Đánh giá phƣơng pháp phân tích

. 1.5.1. Khoảng tuyến tính.

+ Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích.

+ Khoảng làm việc của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dƣới của chất phân tích, tại đó có thể xác định đƣợc bởi phƣơng pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.

Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc[5]

.

Đối với hầu hết các phƣơng pháp định lƣợng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thƣờng đƣợc khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lƣợng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính tối thiểu là 5 điểm nồng độ khác nhau.

Xây dựng đƣờng chuẩn ngoại: Chuẩn bị dãy nồng độ của đƣờng chuẩn (tối thiểu 5 điểm nồng độ khác nhau). Xác định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn theo phƣơng trình có dạng:

y = ax+ b (1.1)

Trongđó:

a: Giá trị độ dốc (slope), hệ số góc.

b: Giá trị hệ số chặn (intercept), tung độ góc. R: Hệ số tƣơng quan.             ) ( ) ( ) )( ( 2 y y y x y y x x R i i i i (1.2)

1.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ).

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc (đối với phƣơng pháp định lƣợng).

Cách xác định: Chỉ áp dụng đƣợc cho các phƣơng pháp có xây dựng đƣờng chuẩn.

LOD có thể đƣợc xác định dựa vào hệ số góc của đƣờng chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo.

(1.3) (1.4)

Trongđó:

SD : Độ lệch chuẩn của tín hiệu; a: Hệ số góc của đƣờng chuẩn

Giá trị a có thể dễ dàng tính đƣợc từ đƣờng chuẩn.

Giá trị SD có thể đƣợc tính theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:

+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại 10 lần và tính SD tƣơng ứng;

+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặp lại 10 lần và tính SD;

+ Dựa trên hệ số chặn của đƣờng chuẩn, làm 10 lần để tính SD của giá trị b;

+ Dựa trên độ lệch chuẩn của khoảng cách các giá trị đo thực với đƣờng chuẩn.

Giới hạn định lƣợng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ

chụm mong muốn.

LOQ trong nhiều trƣờng hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính.

Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính[5]. Cách tính tƣơng tự nhƣ trong phần LOD nhƣng theo công thức sau:

a SD

LOQ10* (1.5)

1.5.3. Độ chụm

Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc biểu thị định lƣợng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.

Độ chụm có thể đƣợc phân ra thành ba trƣờng hợp sau: - Độ lặp lại (repeatability).

- Độ chụm trung gian (intermediate precision). - Độ tái lập (reproducibility).

Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại ít nhất 6 lần trên cùng một mẫu. Mẫu phân tích có thể là mẫu chuẩn, hoặc mẫu trắng có thêm chuẩn, tốt nhất là làm trên mẫu thử hay mẫu thử thêm chuẩn.

Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại ít nhất 6 lần. Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD hay hệ số biến thiên CV.

Giá trị trung bình số học: đƣợc lấy làm ƣớc lƣợng cho độ lớn của đại lƣợng đo, càng gần với giá trị thực khi số lần đo n càng lớn.

(1.6)

Độ lệch chuẩn (Độ lệch bình phƣơng trung bình):

% % SD*100 RSD CV X   (1.7) Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn, xem (1.4)

X : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm.

1.5.4. Độ đúng

Muốn xác định độ đúng cần phải tìm đƣợc giá trị đúng, có nhiều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phƣơng pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận) và phƣơng pháp xác định hiệu suất thu hồi.

Độ thu hồi đƣợc tính theo công thức: - Đối với mẫu thử:

0 (%) Cm c Cm *100 H C    (1.7) - Đối với mẫu trắng:

0 (%) Ctt *100 H C  (1.8) n X X n i i    1

Trong đó:

- H%: Độ thu hồi, (%).

- Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/kg). - Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/kg).

- C0: Nồng độ chuẩn thêm lý thuyết (µg/kg).

- Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (µg/kg). Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại.

Chƣơng 2

KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị.

2.1.1. Hóa chất[1].

Các dung môi hóa chất sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích, nƣớc cất hai lần không chứa chất phân tích.

+ Chuẩn tinopal CBS-X (4,4’-bis(2-sulfostyryl)biphenyl disodium), Toronto research chemical Tnc, Canada, Cat: #B53520 hoặc tƣơng đƣơng.

+ Tetrabutylammoni hydro sulphat (TBA), Tetra-n-butyl-ammonium hydroxide (12,5% trong methanol).

+ Acetonitril (ACN), loại dùng cho HPLC. + Methanol (MeOH), loại dùng cho HPLC. + Axit Photphoric (H3PO4).

+ Axit Formic (HCOOH). + Amoni hydroxit (NH4OH).

+ Dung dịch NaOH 5M: Cân chính xác 20 g NaOH bằng cân phân tích hoà tan bằng nƣớc cất vào bình định mức 100 ml, và định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp.

+ Dung dịch TBA 0,4%:

Cân 4,0 g TBA khan bằng cân phân tích hoà tan bằng nƣớc cất vào bình định mức 1000 ml rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp. Dùng máy đo pH điều chỉnh pH tới 8,00  0,05, bằng dung dịch NaOH 5M. Lắc đều cho tan hết.

Có thể sử dụng dung dịch TBA dung dịch 12,5% trong methanol pha loãng đến nồng độ 0,4%. Dùng máy đo pH điều chỉnh pH tới 8,00  0,05 bằng dung dịch NaOH 5M.

+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L: Cân 100,0 mg chất chuẩn tinopal CBS-X bằng cân phân tích vào bình định mức 100 ml hoà tan và định mức đến vạch bằng methanol (MeOH). Dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 2 – 8o

C, có thể sử dụng đƣợc trong 03 tháng.

