XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN và CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG hạ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức đồng nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập làm thực nghiệm sở Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, thầy cô tạo điều kiện suốt trình học tập trường thực luận văn Cuối gửi lời thân thương đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp CH18 bên động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Quế Mai Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… Chương TỔNG QUAN………………………………………… 1.1 Tổng quan đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.1 Đặc điểm đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo……………………………… 1.1.3 Thành phần hóa học đông trùng hạ thảo……………… 1.1.4 Tác dụng đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo………………… 1.2 Tổng quan adenosin, cordycepin…………………………… 1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học………………… 1.2.2 Dược động học cordycepin adenosin…………………… 1.2.3 Tác dụng cordycepin, adenosin………………………… 1.3 Phương pháp xác định cordycepin adenosin……………… 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng……………………………… 1.3.2 Phương pháp đo màu……………………………………… 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản…………………………… 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR………… 1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng…………………………………… 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao……………………… 1.4.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng…………………………… 1.4.2 Một số thông số đặc trưng………………………………… 1.4.3 Ứng dụng…………………………………………………… Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………… 2.2 Hóa chất, dung môi…………………………………………… 2.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu……………………………… 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 2.4.1 Nghiên cứu cách chiết adenosin cordycepin mẫu 2.4.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp…………………… 2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích…………………………… 2.4.4 Áp dụng số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…… Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 3 3 7 10 11 11 12 13 13 13 16 16 18 19 20 20 21 21 22 21 23 24 26 WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………… 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký………………………… 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn………………………………… 3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện…………………… 3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động………………………………… 3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm mẫu………………………………… 3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột……………………………………… 3.2 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu…………………… 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết ………………………………… 3.2.2 Khảo sát số lần chiết…… ………………………………… 3.2.3 Khảo sát phương pháp chiết………………………………… 3.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết……………………………………… 3.2.5 Khảo sát thời gian chiết…………………………………… 3.3 Quy trình phân tích…………………………………………… 3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử………………… 3.3.2 Điều kiện sắc ký…………………………………………… 3.3.3 Đánh giá kết quả…………………………………………… 3.4 Đánh giá phương pháp………………………………………… 3.4.1 Độ thích hợp hệ thống………………………………… 3.4.2 Độ đặc hiệu………………………………………………… 3.4.3 Xây dựng đường chuẩn khoảng nồng độ tuyến tính… 3.4.4 Khảo sát độ xác……………………………………… 3.4.5 Khảo sát độ đúng…………………………………………… 3.4.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)… 3.5 Áp dụng phương pháp phân tích số TPCN chứa ĐTHT 3.5.1 Định tính…………………………………………………… 3.5.2 Định lượng………………………………………………… Chương BÀN LUẬN…………………………………………… KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 26 27 27 27 27 28 30 31 33 33 35 35 37 38 39 39 40 41 41 41 42 47 48 51 53 54 54 56 58 64 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Từ viết tắt ACN AOAC CE DD DMSO ĐTHT EtOH HL HPLC MeOH MS PDA ppm r RSD SD TB TPCN TLC TLTK UV VIS WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Tiếng Anh tên khoa học Acetonitril Association of Official Analytical Chemists Capillary electrophoresis Tiếng Việt Hiệp hội nhà Hóa phân tích Điện di mao quản Dung dịch Dimethyl sulfoxide Đông trùng hạ thảo Ethanol High Performance Liquid Chromatography Methanol Mass spectrometry Photo diode array Parts per million Relative standard deviation Standard deviation Thin layer chromatography Ultraviolet Visible Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú Hàm lượng Sắc ký lỏng hiệu cao Khối phổ Dãy diod quang Phần triệu Hệ số tương quan Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Trung bình Thực phẩm chức Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Tử ngoại Khả kiến WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Độ tan adenosin số dung môi [8]………………… Bảng 1.