Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng tinopal CBS x trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà có độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhưng đầu dò huỳnh quan

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM DUY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG THỰC PHẨM NỀN TINH BỘT BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nghệ An, năm 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM DUY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG THỰC PHẨM NỀN TINH BỘT BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị sắc

ký lỏng hiệu năng cao” Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện

của Ban Lãnh đạo, tập thể viên chức Phòng Phân tích thử nghiệm thuộc Trung tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Đồng Tháp; Ban giám hiệu, Khoa Sau Đại học, Khoa Hóa học, giảng viên, cán bộ các phòng ban chức năng của trường Đại học Vinh Tôi xin bày tỏ sự chân thành và lòng cảm ơn về sự giúp đỡ đó

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoa Du, thầy giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp của tôi đang công tác tại Phòng Phân tích thử nghiệm thuộc Trung tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Đồng Tháp và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành luận văn này

Nghệ An, ngày tháng năm 2014

Người thực hiện

Phạm Duy

Trang bìa phụ

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng, các hình vẽ và đồ thị

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Sơ lược về tinh bột gạo 4

1.2 Các sản phẩm làm từ tinh bột gạo 5

1.3 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang 6

1.3.1 Giới thiệu 6

1.3.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học 6

1.3.3 Tinopal CBS-X 8

1.3.3.1 Khái niệm 8

1.3.3.2 Tính chất 8

1.3.3.3 Phạm vi ứng dụng của các chất làm trắng quang học 9

1.3.3.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định 10

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 13

1.4.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng 13

1.4.1.1 Khái niệm 14

1.4.1.2 Phân loại 15

1.4.1.3 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16

1.4.2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) 19

1.4.4 Phương pháp xử lý mẫu cho phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) 21

1.4.4.1 Phương pháp chiết tách mẫu 21

1.4.4.2 Phương pháp làm sạch mẫu 22

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích 23

1.5.1 Khoảng tuyến tính 23

1.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 25

1.5.3 Độ chụm 26

1.5.4 Độ đúng 27

CHƯƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 29

2.1 Hóa chất và thiết bị 29

2.1.1 Hóa chất 29

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 31

2.2 Kỹ thuật xử lý mẫu bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở 31

2.2.1 Lựa chọn dung môi phù hợp 31

2.2.2 Khảo sát kỹ thuật chiết tách chất phân tích 32

2.2.3 Phương pháp làm sạch 33

2.2.4 Pha loãng mẫu 33

2.3 Kỹ thuật phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) 33

2.3.1 Chọn điều kiện sắc ký 33

2.3.2 Trình tự bơm mẫu, tính toán kết quả 35

2.4 Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu phân tích 36

2.4.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 36

2.4.2 Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 37

3.1.1 Chọn hệ dung môi pha động 38

3.1.2 Khảo sát chương trình gradient 39

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động 40

3.2 Khảo sát qui trình chiết tối ưu của tinopal CBS-X 41

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 44

3.3.1 Khoảng tuyến tính 44

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 47

3.3.3 Độ chính xác của phương pháp 48

3.4 Xác định tinopal CBS-X trong các mẫu thực 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

- HPLC UV-VIS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - đầu dò tử ngoại – khả kiến

- HPLC-RF (High Performance Liquid Chromatography /

Fluorescence): Sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang

- LC/MS (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry): Sắc ký lỏng ghép khối phổ một lần

- LC/MS/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

- ICP-AES: Đầu dò phổ phát xạ nguyên tử

- AAS: Hấp thụ nguyên tử

- OBs: Chất làm trắng quang học

- FWAs: Chất làm trắng huỳnh quang

- LOD (Limit of detection): Giới hạn phát hiện

- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lƣợng

- Sr: Độ lặp lại (µg/kg)

- RSD: Độ lặp lại (%)

- H: Hiệu suất thu hồi (%)

Bảng 2.1: Các hệ dung môi chiết trên nền mẫu tinh bột gạo

Bảng 2.2: Chương trình hệ dung môi pha động methanol : nước

Bảng 3.1: Ảnh huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu suất thu hồi của quá trình chiết

Bảng 3.2: Chương trình theo tỷ lệ Gradient dung môi

Bảng 3.3: Khoảng tuyến tính của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang

Bảng 3.4: Đường chuẩn của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang

Bảng 3.5: Độ lặp lại tại nồng độ 20 ug/L, 50 ug/L chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang

Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang

Bảng 3.7: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu bột gạo tại nồng độ 70 µg/kg

Bảng 3.8: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu bột gạo tại nồng độ 250 µg/kg

Bảng 3.9: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu bột gạo tại nồng độ 400 µg/kg

