Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức đồng nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập làm thực nghiệm sở Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, thầy cô tạo điều kiện suốt trình học tập trường thực luận văn Cuối gửi lời thân thương đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp CH18 bên động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Quế Mai MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… Chương TỔNG QUAN………………………………………… 1.1 Tổng quan đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.1 Đặc điểm đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo……………………………… 1.1.3 Thành phần hóa học đông trùng hạ thảo……………… 1.1.4 Tác dụng đông trùng hạ thảo…………………………… 1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo………………… 1.2 Tổng quan adenosin, cordycepin…………………………… 1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học………………… 1.2.2 Dược động học cordycepin adenosin…………………… 1.2.3 Tác dụng cordycepin, adenosin………………………… 1.3 Phương pháp xác định cordycepin adenosin……………… 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng……………………………… 1.3.2 Phương pháp đo màu……………………………………… 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản…………………………… 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR………… 1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng…………………………………… 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao……………………… 1.4.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng…………………………… 1.4.2 Một số thông số đặc trưng………………………………… 1.4.3 Ứng dụng…………………………………………………… Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………… 2.2 Hóa chất, dung môi…………………………………………… 2.3 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu……………………………… 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 2.4.1 Nghiên cứu cách chiết adenosin cordycepin mẫu 2.4.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp…………………… 2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích…………………………… 2.4.4 Áp dụng số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…… 3 3 7 10 11 11 12 13 13 13 16 16 18 19 20 20 21 21 22 21 23 24 26 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………… 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký………………………… 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn………………………………… 3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện…………………… 3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động………………………………… 3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm mẫu………………………………… 3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột……………………………………… 3.2 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu…………………… 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết ………………………………… 3.2.2 Khảo sát số lần chiết…… ………………………………… 3.2.3 Khảo sát phương pháp chiết………………………………… 3.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết……………………………………… 3.2.5 Khảo sát thời gian chiết…………………………………… 3.3 Quy trình phân tích…………………………………………… 3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn dung dịch thử………………… 3.3.2 Điều kiện sắc ký…………………………………………… 3.3.3 Đánh giá kết quả…………………………………………… 3.4 Đánh giá phương pháp………………………………………… 3.4.1 Độ thích hợp hệ thống………………………………… 3.4.2 Độ đặc hiệu………………………………………………… 3.4.3 Xây dựng đường chuẩn khoảng nồng độ tuyến tính… 3.4.4 Khảo sát độ xác……………………………………… 3.4.5 Khảo sát độ đúng…………………………………………… 3.4.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ)… 3.5 Áp dụng phương pháp phân tích số TPCN chứa ĐTHT 3.5.1 Định tính…………………………………………………… 3.5.2 Định lượng………………………………………………… Chương BÀN LUẬN…………………………………………… KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 26 27 27 27 27 28 30 31 33 33 35 35 37 38 39 39 40 41 41 41 42 47 48 51 53 54 54 56 58 64 Từ viết tắt ACN AOAC CE DD DMSO ĐTHT EtOH HL HPLC MeOH MS PDA ppm r RSD SD TB TPCN TLC TLTK UV VIS Tiếng Anh tên khoa học Acetonitril Association of Official Analytical Chemists Capillary electrophoresis Tiếng Việt Hiệp hội nhà Hóa phân tích Điện di mao quản Dung dịch Dimethyl sulfoxide Đông trùng hạ thảo Ethanol High Performance Liquid Chromatography Methanol Mass spectrometry Photo diode array Parts per million Relative standard deviation Standard deviation Thin layer chromatography Ultraviolet Visible Hàm lượng Sắc ký lỏng hiệu cao Khối phổ Dãy diod quang Phần triệu Hệ số tương quan Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Trung bình Thực phẩm chức Sắc ký lớp mỏng Tài liệu tham khảo Tử ngoại Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Độ tan adenosin số dung môi [8]………………… Bảng 1.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin 13 Bảng 2.3 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn………………………………… 20 Bảng 2.4 Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng……………………………… 20 Bảng 2.5 Các hóa chất dung môi sử dụng trình thí nghiệm…… 21 Bảng 3.6 Khảo sát thành phần pha động………………………………… 28 Bảng 3.7 Khảo sát chương trình gradient nồng độ………………………… 29 Bảng 3.8 Kết khảo sát số lần chiết (n = 3)…………………………… 35 Bảng 3.9 Kết độ thích hợp hệ thống …………………………… 42 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính tuyến tính nồng độ adenosin, cordycepin diện tích pic………………………………………………… 47 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu R1………… 49 Bảng 3.12 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu L1…… 49 Bảng 3.13 Kết độ xác trung gian …… ……………………… 50 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ mẫu R1…………………………… 52 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ mẫu thử L1………………………… 52 Bảng 3.16 Kết S/N mẫu thêm chuẩn………………………… 53 Bảng 3.17 Kết thời gian lưu pic adenosin cordycepin mẫu thử chuẩn hỗn hợp…………………………………………………………… 55 Bảng 3.18 Kết định lượng mẫu thử……………………………… 57 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu tạo số nucleotid đông trùng hạ thảo [28]…… Hình 1.2 Công thức cấu tạo cordycepin [14]………………………… Hình 1.3 Công thức cấu tạo adenosin [8]…………………………… Hình 1.4 Con đường chuyển hóa adenosin động vật có vú [28] 10 Hình 1.5 Phổ hấp thụ hỗn hợp màu tạo thành với thuốc thử anthron cordycepin, adenosin, glucose deoxyadenosin [15]…… 12 Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao………… 18 Hình 3.7 Phổ hấp thụ tử ngoại adenosin (a) cordycepin (b)……… 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40 µl (d)…………………………………………………………………… 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) mẫu thử (c) điều kiện nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) mẫu thử (d) điều kiện nhiệt độ cột 25oC……………………………………………………… 32 Hình 3.10 Kết khảo sát dung môi chiết mẫu R1 (n = 3)… 34 Hình 3.11 Kết khảo sát dung môi chiết mẫu L1 (n = 3)… 34 Hình 3.12 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu R1 (n = 3) 36 Hình 3.13 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu L1 (n = 3) 36 Hình 3.14 Kết khảo sát nhiệt độ chiết mẫu R1 (n = 3)…… 37 Hình 3.15 Kết khảo sát nhiệt độ chiết mẫu L1 (n = 3)…… 37 Hình 3.16 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu R1 (n = 3)… 38 Hình 3.17 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu L1 (n = 3)… 39 Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp……………… 44 Hình 3.19 So phổ adenosin mẫu R1 (A) mẫu L1 (C), so phổ cordycepin mẫu R1 (B) mẫu L1 (D)…………………………… 46 Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng chất từ 1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2 phút)………… 47 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (µg/ml) diện tích pic (mAU.s) adenosin (a) cordycepin b)…………………… 48 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn (0,25 µg/ml chất) 54 Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……………………………… 55 Hình 3.24: So phổ adenosin (a) cordycepin (b) mẫu thử R2 mẫu chuẩn tương ứng………………………………………………… 56 ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng hạ thảo tên gọi dạng cộng sinh loài nấm có tên khoa học Cordyceps sinensis với ấu trùng loại côn trùng thuộc chi Hepialus, thường gặp sâu non loài Hepialus armoricanus Là loại nấm dược liệu quý từ lâu giới biết đến, đông trùng hạ thảo tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành tứ thần dược Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa coi đông trùng hạ thảo vị thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư Mặt khác nghiên cứu y học cổ truyền đại xác định đông trùng hạ thảo tác dụng phụ thể người Các nghiên cứu Tây y giới khẳng định đông trùng hạ thảo không nâng cao hiệu hệ miễn dịch giải độc thận, tăng cường chức gan, khả tình dục [2] Đông trùng hạ thảo có 350 loài khác nhiên hai loài người ta sâu nghiên cứu đưa vào nuôi trồng Cordyceps sinensis Cordyceps militaris [2] Việc sử dụng ngày nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo đòi hỏi cần có phương pháp đánh giá chất lượng chúng Dược điển Trung Quốc 2010 đưa chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ thảo Cordyceps viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng adenosin [30] Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin cao chưa đánh giá Hiện Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai thành phần dược liệu chế phẩm vô cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin cordycepin chế Mẫu R3 Mẫu R4 Mẫu R5 Mẫu R6 Mẫu L3 Mẫu L4 Mẫu L5 Mẫu L6 PHỤ LỤC D HÌNH ẢNH CHỒNG PHỔ PIC ADENOSIN, CORDYCEPIN MỘT SỐ MẪU THỬ Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L3 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R5 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R6 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L5 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L4 Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L6 PHỤ LỤC E: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHUẨN Chuẩn adenosin Chuẩn cordycepin [...].. .phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo đang lưu hành trên thị trường... cao lỏng) Có thể kể tên một vài chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau: - Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken, bột Cordyceps extract… - Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước cốt gà Đông trùng hạ thảo 1.2 Tổng quan về adenosin, cordycepin 1.2.1 Công thức... b Định lượng Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép định lượng Các phương pháp định lượng có thể áp dụng: - Phương pháp dùng chuẩn ngoại - Phương pháp dùng chuẩn nội - Phương pháp thêm chuẩn - Phương pháp chuẩn hóa diện tích [3] Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG... 1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.4.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được... 1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo được bán trên thị trường Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, tổ yến Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang, viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng) Có... 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Seul Gi Lee và cộng sự đã định lượng cordycepin trong Cordyceps militaris bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sử dụng chất chuẩn nội muối natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4 Các tác giả so sánh phương pháp định lượng này với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả cho thấy không có sự khác biệt kết quả định lượng. .. liệu đông trùng [16] [12] [26] [32] [35] hạ thảo được đánh giá hàm lượng adenosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Dược liệu được chiết tách bằng đun hồi lưu 30 phút trong dung môi methanol 90% Chuyên luận yêu cầu hàm lượng adenosin không ít hơn 0,01% đối với dược liệu khô kiệt [31] Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7 nucleobase trong một số loài nấm bằng phương. .. kháng virus [25], [37] Cordycepin Guanosin Thymidin Adenosin Cytidin Uridin Hình 1.1 Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28] 1.1.4 Tác dụng của đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765) Theo tài liệu cổ, đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng... chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, bề rộng mỗi bên tối thiều gấp 10 lần chiều rộng của pic tại ½ chiều cao LOD xác định tại nồng độ có tỷ lệ S/N bằng 3 [5] * Giới hạn định lượng (LOQ): được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [5] 2.4.4 Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo - Thu thập một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo. .. nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B (đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat 0,02M) Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml Độ thu hồi của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% ... Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin cordycepin chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định tính, định. .. định lượng adenosin cordycepin chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao - Ứng dụng phương pháp để phân tích số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO BẰNG PHƯƠNG