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin 13 Bảng 2.3 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn………………………………… 20 Bảng 2.4 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng……………………………… 20 Bảng 2.5 Các hóa chất dung môi sử dụng trình thí nghiệm…… 21 Bảng 3.6 Khảo sát thành phần pha động………………………………… 28 Bảng 3.7 Khảo sát chương trình gradient nồng độ………………………… 29 Bảng 3.8 Kết khảo sát số lần chiết (n = 3)…………………………… 35 Bảng 3.9 Kết độ thích hợp hệ thống …………………………… 42 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính tuyến tính nồng độ adenosin, cordycepin diện tích pic………………………………………………… 47 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu R1………… 49 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu L1…… 49 Bảng 3.13 Kết độ xác trung gian …… ……………………… 50 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ mẫu R1…………………………… 52 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ mẫu thử L1………………………… 52 Bảng 3.16 Kết S/N mẫu thêm chuẩn………………………… 53 Bảng 3.17 Kết thời gian lưu pic adenosin cordycepin mẫu thử chuẩn hỗn hợp…………………………………………………………… 55 Bảng 3.18 Kết định lượng mẫu thử……………………………… 57 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu tạo số nucleotid đông trùng hạ thảo [28]…… Hình 1.2 Công thức cấu tạo cordycepin [14]………………………… Hình 1.3 Công thức cấu tạo adenosin [8]…………………………… Hình 1.4 Con đường chuyển hóa adenosin động vật có vú [28] 10 Hình 1.5 Phổ hấp thụ hỗn hợp màu tạo thành với thuốc thử anthron cordycepin, adenosin, glucose deoxyadenosin [15]…… 12 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao………… 18 Hình 3.7 Phổ hấp thụ tử ngoại adenosin (a) cordycepin (b)……… 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40 µl (d)…………………………………………………………………… 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) mẫu thử (c) điều kiện nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) mẫu thử (d) điều kiện nhiệt độ cột 25oC……………………………………………………… 32 Hình 3.10 Kết khảo sát dung môi chiết mẫu R1 (n = 3)… 34 Hình 3.11 Kết khảo sát dung môi chiết mẫu L1 (n = 3)… 34 Hình 3.12 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu R1 (n = 3) 36 Hình 3.13 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu L1 (n = 3) 36 Hình 3.14 Kết khảo sát nhiệt độ chiết mẫu R1 (n = 3)…… 37 Hình 3.15 Kết khảo sát nhiệt độ chiết mẫu L1 (n = 3)…… 37 Hình 3.16 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu R1 (n = 3)… 38 Hình 3.17 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu L1 (n = 3)… 39 Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp……………… 44 Hình 3.19 So phổ adenosin mẫu R1 (A) mẫu L1 (C), so phổ cordycepin mẫu R1 (B) mẫu L1 (D)…………………………… Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 46 WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng chất từ 1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2 phút)………… 47 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (µg/ml) diện tích pic (mAU.s) adenosin (a) cordycepin b)…………………… 48 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn (0,25 µg/ml chất) 54 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……………………………… 55 Hình 3.24: So phổ adenosin (a) cordycepin (b) mẫu thử R2 mẫu chuẩn tương ứng………………………………………………… Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú 56 WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng hạ thảo tên gọi dạng cộng sinh loài nấm có tên khoa học Cordyceps sinensis với ấu trùng loại côn trùng thuộc chi Hepialus, thường gặp sâu non loài Hepialus armoricanus Là loại nấm dược liệu quý từ lâu giới biết đến, đông trùng hạ thảo tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành tứ thần dược Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa coi đông trùng hạ thảo vị thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư Mặt khác nghiên cứu y học cổ truyền đại xác định đông trùng hạ thảo tác dụng phụ thể người Các nghiên cứu Tây y giới khẳng định đông trùng hạ thảo không nâng cao hiệu hệ miễn dịch giải độc thận, tăng cường chức gan, khả tình dục [2] Đông trùng hạ thảo có 350 loài khác nhiên hai loài người ta sâu nghiên cứu đưa vào nuôi trồng Cordyceps sinensis Cordyceps militaris [2] Việc sử dụng ngày nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo đòi hỏi cần có phương pháp đánh giá chất lượng chúng Dược điển Trung Quốc 2010 đưa chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ thảo Cordyceps viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng adenosin [30] Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin cao chưa đánh giá Hiện Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai thành phần dược liệu chế phẩm vô cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin cordycepin chế Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu R3 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu R4 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu R5 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu R6 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu L3 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu L4 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu L5 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Mẫu L6 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON PHỤ LỤC D HÌNH ẢNH CHỒNG PHỔ PIC ADENOSIN, CORDYCEPIN MỘT SỐ MẪU THỬ Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L3 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R5 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R6 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L5 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L4 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L6 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON PHỤ LỤC E: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHUẨN Chuẩn adenosin Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Chuẩn cordycepin Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM ... WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON phẩm chứa đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin cordycepin chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG... [7], [23], [25], [37] 1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo Hiện thống kê có chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo bán thị trường Đông trùng hạ thảo đưa vào chế phẩm thành phần kết hợp với số