Bảng 3.10: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu bún tại nồng độ 70 µg/kg

Bảng 3.11: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu hủ tiếu tại nồng độ 70 µg/kg

Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền

mẫu bánh phở tại nồng độ 70 µg/kg

Bảng 3.14: Thống kê số lượng mẫu và hàm lượng tinopal CBS-X trong sản phẩm từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013

Bảng 3.15: So sánh kết quả phân tích tinopal CBS-X giữa hai phòng thí nghiệm

Bảng 3.16: Thống kê số lượng mẫu và hàm lượng tinopal CBS-X trong sản phẩm từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2014

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4- morpholino-1,3,5-triazin-2- yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate

anilino-6-Hình 1.2: Công thức cấu tạo của ethenediyl)bis-, disodium salt

2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’-diyldi-2,1-Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X

Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên trái sang bên phải bằng đèn phát cực tím cầm tay

Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ (Courtesy of R David Holbrook, National Institute of Standards and Technology)

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc

Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính

Hình 3.1: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X của hệ pha động 1

Hình 3.2: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X của hệ pha động 2

Hình 3.3: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X theo chương trình gradient

Hình 3.5: Giản đồ biểu thị hiệu suất chiết tinopal CBS-X bằng MeOH

và ACN

Hình 3.6: Khảo sát hai qui trình chiết tối ưu của tinopal CBS-X (a) methanol có mặt axit photphoric (H3PO4), (b) acetonitril có mặt axit photphoric (H3PO4)

Hình 3.7: Đồ thị khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X

Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X

Hình 3.9: Đồ thị của đường chuẩn tinopal CBS-X

Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X

MỞ ĐẦU

Chất làm sáng quang học hoặc chất làm trắng huỳnh quang được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp hóa chất và trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất giấy, bao bì để làm tăng độ trắng sáng cho sản phẩm Chất làm trắng huỳnh quang là những hợp chất có thể hấp thụ ở bước sóng

350 - 365 nm của ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bước sóng 400 - 440 nm[16], [27]

Chất làm sáng huỳnh quang được phát hiện nhiều trong chất tẩy rửa gia dụng, nước rửa chén, vải sợi, giấy vệ sinh,…

Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là bis(2-sulfostyryl)biphenyl, công thức phân tử C28H20Na2O6S2

4,4-[8]

Tinopal

CBS-X là chất làm trắng huỳnh quang có khả năng phát huỳnh quang (fluorescence) và gây ra hiệu ứng tán xạ trên bề mặt sản phẩm mà chúng bám vào làm cho sản phẩm có cảm giác trắng hơn

Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm chất tẩy rửa trong gia dụng để tẩy trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng, … nhưng không được phép sử dụng trong thực phẩm

Gần đây, tình trạng một số cơ sở sản xuất các sản phẩm làm từ tinh bột như bún, hủ tiếu, bánh phở,… sử dụng chất tinopal CBS-X trong sản xuất để làm tăng độ trắng sáng, cải thiện độ bóng bề mặt và làm cho sản phẩm hấp dẫn hơn, đã gây ra nỗi lo ngại về sức khỏe đối với người tiêu dùng Các cơ quan kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm và các phòng phân tích thử nghiệm, kiểm nghiệm đang rất quan tâm đến vấn đề phân tích định lượng hàm lượng tinopal CBS –X trong các loại thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm chế biến từ tinh bột như bánh phở, hủ tiếu, bún, …

Để kiểm soát tinopal CBS-X trong thực phẩm, ngày 16 tháng 8 năm

2013, Cục An toàn thực phẩm – Bộ Y Tế đã có công văn số 1731/ATTP-KN

về việc áp dụng qui trình kiểm nghiệm tinopal CBS-X trong thực phẩm[1]

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng tinopal CBS-

X trong các đối tượng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau Phương pháp kiểm tra sàng lọc tinopal CBS-X bằng cách soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại

UV 366 nm trong buồng tối[1] ,[12] Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà có độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhưng đầu dò huỳnh quang được xem là có độ chọn lọc, độ nhạy cao song chi phí đầu tư ban đầu rất tốt kém Tuy nhiên, khi áp dụng qui trình kiểm tinopal CBS-X đối tượng các loại thực phẩm được làm từ tinh bột gạo có rất ít công trình nghiên cứu một cách

tỉ mỉ và chi tiết, cần phải thực hiện xác nhận, đánh giá phương pháp tại địa phương, xây dựng và kiểm định phương pháp trên thiết bị cụ thể

Với những lý do trên tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng tinopal CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao” làm luận văn tốt nghiệp

Để đóng góp thêm phương pháp phân tích cho các đối tượng các loại thực phẩm nền tinh bột chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện định lượng Tinopal CBS-X (chất phát huỳnh quang) trong bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở ở huyện Cao Lãnh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF)

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

+ Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng tinopal CBS-X trong tinh bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở

+ Nghiên cứu điều kiện định lượng hàm lượng tinopal CBS-X bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF)

Xác định các điều kiện sắc ký, xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp phân tích định lượng

+ Định lượng các chất nghiên cứu trong các loại mẫu thực nghiệm như: bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở được thu thập tại chợ thực phẩm và các cơ

sở sản xuất tại huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp, mỗi mẫu được lấy một ít đựng vào túi nilong sạch

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về tinh bột gạo [24]

Hạt tinh bột lúa nếp và lúa thường có nhiệt độ hồ hóa giống nhau Nhiệt

độ hồ hóa có thể dao động từ 55 0C đến 79 0

C phụ thuộc vào giống và điều kiện canh tác Nhiệt độ hồ hóa phản ánh độ bền của hạt tinh bột tới sự tác động của các loại thuốc thử khác nhau Những sự khác biệt về nhiệt độ hồ hóa phản ánh rõ tới thời gian nấu gạo

Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo

có nhiệt độ hồ hóa thấp Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút nước và trương nở ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao Nhiệt độ hồ hóa cũng có thể phản ánh độ rỗng tương đối của nội nhũ

Tỷ lệ amiloza: Amilopectin xác định các tính chất của cơm Hàm lượng amiloza càng cao, các hạt tinh bột hút nước càng mạnh, thể tích các hạt tinh bột tăng nhưng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amiloza tạo thành các liên kết nước ở mức cao Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó được quyết định bởi tỷ số amiloza : amilopecin trong tinh bột

Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ (3 – 8 µm) được bao bởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nước, nên

để tách được tinh bột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột

Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25% - 0,35%) trong một thời gian dài để làm mềm hạt Tách hết kiềm, rửa bằng nước, sau

đó gạo được nghiền để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột Tiếp đó khối nghiền được khuấy đều với một lượng dư dung dịch kiềm loãng Phần lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vào lớp trên của dung dịch kiềm nên có thể tách ra bằng cách gạn

Khuếch tán khối tinh bột vào nước để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho qua rây có kích thước nhất định để loại bỏ các tạp chất Tinh bột được rửa và lắng gạn, lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ thu được tinh bột tinh sạch

Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO2 ở một nhiệt độ và thời gian nhất định (50 oC, 72h) để làm cho khung protein bị trương lên và bị khuếch tán vào dung dịch dễ dàng Tiếp đó, gạo được nghiền trong cối nghiền Khối nghiền cho qua sàng quay và sàng rung để tách vỏ và xơ Sau đó khuấy đều với dung dịch NaOH để tạo ra huyền phù rồi cho vào ly tâm để tách ra làm 2 lớp: lớp chất lỏng ở phía trong (quanh tâm của máy ly tâm) chứa nhiều protein và lớp đặc có khối lượng riêng lớn thì ở vòng ngoài chứa chủ yếu là tinh bột có lẫn ít protein Ly tâm nhiều lần dịch sữa tinh bột trong kiềm, rồi trong nước sẽ thu được tinh bột tinh sạch

1.2 Các sản phẩm làm từ tinh bột gạo

Có rất nhiều loại sản phẩm có thành phần chính là tinh bột gạo như bánh tráng, bánh phở, hủ tiếu, bún tươi, bún khô, các loại bột gạo, Các sản phẩm này được làm từ tinh bột gạo được chế biến qua nhiều công đoạn, quá trình chế biến rất quan trọng là đảm bảo về vệ sinh an toàn thực phẩm

Một số cơ sở sản xuất các sản phẩm từ bột gạo cho các chất phụ gia bị cấm như : hàn the, tinopal CBS-X, formol, chất bảo quản và các chất màu vào trong sản phẩm làm gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng

1.3 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang 1.3.1 Giới thiệu[6], [7], [8], [16], 26], [27]

Chất làm trắng quang học (Optical Brighteners - OBs) được dùng trong ngành công nghiệp hóa chất, hoặc các chất làm trắng huỳnh quang

(Fluorescent Whitening Agent - FWAs) được dùng trong ngành công nghiệp

chất tẩy rửa, là những hợp chất có thể hấp thụ ở bước sóng 350 - 365 nm của ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bước sóng 400 -

440 nm Electron trong phân tử huỳnh quang được kích thích lên một trạng thái năng lượng cao hơn bằng cách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó phân tử chuyển một lượng nhỏ năng lượng thành nhiệt huỳnh quang, phần còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnh quang khi các electron quay trở lại trạng thái cơ bản của nó Nhiệt huỳnh quang được tạo ra từ trạng thái kích thích thứ nhất có thể được đo được bằng thiết bị nhưng rất phức tạp và tốn kém Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai được đo bằng thiết bị gọi là fluorometers

1.3.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học [6], [7], [8], 26], [27]

Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc

và thuộc tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trăm hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím Hàng ngàn công thức OBs đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất tẩy rửa làm trắng huỳnh

quang (FWAs) đã được nghiên cứu sử dụng

FWAs được sử dụng nhiều trong các chất tẩy rửa bao gồm các hợp chất stilben như:

+ FWA-1 có tên hóa học: Disodium 1,3,5-triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate

4,4'-bis[(4-anilino-6-morpholino-Công thức cấu tạo hóa học:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium morpholino-1,3,5-triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[7]

4,4'-bis[(4-anilino-6-+ FWA-5 có tên hóa học: Benzenesulfonicacid, 2,2’-([1,1’- 4,4’-diyldi-2,1-ethenediyl)bis-disodiumsalt FWA-5 thường được gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate) hoặc tinopal CBS-X

biphenyl]-Công thức cấu tạo hóa học:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2, 2’- ([1, 1’ - biphenyl] - 4, 4’ - diyldi

- 2, 1 - ethenediyl) bis, dạng muối đinatri[8]

1.3.3 Tinopal CBS-X

1.3.3.1 Khái niệm [8], 26], [27]

Tên thường được gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate)

Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-2,1-ethenediyl)bis, dạng muối đinatri

+ pKa (axit tự do): - 2,5 > pKa > - 3,0

đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra methyl)biphenyl Biphenylphosphonate đối xứng này được phản ứng với hai phân tử benzaldehyde-2-sulphonic axit, được sản xuất từ một hợp chất là 2-chlorbenzaldehyde và natri sunfit Thành phần sản phẩm hoạt chất sinh ra là xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số dư là natri clorua và nước

FWA-1 được sử dụng trong các chất tẩy rửa nhà khoảng nồng độ từ 0,05% đến 0,15% và phân hủy > 50 % trong 12 tháng FWA-5 được sử dụng chất tẩy rửa gia dụng ở khoảng nồng độ 0,02% đến 0,10% và phân hủy > 70

% trong 28 ngày OBs được dùng nhiều các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp và đã được thêm vào chất tẩy rửa làm trắng huỳnh quang (FWAs)

Tinopal CBS-X được sử dụng làm hóa chất để sản xuất các sản phẩm tiêu dùng, nó có trong trong các môi trường nước bị ô nhiễm, trầm tích và đất

Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làm chất tẩy rửa trong gia dụng để tẩy trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng

1.3.3.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định[6], [7], [8], [17],

[18], [20], [21], [26], [27]

Các muối axit distyrylbiphenyldisulfonicdisodium có khả năng hòa tan tốt trong nước và hằng số Koc rất thấp, có khả năng tích lũy sinh học Theo hằng số Henry, áp suất hơi của nó rất thấp và do đó DSBP không hòa tan vào trong khí quyển và chất này không có thủy phân Các hợp chất này được phát hiện trong các môi trường nước, bùn, bùn cát và đất,

Khi tinopal CBS-X được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, bước đầu tiên

là sự đồng phân hóa bởi ánh sáng Các dữ liệu xác nhận rằng khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, DSBP hòa tan trong nước được chuyển đổi sang các photoisomers trong vòng vài phút Thành phần chính 85% là đồng phân E, E

có phát huỳnh quang, trong khi đó 15% ở dạng đồng phân E, Z mà không phát huỳnh quang

Được biết, tinopal CBS-X sẽ bị mất tính chất huỳnh quang theo các điều kiện khác nhau khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời Nghiên cứu tại Thụy

Sĩ trên hồ Greifensee và sông Glatt chứng minh quy mô và tốc độ quang phân trong điều kiện một khu vực đông dân cư DSBP có trong hồ Greifensee vào mùa hè chứng tỏ phân hủy quang đáng kể và ở sông Glatt sự phân hủy quang 70% trong vòng 28 ngày xảy ra vào mùa đông Vào mùa hè phân hủy quang

là 70% chỉ sau 1,5 ngày

Sự cân bằng khối lượng chỉ ra rằng 80% bị chuyển hóa bởi quang phân Còn lại 20% DSBP được phân bố đồng đều hấp phụ vào trong đất đá, trầm tích [Stoll, 1999] [8]

Sự phân hủy quang học ban đầu mang lại một sản phẩm 1a chính (muối axit benzaldehyde-2 - sulphonic) và 1b trung gian hình ảnh không ổn định đó, với tốc độ chậm, phá vỡ để tạo thành một 1c sản phẩm thứ hai chính

(diphenyl - 4, 4' - dialdehyde) Cả hai sản phẩm phân hủy quang học được

chứng minh là có thể dễ dàng phân hủy sinh học trong thử nghiệm OECD 301F diphenyl-4,4'-dialdehyde là không ổn định và bị ôxy hóa để diphenyl-

4,4'-dicarboxylic acid (1c, oxit.) trong vòng 24 giờ [Theo Richner, 1999] [8]

Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X[8]

Một trong những tầm quan trọng nhất phát hiện chính xác và xác định OBs (hoặc FWAs) trong các nguồn bị ô nhiễm như nguồn nước và một số sản phẩm khác Việc phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang thực sự là một phép đo rất ít các nhà khoa học nghiên cứu Phép đo huỳnh quang là một mục tiêu chuyển đổi của các tiêu chuẩn phòng thí nghiệm; do đó các phép đo phải được thực hiện hoặc so sánh với một vài khoảng nồng độ

Một trong những phương pháp phổ biến nhất để phát hiện FWAs đã được sử dụng là kiểm tra huỳnh quang dùng đèn cực tím cầm tay hoặc một nguồn tia cực tím Phương pháp cho cách tiếp cận này bao gồm phát hiện nhanh, thiết bị rẻ tiền, dễ dàng kiểm tra số lượng lớn các mẫu trong một thời gian ngắn (phương pháp định tính) Hạn chế của phương pháp này là không xác định nồng độ, độ nhạy kém, có tính chính xác không cao (không có khả năng phân biệt giữa FWAs và các hợp chất huỳnh quang khác)

Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên trái sang bên phải bằng đèn phát cực tím cầm tay[27]

Năm 1935, Judd là ngườixác định các tác nhân làm trắng huỳnh quang đầu tiên Kể từ đó, một số phương pháp xác định làm trắng huỳnh quang đã được phát triển, trong số đó phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp sắc ký lỏnghiệu năng cao pha đảo được

sử dụng rộng rãi nhất để tách hỗn hợp hóa học của nó

Phương pháp huỳnh quang càng chính xác hơn liên quan đến việc sử dụng phân tích công cụ (thiết bị) mà sử dụng cả hai nguồn kích thích và nguồn phát xạ để định lượng chất cần phân tích Ưu điểm của phương pháp này phát hiện nhanh, dễ dàng kiểm tra số lượng lớn các mẫu trong một thời gian ngắn, chính xác hơn (khả năng phân biệt giữa FWAs và các hợp chất huỳnh quang khác), định lượng khoảng nồng độ, và độ nhạy tốt hơn (phát hiện nồng độ thấp hơn) Đơn vị là µg/L

Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ[27]

(Courtesy of R David Holbrook, National Institute of Standards and Technology) [27]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các đầu dò UV, huỳnh quang, khối phổ cho độ chính xác và độ nhạy cao thích hợp cho việc phát hiện chất cần phân tích của bất kỳ mẫu thử nào, nhưng tương đối tốn thời gian

Dưới đây sẽ trình bày chi tiết về phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng [3]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid chromatography) hoặc sắc ký lỏng cao áp (High - pressure liquid chromatography) là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng ngày càng phổ biến để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry ) và sinh hóa (biochemistry ) với mục đích xác định, định lượng và tinh sạch từng thành phân riêng lẻ của hợp chất Sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng được xem là một

kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lượng (gravimetric technique)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một dung môi lỏng để tải hỗn hợp vào cột, trong đó quá trình phân tách xảy ra Một cột phân tách sắc ký lỏng hiệu năng cao được nạp vật liệu pha rắn (như silica , polymers hay chất hấp phụ) và hỗn hợp mẫu được phân tích thành những hợp chất tương tác với các phần tử trong cột Sự phân tách sắc

ký lỏng hiệu năng cao bị ảnh hưởng bởi các điều kiện dung môi lỏng (như áp suất và nhiệt độ), tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môi lỏng (như tính không ưa nước, quá trình proton hóa, v.v) và tương tác hóa học giữa các hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand, trao đổi ion,…)

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt, như phân tích lĩnh vực dầu mỏ, hóa chất công nghiệp, các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.4.1.1 Khái niệm [3]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Sắc ký là một phương pháp tách, trong đó các cấu tử được tách và phân

bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một huớng xác định (theo IUPAC (1993))

+ Pha tĩnh là chất rắn: cơ chế của quá trình tách là hấp thụ (sắc ký hấp thụ)

+ Pha tĩnh là chất rắn chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi ion với mẫu phân tích, cơ chế quá trình tách là trao đổi ion (sắc ký trao đổi ion)

+ Pha tĩnh là các loại hạt rắn có kích thước lỗ xốp khác nhau, khi đó các phân tử mẫu có kích thước nhỏ sẽ chui sâu vào bên trong lỗ xốp nên được pha động rửa giải ra sau Các phân tử có kích thước lớn nằm ở bên ngoài nên được rửa giải ra trước, cơ chế quá trình tách là rây phân tử (sắc ký gel)

+ Pha tĩnh là chất rắn bất đối có khả năng tách chọn lọc các dạng của đồng phân quang học, cơ chế của quá trình tách xảy ra các tương tác khác nhau giữa pha tĩnh bất đối với các dạng đồng phân quang học như liên kết hydro, tương tác π – π, tương tác lưỡng cực, (sắc ký các đồng phân quang học)

Phương pháp sắc ký hấp phụ hiệu năng cao là chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ)

+Pha tĩnh: Pha tĩnh là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên

bề mặt của chất mang trơ, thường là những bột mịn, silicagen và nhôm oxit,… Nếu là hạt thì phải có kích thước đồng đều, có thể dưới dạng hình cầu hoặc mảnh Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện

sắc ký Các chất càng bị phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải

+ Pha động: Thường ở trạng thái lỏng, có thể là hợp chất hữu cơ hoặc

là hỗn hợp hợp chất hữu cơ với nước Các chất này phải thỏa mãn các điều kiện sau: hòa tan được các chất hữu cơ; trơ với pha tĩnh; có độ nhớt càng thấp càng tốt, bền theo thời gian, có độ tinh khiết cao; cân bằng động thiết lập nhanh; phù hợp với detector đem sử dụng…

Trong HPLC nhiều thông số phải được xác định và thiết lập trước khi mẫu được cho vào trong máy Vì thế, khi thực hiện phân tích mẫu với HPLC, cần thời gian để thiết lập chế độ và điều kiện hoạt động thích hợp cho máy trong mỗi phép phân tích Điều này có thể mất hàng giờ hoặc ngày tùy theo kinh nghiệm và kiến thức của người phân tích

1.4.1.3 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [3], [25]

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [25]

+ (1): Hệ thống dung môi: bình chứa dung môi, ống dây dẫn, đầu lọc 0,45 µm, các đầu nối

+ (2): Bơm cao áp

(1) (2)

(5) (6)

Hệ pha động được pha trộn đồng nhất giúp ổn định quá trình rửa giải Và có thể thay đổi thành phần bởi chương trình gradient

Bình chứa dung môi bằng thủy tinh có dung tích khoảng 1 lít Dung môi cần lọc qua giấy lọc 0,45 µm trước khi sử dụng và để an toàn hơn ở đầu của ống nhựa trong bình chứa dung môi cần phải có đầu lọc Loại bỏ các không khí hòa tan hoặc các bọt không khí trong dung môi bằng cách chạy siêu âm, hoặc sục khí trơ như heli…

+ Bơm cao áp

Bơm cao áp là vận chuyển pha động qua cột tách với một tốc độ xác định Bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải chịu được áp suất cao khoảng 250 – 600 bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút

Áp suất trong cột phụ thuộc vào chiều dài cột, kích thước hạt của pha tĩnh, độ nhớt và tốc độ dòng của pha động Cột tách thông thường chịu áp suất khoảng 20 – 300 bar

+ Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích qua bộ phận tiêm mẫu với thể tích bơm

có thể thay đổi từ 1 – 100 µL

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper)

+ Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là bộ phận không thể thiếu của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 50 – 250 mm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt nhồi cỡ 0,3 – 5 µm

Chất nhồi trong cột tách là silicagen hoặc gắn một màng mỏng chất hữu

cơ Bên cạnh silicagen nguời ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion

Ví dụ: Cột phân tích C18, kích thước hạt nhồi cỡ 5 µm, đường kính 4,5

mm, chiều dài cột 250 mm, Ecosil HPLC column

Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ: Sau bộ phận tiêm mẫu và truớc cột tách cần phải lắp cột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ cột khỏi sự xâm nhập của của các hạt bẩn nhỏ có trong dung môi và trong mẫu tiêm vào Nó được thiết

kế kích thước nhỏ và thể tích nhỏ, các hạt nhồi như cột phân tích, không làm thay đổi hiệu quả tách của cột tách

Các yêu cầu sử dụng đầu dò trong kỹ thuật HPLC: Có tính chọn lọc, có

độ nhạy cao đối với chất phân tích, hoạt động ổn định và bền vững trong các điều kiện phân tích, có vùng tuyến tính rộng Không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng bởi các tác động của môi trường như nhiệt độ, áp suất, nhiệt độ

Có độ nhiễu nền nhỏ

Trên cơ sở đó, các lọai đầu dò sử dụng trong kỹ thuật HPLC sau:

- Đầu dò tử ngọai (UV), ứng vùng phổ 190 - 360nm

- Đầu dò tử ngoại khả kiến (UV-VIS), ứng với vùng phổ 360 – 900 nm Đây là loại đầu dò thông dụng nhất

- Đầu dò hùynh quang (RF): Đèn Xenon (Xe) cho vùng phổ 250 – 600

mm

- Đầu dò khối phổ (MS)

- Đầu dò phổ phát xạ nguyên tử (ICP-AES), hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Đầu dò đo điện thế, đo độ dẫn nhiệt, đo chiết suất, hiệu ứng nhiệt,…

+ Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan, đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính

1.4.2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) [3]

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF)

để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang

Chiếu một chùm tia ánh sáng kích thích có bước sóng xác định (λex) và phát xạ huỳnh quang (λem) phù hợp với chất phân tích Sử dụng nguồn phát ánh sáng kích thích là đèn Xenon (Xe) cho vùng phổ 250 – 600 mm

+ Buồng mẫu và môi trường hấp thụ mẫu

+ Hai bộ đơn sắc: Một bộ cung cấp ánh sáng kích thích, bộ còn lại thu nhận chùm tia phát xạ huỳnh quang của chất phân tích

+ Bộ thu nhận và khuếch đại tín hiệu

Những hợp chất như vậy thường có vòng liên hợp như các hợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích hợp

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích tinopal CBS X[9],[10],[11] [22],[23]

Từ năm 1970s, sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được sử dụng để tách và xác định FWAs trong chất tẩy rửa và mẫu môi trường Đến nay, có một số nghiên cứu xác định FWAs như: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò

tử ngoại khả kiến HPLC/UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang HPLC-RF, sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ LC/MS là một phương pháp để xác định FWAs trong các đối tượng mẫu như nguyên liệu giấy, vải sợi, nguyên liệu vải sợi, sản phẩm bao bì chứa thực phẩm

Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) hoặc (LC/MS/MS) tương đối đắt tiền, không dễ dàng hoạt động và không có nhiều phòng thí nghiệm được trang bị

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng tinopal

CBS-X trong các đối tượng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau Phương pháp kiểm tra sàng lọc tinopal CBS-X bằng cách soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại

UV 366 nm trong buồng tối Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc ký lỏng (HPLC) để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà có độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhưng đầu dò huỳnh quang được xem là có độ chọn lọc, độ nhạy cao Việc nghiên cứu phân tích tinopal CBS-X trong nền

mẫu thực phẩm nền tinh bột và một số sản phẩm nền tinh bột bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) là rất cần thiết

1.4.4 Phương pháp xử lý mẫu cho phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.4.1 Phương pháp chiết tách mẫu [4]

+ Chiết bằng dung môi: Dựa trên cơ sở của chất phân tích vào hai pha lỏng không trộn lẫn vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phểu chiết bình chiết Và có hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường axit Hằng số Kpb là hằng số nhiệt động Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng liên tục Trong phân tích, chiết tĩnh đơn giản hơn và được ứng dụng nhiều hơn Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo các yêu cầu như sau:

- Dung môi chiết phải tinh khiết cao, không có chất cần phân tích

- Dung môi chiết phải hòa tan tốt các chất cần phân tích, nhưng lại không hòa tan tốt với các chất khác có trong mẫu

- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được hoàn toàn

- Cân bằng quá trình chiết nhanh, để giải chiết được tốt

- Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, riêng biệt các pha

- Phải chọn môi trường axit, pH, loại axit thích hợp

- Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình chiết

- Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra được tốt

Các dung môi chiết được sử dụng phổ biến nhất là metanol, acetonitril, dichlometan, aceton, ethyl acetat, eter dầu hỏa,… Bên cạnh đó người ta thường có khuynh hướng dùng nhiều dung môi tạo thành một hỗn hợp dung

môi chiết mẫu đặc biệt là trong phân tích kháng sinh, đa dư lượng thuốc bảo

vệ thực vật, các chất phân tích khác, vì như vậy sẽ hoà tan tốt các hoạt chất phân cực cũng như kém phân cực

Ngoài việc chọn hệ dung môi thích hợp để chiết triệt để hơn các hoạt chất ra khỏi dung môi thường được hỗ trợ thêm một số kỹ thuật sau

+ Chiết phân tán pha rắn (Matrix Solid Phase Dispersion Extraction) Đây là một phương pháp dùng cho các loại mẫu rắn trong đó quá trình chiết tách và làm sạch được thực hiện trong cùng một công đoạn Mẫu sau khi say nhuyễn được trộn đều với một chất hấp phụ như C18, C8, florisil,… tạo thành dạng bột tơi, sau đó hỗn hợp được nhồi vào cột sắc ký nhỏ, tạp chất và

dư lượng chất phân tích hấp phụ sẽ được rửa giải với những dung môi thích hợp Khuyết điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích bị giới hạn và khó làm giàu mẫu

Hầu hết sắc ký gel được thực hiện trên chất nhựa đồng trùng hợp giữa divinyl benzene với styrene Kích thước lỗ của loại polime này được kiểm soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa Vì vậy có nhiều loại gel với kích cở

lỗ khác nhau

Những nhược điểm của hạt silica là có khuynh hướng lưu giữ chất tan bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân hủy các phân tử chất tan

+ Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction- SPE)

Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật nhanh, tính chọn lọc và làm sạch trước khi phân tích sắc ký SPE làm sạch các mẫu phân tích, độ thu hồi, và cần thiết cho phân tích định lượng chính xác

Nguyên lý hoạt động của cột chiết pha rắn là dựa vào tương tác của các chất có trong dịch chiết với pha động (dung môi), và pha tĩnh (chất hấp phụ rắn) Pha tĩnh là các hạt nhỏ và xốp đường kính 40 - 70 µm được nhồi trong ống tiêm bằng nhựa, pha tĩnh SPE cũng đa dạng tương tự như pha tĩnh của sắc ký lỏng như cột C18, polystyrenedivinylbezen, amin, nhựa trao đổi anion, nhựa trao đổi cation, carbon graphite, florisil, silica gel, và alumina Có 2 hướng để làm sạch với SPE: cô lập chất phân tích hoặc cô lập nền mẫu

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích [5]

1.5.1 Khoảng tuyến tính

+ Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng

độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

+ Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tại đó có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính

Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc[5]

Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính tối thiểu là 5 điểm nồng độ khác nhau

Xây dựng đường chuẩn ngoại: Chuẩn bị dãy nồng độ của đường chuẩn (tối thiểu 5 điểm nồng độ khác nhau) Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn theo phương trình có dạng:

) (

) )(

( 2

y y y

x

y y x x R

i i

i i

(1.2)

Nếu 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt

1.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng)

Cách xác định: Chỉ áp dụng được cho các phương pháp có xây dựng đường chuẩn

LOD có thể được xác định dựa vào hệ số góc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo

Giá trị SD có thể được tính theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:

+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại

chụm mong muốn

LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính

Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính[5]

Cách tính tương tự như trong phần LOD nhưng theo công thức sau:

a

SD LOQ10* (1.5)

1.5.3 Độ chụm

Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn

Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc, mỗi nồng

độ làm lặp lại ít nhất 6 lần Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV

Giá trị trung bình số học: được lấy làm ước lượng cho độ lớn của đại lượng đo, càng gần với giá trị thực khi số lần đo n càng lớn

Độ thu hồi được tính theo công thức:

- Đối với mẫu thử:

n

i i





Trong đó:

- H%: Độ thu hồi, (%)

- Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/kg)

- Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/kg)

- C0: Nồng độ chuẩn thêm lý thuyết (µg/kg)

- Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (µg/kg) Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại

+ Acetonitril (ACN), loại dùng cho HPLC

+ Methanol (MeOH), loại dùng cho HPLC

+ Axit Photphoric (H3PO4)

+ Axit Formic (HCOOH)

+ Amoni hydroxit (NH4OH)

+ Dung dịch NaOH 5M: Cân chính xác 20 g NaOH bằng cân phân tích hoà tan bằng nước cất vào bình định mức 100 ml, và định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp

+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L: Cân 100,0 mg chất chuẩn tinopal CBS-X bằng cân phân tích vào bình định mức 100 ml hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol (MeOH) Dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 2 – 8o

C,

có thể sử dụng được trong 03 tháng

- Nồng độ dung dịch chuẩn gốc được tính thực tế theo lượng chuẩn đã

cân và độ tinh khiết của chất chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc được pha trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong lọ màu nâu

+ Dung dịch chuẩn trung gian:

Dung dịch chuẩn 100 mg/L: Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều

Dung dịch chuẩn 10,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn 100 mg/L cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều

Dung dịch chuẩn 1,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn 10mg/Lcho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều

+ Dung dịch chuẩn khoảng tuyến tính: Dãy dung dịch chuẩn chạy sắc

Xây dựng đường chuẩn gồm từ 05 hoặc 06 điểm chuẩn Các dung dịch chuẩn làm việc được pha và sử dụng trong ngày