dung mơi ethanol 96% điều kiện chiết xuất Thời gian chiết phương pháp Soxhlet xác định có ảnh hưởng đáng kể kến lượng zedoarondiol chiết Thời gian tốt để xử lý mẫu thử 120 phút với dung môi chọn methanol 100% Tỷ lệ phục hồi phương pháp định lượng khoảng 91,02-100,78% thuộc khoảng cho phép 90 - 107% giá trị %RSD nhỏ 5,3% Vì vậy, quy trình định định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng đạt yêu cầu thẩm định quy trình định lượng KẾTLUẬN Quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng xây dựng thẩm định Kết thẩm định đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại (1,69%) độ với độ phục hồi khoảng 91,02 - 100,78% Quy trình ứng dụng việc Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học định lượng xây dựng tiêu chuẩn thân rễ Ngải trắng, đồng thời liệu quan trọng cho việc xây dựng quy trình định lượng cho sản phẩm liên quan TÀILIỆUTHAMKHẢO Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 391-2 Guideline ICH “Q2A text on validation of Analytical Procedures”, Fed Regist 60 Huimin M, Tianqi T, Dandan S (2016), “Zedoarondiol inhibits platelet-derived growth factor-induced vascular smooth muscle cells proliferation via regulatin AMPactivated protein kinase signaling pathway”, Cell Physiol Biochem, 40, pp 1506-20 Toshio M, Hisashi M (2002), “Potent protective effects of sesquiterpenes and curcumin from Zedoariae rhizoma on liver injury induced by Dgalactosamine/lipopolysaccharide or tumor necrosis factorα”, Biol Pharm Bull, 25 (5), pp 627-31 Woong C, Joo WN, Hyun JK (2009), “Zedoarondiol isolated from the rhizoma of Curcuma heyneana is involved in the inhibition of iNOS, COX-2 and pro-inflammatory cytokines via the down regulation of NF-κB pathway in LPSstimulated murine macrophages”, Int Immunopharmacol, 9, pp 1049-57 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 255 ... quy trình định định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng đạt yêu cầu thẩm định quy trình định lượng KẾTLUẬN Quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng xây dựng thẩm định Kết thẩm định. .. cứu quy trình định lượng zedoarondiol dược liệu Vì vậy, đề tài thực nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng (Rhizoma curcumae aromaticae) phương pháp sắc ký lỏng. .. cứu Y học Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol Thẩm định quy trình định lượng zedoarondiol thân rễ Ngải trắng theo hướng dẫn ICH(2) tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến