Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức năng và các đồng nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức năng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm thực nghiệm tại cơ sở

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này

Cuối cùng tôi gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp CH18 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm

2015

Học viên

Nguyễn Thị Quế Mai

MỤC LỤC

Trang MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Tổng quan về đông trùng hạ thảo……… 3

1.1.1 Đặc điểm của đông trùng hạ thảo……… 3

1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo……… 3

1.1.3 Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo……… 4

1.1.4 Tác dụng của đông trùng hạ thảo……… 5

1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo……… 7

1.2 Tổng quan về adenosin, cordycepin………

7 1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học……… 7

1.2.2 Dược động học cordycepin và adenosin……… 9

1.2.3 Tác dụng của cordycepin, adenosin……… 10

1.3 Phương pháp xác định cordycepin và adenosin……… 11

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng……… 11

1.3.2 Phương pháp đo màu……… 12

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản……… 13

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR…………

13 1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng……… 13

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……… 16

1.4.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng……… 16

1.4.2 Một số thông số đặc trưng……… 18

1.4.3 Ứng dụng……… 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 20

2.2 Hóa chất, dung môi……… 21

2.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu……… 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu……… 22

2.4.1 Nghiên cứu các cách chiết adenosin và cordycepin trong mẫu 21 2.4.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp……… 23

2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích……… 24

2.4.4 Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…… 26

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu……… 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 27

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký……… 27

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn……… 27

3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện……… 27

3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động……… 28

3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm mẫu……… 30

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột……… 31

3.2 Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu……… 33

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết ……… 33

3.2.2 Khảo sát số lần chiết…… ……… 35

3.2.3 Khảo sát phương pháp chiết……… 35

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết……… 37

3.2.5 Khảo sát thời gian chiết……… 38

3.3 Quy trình phân tích……… 39

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử……… 39

3.3.2 Điều kiện sắc ký……… 40

3.3.3 Đánh giá kết quả……… 41

3.4 Đánh giá phương pháp……… 41

3.4.1 Độ thích hợp của hệ thống……… 41

3.4.2 Độ đặc hiệu……… 42

3.4.3 Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính… 47

3.4.4 Khảo sát độ chính xác……… 48

3.4.5 Khảo sát độ đúng……… 51

3.4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)… 53

3.5 Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa ĐTHT 54 3.5.1 Định tính……… 54

3.5.2 Định lượng……… 56

Chương 4 BÀN LUẬN……… 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

PDA Photo diode array Dãy diod quang

ppm Parts per million Phần triệu

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]……… 9

Bảng 1.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin 13 Bảng 2.3 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn……… 20

Bảng 2.4 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng……… 20

Bảng 2.5 Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm…… 21

Bảng 3.6 Khảo sát thành phần pha động……… 28

Bảng 3.7 Khảo sát chương trình gradient nồng độ……… 29

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát số lần chiết (n = 3)……… 35

Bảng 3.9 Kết quả độ thích hợp của hệ thống ……… 42

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic……… 47

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1………… 49

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1…… 49

Bảng 3.13 Kết quả độ chính xác trung gian …… ……… 50

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1……… 52

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1……… 52

Bảng 3.16 Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn……… 53

Bảng 3.17 Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử và chuẩn hỗn hợp……… 55

Bảng 3.18 Kết quả định lượng các mẫu thử……… 57

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang Hình 1.1 Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]…… 5 Hình 1.2 Công thức cấu tạo cordycepin [14]……… 8 Hình 1.3 Công thức cấu tạo adenosin [8]……… 8 Hình 1.4 Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28] 10 Hình 1.5 Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron

của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]…… 12 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao………… 18 Hình 3.7 Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)……… 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện

nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện

nhiệt độ cột 25oC……… 32 Hình 3.10 Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)… 34 Hình 3.11 Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3)… 34 Hình 3.12 Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3) 36 Hình 3.13 Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3) 36 Hình 3.14 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…… 37 Hình 3.15 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…… 37 Hình 3.16 Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3)… 38 Hình 3.17 Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3)… 39 Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp……… 44 Hình 3.19 So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ

cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)……… 46

Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ

1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2

phút)………… 47 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện

tích pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin b)……… 48 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất) 54 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……… 55 Hình 3.24: So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và

mẫu chuẩn tương ứng……… 56

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đông trùng hạ thảo là tên gọi một dạng cộng sinh giữa loài nấm có tên

khoa học là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loại côn trùng thuộc chi

Hepialus, thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus

Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến, đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành bộ tứ thần dược Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi đông trùng hạ thảo là vị thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư Mặt khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người Các nghiên cứu Tây y trên thế giới đều khẳng định đông trùng hạ thảo không chỉ nâng cao hiệu quả

hệ miễn dịch còn giải độc thận, tăng cường chức năng gan, khả năng tình dục [2] Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính

người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis và

Cordyceps militaris [2]

Việc sử dụng ngày càng nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo đòi hỏi cần có các phương pháp đánh giá chất lượng chúng Dược điển Trung Quốc 2010 mới chỉ đưa ra chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ

thảo Cordyceps và viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng là adenosin [30] Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin

khá cao chưa được đánh giá Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo cũng như chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai thành phần này trong dược liệu và chế phẩm là vô cùng cần thiết

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế

phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu sau:

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm chứa đông trùng

hạ thảo đang lưu hành trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đông trùng hạ thảo:

1.1.1 Đặc điểm của đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dược quý có bản chất là

dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm

Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi Thitarodes

trước đây phân loại trong chi Hepialus

Tên gọi “đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung dongchungxiacao) xuất phát từ

quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Ophiocordyceps sinensis mọc chồi

từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất Vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật Dược liệu đông trùng hạ thảo thu hái gồm phần sâu non dài 2,5 – 3 cm, đường kính 3 – 5 mm màu vàng nâu hay xám nâu Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân ở giữa thân sâu là trông rõ nhất Thân nấm hình trụ mọc ra từ đầu con sâu, thân nấm thường dài 3 – 6 cm Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô Nấm quả thể

thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh Cơ chế nhiễm nấm C sinensis

vào sâu hiện nay chưa biết rõ Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu Nấm phát triển bằng chất dinh dưỡng của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng của sâu làm sâu chết khô Đến mùa

hè nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất Thời gian

để nấm phát triển thành dạng quả thể trong cơ thể sâu kéo dài từ các tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè Tại Trung Quốc, đông trùng hạ thảo thường gặp ở vùng rừng ẩm ướt thuộc các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng

và nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [2], [4]

1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo

Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã

tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài được nghiên cứu nhiều nhất và

đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và Cordyceps militaris

(L ex Fr) Link [2], [29], [30]

1.1.3 Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các ribonucleotid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2, B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong

đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin analogs)

a Các nucleotid:

Các nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong đông trùng

hạ thảo, trong đó adenosin, cordycepin được sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lượng của đông trùng hạ thảo Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa vào các hợp chất có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này không thể tìm thấy ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên

b Các polysaccharid

Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của đông trùng hạ thảo Bản đồ saccharid của dược liệu này có vai trò trong đánh giá chất lượng Một số monosaccharid có trong đông trùng hạ thảo như rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…

Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin như cadaverin, spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [25], [37]

Hình 1.1 Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]

1.1.4 Tác dụng của đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765) Theo tài liệu cổ, đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích

phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh

a Tác dụng tăng cường sức khỏe

Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm quá trình peroxide lipid do đó có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng, tuổi tác

b Tác dụng miễn dịch

Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh đông trùng hạ thảo có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể Cụ thể là tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên (natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh

c Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase

d Tác dụng chống ung thư

Thành phần polysaccharides trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan (1

3)-β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u

do hai cơ chế: (1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể [9]

e Tác dụng chống viêm

Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm như gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát triển của bạch cầu

f Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan

Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm các triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng, các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH [7], [23], [25], [37]

1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo được bán trên thị trường Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, tổ yến Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang, viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng) Có thể kể tên một vài chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:

- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken, bột Cordyceps extract…

- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước cốt gà Đông trùng hạ thảo…

1.2 Tổng quan về adenosin, cordycepin

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucosid [14], [33]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo adenosin [8]

Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin

Công thức phân tử: C10H13N5O4

Trọng lượng phân tử: 267,24

Adenosin dạng bột tinh thể màu trắng

Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235oC

Độ tan:

Bảng 1.1 Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]

Dung môi Độ tan (mg/ml)

1.2.2 Dược động học cordycepin và adenosin

Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển hóa tương tự Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài

tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase tạo thành ATP Nếu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi adenosin deaminase trong tế bào Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận Tương tự như vậy, cordycepin cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo

hypoxanthinosin [28]

Hình 1.4 Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28]

1.2.3 Tác dụng của cordycepin, adenosin

a Tác dụng của cordycepin

* Ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN và tín hiệu mTOR

Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và

5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin

Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN, enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN Các nghiên cứu cũng chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền, sinh trưởng phát triển tế bào [17]

* Tác dụng chống sự di căn

Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, xâm lấn vào các khối ngoại bào khác Cordycepin có tác dụng ức chế các enzyme metalloproteinase (bản chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và calci, vai trò chính trong phân hủy tổ chức ngoại bào) [10]

* Tác dụng chống viêm

Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan đến quá trình ung thư Các tế bào ung thư sinh nhiều cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các

chất này gây ra phản ứng viêm Cordycepin được cho rằng làm giảm các tác nhân gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β [33]

* Tác dụng giảm đường huyết:

Li Ma và cộng sự nghiên cứu tác dụng cordycepin trên chuột gây tiểu đường bởi alloxan Kết quả cho thấy cordycepin không làm tăng nồng độ insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng làm tăng nồng độ glycogen tại gan Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường [22]

* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương

Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosin có tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái hóa thần kinh…[11], [27]

1.3 Phương pháp xác định cordycepin và adenosin

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

MA King Wah và các cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7

nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa đông

trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ sấy 8 phút ở 60oC để hoạt hóa Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform: ethylacetat : isopropanol : nước (8 : 2 : 6 : 0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac cho mỗi 10 ml hỗn hợp Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai

9 cm trong hỗn hợp dung môi cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước : dimethylfomamid (10 : 2 : 8 : 0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại bước sóng 254 nm Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09%, độ thu hồi của adenosin là 97,88% [21]

1.3.2 Phương pháp đo màu

Nicholas M Kredich và Armand J Guarino đã nghiên cứu chỉ ra phương pháp đo màu định lượng cordycepin sử dụng thuốc thử anthron để tạo hợp chất

có màu đỏ cherry 5,0 ml thuốc thử anthron (0,2 g anthron trong 100 ml H2SO4 90%) phản ứng với 1,0 ml dung dịch thử có lượng cordycepin từ 1 – 135 μg/ml, trộn đều và đặt trong nước đá Mẫu trắng tiến hành tương tự thay 1,0 ml nước cho 1,0 ml dung dịch thử Sau đó các ống nghiệm được đặt trên cách thủy 100oC trong 10 phút, làm nguội, đo màu bằng thiết bị đo màu sử dụng kính lọc số 52, hỗn hợp màu tạo thành bền sau vài giờ phản ứng [15]

Hình 1.5 Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã định tính và định lượng cordycepin

trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện:

dung dịch đệm borat 0,02 M với 28,6% methanol, pH = 9,5, điện thế 20 kV, nhiệt độ 25oC, bước sóng 254 nm Đường chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/ml,

độ thu hồi từ 82% đến 107% [24]

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR

Seul Gi Lee và cộng sự đã định lượng cordycepin trong Cordyceps

militaris bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sử dụng chất chuẩn

nội muối natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4 Các tác giả so sánh phương pháp định lượng này với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy không có sự khác biệt kết quả định lượng cordycepin giữa 2 phương pháp này [18].

[34]

B: acetonitril có 0,1% acid acetic

0 – 2,5 phút: 2% B 2,5 – 12,5 phút: 2 – 12% B

Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7 nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD

Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B (đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat 0,02M) Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml Độ thu hồi của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% [36] Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính trong

Cordyceps sinensis (thymin, adenine, adenosin, cordycepin) bằng phương pháp

sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS Phương pháp sử dụng pha động A (amoni acetat 0,04M pH 5,2) và B (methanol) Đường chuẩn cordycepin xây dựng từ 0,5 – 107,5 μg/ml, adenosin 0,6 – 114,0 μg/ml Độ thu hồi của cordycepin 99,3 – 104,0%, độ thu hồi adenosin 98,0 – 101,5% [34]

Lei Huang và đồng nghiệp đã nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện phân tích

adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT loài C sinensis và C militaris

Phương pháp cho kết quả pha động tối ưu methanol và nước tỷ lệ 92 : 8, bước sóng phát hiện 254 nm Đường chuẩn của cordycepin được xây dựng từ 2,85 đến 130 μg/ml, của adenosin từ 2,50 – 120 μg/ml, giới hạn phát hiện cordycepin

là 0,25 μg/ml, của adenosin là 0,30 μg/ml [12]

Jiang – Feng Song cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu tối ưu cách chiết xuất

cordycepin từ loài Cordyceps militaris bằng phần mềm tối ưu hóa, phân tích

bằng phương pháp sắc ký lỏng Pha động sử dụng A (nước có 0,1% acid acetic)

và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient Kết quả tối ưu hóa chiết xuất cho điều kiện chiết: dung môi chiết ethanol 20,21%, thời gian chiết 101,88 phút, tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu: 33,13 ml/g [26]

Li Yu và đồng nghiệp đã nghiên cứu định lượng đồng thời 11 nucleosid trong dược liệu ĐTHT được thu hái tại Trung Quốc Pha động sử dụng dung môi methanol và nước theo chương trình gradient Mẫu dược liệu được chiết tách bằng dung môi methanol 70% theo phương pháp siêu âm 15 phút ở nhiệt

độ phòng Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với adenosin và cordycepin

là 0,057 và 0,099 µg/ml [35]

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ

a Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:  

- Si-O-Si -R  

Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl

và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau, thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế Cột thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10m Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào

ứng dụng rộng rãi Trong UPLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 m) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm)

b Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt Pha động có hai loại phân cực và ít phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường

- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa

Ngoài ra còn tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối (MS) trong đó detector chuỗi diode (PDA) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký

d Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu

W1/2: độ rộng pic ở ½ chiều cao pic

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau Độ phân giải giữa 2 píc (píc số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:

W: Độ rộng đáy píc

W1/2: Độ rộng đáy pic ở ½ chiều cao pic

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

Hệ số bất đối AF (assymetry factor)

AF = 𝑊1/20

2𝑎

Trong đó:

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic [3]

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng:

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại

- Phương pháp dùng chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích [3]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chất chuẩn: Adenosin (Adenosin 100%, chất chuẩn Sigma Aldrich prodruct code: A9251, lot: SLBG2403V); cordycepin (Cordycepin from Cordyceps militaris 99,0% chất chuẩn Sigma Aldrich, product code: C3394, lot: 043M4030V)

- Chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo:

Mẫu dạng rắn:

Bảng 2.3 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn

STT Tên mẫu Số lô Hạn dùng Công ty sản

xuất/công ty phân phối

Mẫu R1 Pure cordyceps 152501 01/01/2017 Công ty Medinam Mẫu R2 Cordypower

capsule

150315 01/03/2017 Công ty Mushtech

Việt Nam Mẫu R3 Pure cordyceps

Mẫu R5 Bột ĐTHT sấy

khô

010515 Tháng 5/2018 Công ty dược thảo

Thiên Phúc Mẫu R6 Hong-cho gold Tháng 1/2017 Công ty dược phẩm

Đông Á Mẫu dạng lỏng:

Bảng 2.4 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng

STT Tên mẫu Số lô Hạn dùng Công ty sản

xuất/công ty phân phối

Mẫu L4 Trùng thảo nhân

sâm Cordyceps

pao sam extract

Tháng 1/2018

(Malaysia) Mẫu L5 Cordyceps extract 010315TC Tháng

3/2018

Công ty Sunchag Xingfulai Health Products Co Ltd Mẫu L6 Korea silkworm

cordyceps

CS7615 Tháng

3/2017

Công ty TNHH kinh Doanh thực phẩm

An Minh

- Mẫu placebo dạng rắn (placebo 1): bao gồm các thành phần sau trộn đồng lượng

Bột dược liệu nhân sâm

Bột dược liệu tam thất

Bột tổ yến

- Mẫu placebo dạng lỏng (placebo 2): bao gồm các thành phần sau trộn đồng lượng:

Dịch chiết xuất nhân sâm (hàm lượng ginsenosid tổng 5% kl/tt)

Dịch chiết xuất tam thất (hàm lượng notoginsenosid R1 5% kl/tt)

Nước yến ngân nhĩ (0,007g/L)

2.2 Hóa chất, dung môi

Bảng 2.5 Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm

TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Ethanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

2 Methanol Merck, Đức Dùng cho HPLC

3 Methanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

4 Acetonitril Merck, Đức Dùng cho HPLC

5 Nước cất 2 lần Việt Nam Dùng cho HPLC

2.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 (Nhật) với detector PDA, phần mềm điều khiển EZChromlite

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Cân kỹ thuật Shimadzu (Nhật)

- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức)

- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức)

- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức)

- Bộ lọc hút chân không

- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, màng lọc mẫu (syringe filter), sinh hàn hồi lưu…

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý phân tích: Mẫu được chiết theo phương pháp thích hợp, dịch chiết được định mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống HPLC, ghi lại sắc ký đồ

Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp HPLC

2.4.1 Nghiên cứu chiết adenosin và cordycepin trong mẫu

Quy trình xử lý mẫu:

- Đồng nhất mẫu

- Cân chính xác lượng mẫu thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu dạng rắn) hoặc bình định mức (đối với mẫu dạng lỏng), thêm dung môi chiết

- Chiết mẫu theo cách thích hợp

- Đối với mẫu dạng rắn: ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch Chiết lặp mẫu với dung môi trên Gộp dịch chiết mẫu, thêm dung môi chiết vừa đủ đến vạch, lắc đều

Đối với mẫu dạng lỏng: thêm dung môi chiết vừa đủ đến vạch, lắc đều,

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm

- Tiêm vào hệ thống sắc ký

a Khảo sát các phương pháp chiết:

Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu cách thủy

b Khảo sát điều kiện chiết:

- Dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nước – ethanol, nước – methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp nhất Trên cùng một nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với các loại dung môi tỷ lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình -Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút,

120 phút

- Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết quả giữa các mẫu

- Khảo sát nhiệt độ chiết: cùng một nền mẫu, chiết theo một phương pháp siêu

âm, khảo sát nhiệt độ thường, 40oC, 50oC, 75oC, 100oC Mỗi mức nhiệt độ làm

3 lần, lấy kết quả trung bình để đánh giá

2.4.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 detector PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin:

- Khảo sát thành phần pha động: nước và methanol, nước và acetonitril

- Khảo sát tỷ lệ pha động

- Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện

- Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu

- Khảo sát nhiệt độ cột

Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê

Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của

2 pic adenosin và cordycepin

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, 2 pic adenosin và cordycepin tách nhau hoàn toàn, hệ số phân giải Rs > 2

2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích

Chiết mẫu nghiên cứu theo cách chiết đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

* Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị

ở trên, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic

Yêu cấu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤ 2,0%,

hệ số phân giải Rs >2

* Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn hỗn hợp, chuẩn đơn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ Trên sắc ký đồ mẫu placebo phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hai chất chuẩn

* Tính tuyến tính: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X)

Xây dựng đường chuẩn 6 điểm X1 đến X6 của dung dịch chứa chất chuẩn adenosin, cordycepin ở trong khoảng nồng độ phù hợp Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ từng chất và diện tích pic chất đó

Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,995

* Khảo sát độ chính xác:

Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định

- Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Tiến hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây

dựng, tiêm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ Xác định độ lệch tương đối RSD% của hàm lượng mỗi hoạt chất

- Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào ngày khác nhau Yêu cầu: RSD đối với mỗi hoạt chất không lớn hơn 5,3% [6] đối với 18 mẫu tiến hành vào 3 ngày khác nhau

* Khảo sát độ đúng: Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm thu được với giá trị thực của kết quả

Tiến hành: cân chính xác lượng mẫu thử thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu rắn) và bình định mức (đối với mẫu lỏng), thêm lượng chuẩn hỗn hợp thích hợp sao cho tổng hàm lượng mỗi chất trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính, thêm dung môi, chiết mẫu theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây dựng Tiến hành ở 3 mức nồng độ, mỗi nồng độ làm 3 lần Tiêm dung dịch thử thêm chuẩn vào hệ thống sắc ký, xác định hàm lượng mỗi hoạt chất Độ đúng xác định bằng

hệ số thu hồi lượng chuẩn tìm được so với lượng chuẩn thêm vào

Yêu cầu: độ thu hồi nằm trong khoảng 90 – 107% đối với mẫu hàm lượng hoạt chất ≥ 0,01% [6]

* Giới hạn phát hiện (LOD):

Giới hạn phát hiện là hàm lượng thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện

về mặt định tính

Cách xác định: chuẩn bị các dung dịch placebo 1, placebo 2, thêm các dung dịch chuẩn pha loãng vào các mẫu placebo được các dung dịch có hàm lượng khoảng 0,5, 0,25, 0,2, 0,1 µg/ml mỗi chất, tiến hành sắc ký, xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu nền (S/N) S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, bề rộng mỗi bên tối thiều gấp 10 lần chiều rộng của pic tại ½ chiều cao LOD xác định tại nồng độ

có tỷ lệ S/N bằng 3 [5]

* Giới hạn định lượng (LOQ): được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [5]

2.4.4 Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

- Thu thập một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn

- Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theo quy trình đã xây dựng

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc adenosin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn

adenosin vào bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu

âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung dịch 1) bảo quản

ở 2- 8oC dùng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn adenosin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc

adenosin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50,0 ml thu được dung dịch chuẩn adenosin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20 µg/ml

- Dung dịch chuẩn gốc cordycepin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chất chuẩn cordycepin vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung dịch 2), bảo quản ở 2 -8oC dùng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn cordycepin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc cordycepin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50 ml thu được dung dịch chuẩn cordycepin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20 µg/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch gốc cordycepin và 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc adenosin cho vào bình định mức 50,0 ml, thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH được dung dịch chuẩn hỗn hợp có hàm lượng mỗi chất khoảng 20 µg/ml

3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện:

Qua tham khảo các tài liệu với điều kiện của phòng thí nghiệm và thực nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích lần lượt dung dịch chuẩn adenosin và cordycepin nồng độ khoảng 20 µg/ml trên hệ thống HPLC, detector PDA với các điều kiện như sau:

- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

- Detector PDA bước sóng 190 – 400 nm

- Pha động: MeOH : H2O (1:1 tt/tt)

Hình 3.7 Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)

3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động

- Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký…

- Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: Kênh A là H2O, kênh

B là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác Quá trình khảo sát cho kết quả như sau:

Bảng 3.6 Khảo sát thành phần pha động

Thành phần pha động (92: 8) Thời gian lưu (phút)

Nhận xét: Mặc dù chương trình chạy sử dụng H2O và ACN cho pic đẹp, gọn nhưng thời gian lưu ngắn < 7 phút, do vậy có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt chất trong thành phần khác của mẫu thử Mặt khác hệ số phân giải của pha động

sử dụng ACN là 2,5 nhỏ hơn so với pha động sử dụng MeOH và H2O, đồng thời sử dụng dung môi ACN tốn kém hơn Vì vậy, chúng tôi sử dụng thành phần pha động gồm methanol và nước, tiến hành khảo sát chương trình gradient

tỷ lệ thành phần pha động

- Tiến hành chạy 3 chương trình gradient, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7 Khảo sát chương trình gradient nồng độ

Chương trình

gradient 1

Chương trình gradient 2

Chương trình gradient 3

Thời gian (phút)

MeOH (%)

H2O (%)

Thời gian (phút)

MeOH (%)

H2O (%)

3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm mẫu

Tiến hành khảo sát trên dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký như sau, thể tích tiêm mẫu thay đổi các giá trị: 5 µl, 10 µl, 20 µl, 40 µl

40 µl pic hai chất đều bị chẻ đôi Do đó chúng tôi lựa chọn thể tích tiêm mẫu

10 µl đảm bảo pic sắc ký cân đối, đảm bảo độ chính xác buồng tiêm mẫu

Đối tượng khảo sát:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin hàm lượng 20 µg/ml

- Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,50 g bột mẫu R1 vào ống ly tâm, thêm khoảng 15 ml MeOH, siêu âm 30 phút, ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 5