- Nồng độ dung dịch chuẩn gốc đƣợc tính thực tế theo lƣợng chuẩn đã

cân và độ tinh khiết của chất chuẩn.

- Dung dịch chuẩn gốc đƣợc pha trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp và bảo quản trong lọ màu nâu.

+ Dung dịch chuẩn trung gian:

Dung dịch chuẩn 100 mg/L: Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.

Dung dịch chuẩn 10,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn 100 mg/L cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.

Dung dịch chuẩn 1,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn 10mg/Lcho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.

+ Dung dịch chuẩn khoảng tuyến tính: Dãy dung dịch chuẩn chạy sắc ký có nồng độ 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 50,0 µg/L; 100,0 µg/L; 500,0 µg/L.

+ Dung dịch chuẩn làm việc: Dãy dung dịch chuẩn chạy sắc ký có nồng độ 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 20,0 µg/L; 50,0 µg/L; 70,0 µg/L; 100,0 µg/L.

Sử dụng pipet ứng với từng thể tích hút với mỗi điểm chuẩn dung dịch chuẩn 1,0 mg/L và các bình định mức 10 ml định mức tới vạch bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.

Xây dựng đƣờng chuẩn gồm từ 05 hoặc 06 điểm chuẩn. Các dung dịch chuẩn làm việc đƣợc pha và sử dụng trong ngày.

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị[1].

+ Pipet cấp A: 1, 2, 5, 10 ml. + Ống ly tâm nhựa, loại 25, 50 ml. + Cốc có mỏ: 100, 250,ml.

+ Bình định mức các loại 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml. + Phễu lọc.

+ Màng lọc 0,45 µm.

+ Lọ đựng chất chuẩn màu nâu loại 100 ml. + Lọ đựng mẫu 1,5 ml.

+ Cân phân tích có độ chính xác 0,01 mg. + Máy nghiền mẫu.

+ Máy lắc Vortex. + Máy siêu âm. + Máy đo pH.

+ Máy ly tâm, có tốc độ 5000 vòng/phút.

+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - 20A) với đầu dò huỳnh quang (RF-10Axl) – Shimadzu, cột phân tích C18 - Ecosil HPLC column C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm).

2.2. Kỹ thuật xử lý mẫu bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở 2.2.1. Lựa chọn dung môi phù hợp. 2.2.1. Lựa chọn dung môi phù hợp.

Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân tích HPLC sử dụng dung môi chiết phù hợp, việc chiết tinopal CBS-X trong mẫu từ tinh bột gạo và các sản phẩm đƣợc chế biến từ nó, bằng các hệ dung môi chiết methanol có mặt H3PO4 hoặc acetonitril có mặt H3PO4,...

Trong nghiên cứu của đề tài chỉ để cập đến hai dung môi dung để chiết, tách mẫu.

+ Methanol có mặt H3PO4.

2.2.2. Khảo sát kỹ thuật chiết tách chất phân tích.

Có hai cách chiết:

Cách 1: Cân chính xác khoảng 5,00 g mẫu đã đồng nhất bằng cân phân tích cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml, thêm 10 ml methanol có mặt H3PO4, lắc trong 1 phút bằng máy lắc xoáy, sau đó rung siêu âm trong 20 phút. Ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức 25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml methanol có mặt H3PO4. Gộp dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng methanol có mặt H3PO4. Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ thống HPLC[1].

Cách 2: Cân 5,00 g mẫu đã đồng nhất ở trên bằng cân phân tích vào ống ly tâm dung tích 50 ml. Thêm 10 ml acetonitril có mặt H3PO4, lắc đều trong 2 - 3 phút bằng máy lắc xoáy (vortex), tiếp theo siêu âm trong 20 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức 25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml acetonitril có mặt H3PO4. Gộp dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng acetonitril có mặt H3PO4. Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ thống HPLC.

Tiến hành khảo sát một số qui trình chiết nhƣ sau: bằng hai dung môi methanol (MeOH) và acetonitril (ACN) và có mặt axit photphoric (H3PO4).

Bảng 2.1: Các hệ dung môi chiết trên nền mẫu tinh bột gạo.

Qui trình chiết Dung môi chiết

E1 MeOH

E11 1% H3PO4 trong MeOH E12 2% H3PO4 trong MeOH E13 3% H3PO4 trong MeOH E14 3,5% H3PO4 trong MeOH

E15 4% H3PO4 trong MeOH

E2 ACN

E21 1% H3PO4 trong ACN E22 2% H3PO4 trong ACN E23 3% H3PO4 trong ACN E24 3,5% H3PO4 trong ACN E25 4% H3PO4 trong ACN

2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch.

Sử dụng thiết bị ly tâm các dung dịch chiết cho lắng các huyền phù trong dịch chiết. Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu 1,5 ml và tiêm vào hệ thống HPLC.

2.2.4. Pha loãng mẫu.

Đối với mẫu có hàm lƣợng cao vƣợt ngoài đƣờng chuẩn ta cần pha loãng mẫu cho đến khi nồng độ của mẫu nằm trong khoảng đƣờng chuẩn, khi tính toán kết quả cần phải tính đến hệ số pha loãng.

2.3. Kỹ thuật phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF). đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).

2.3.1. Chọn điều kiện sắc ký.

Thông số chung:

+ Cột phân tích: Ecosil HPLC column C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc loại tƣơng đƣơng.

+ Pha động: Cần khảo sát. + Nhiệt độ buồng cột: 40 0C.

+ Đầu dò huỳnh quang: ở λex = 350 nm và λem = 430 nm. + Thể tích bơm mẫu: 10 µL.

+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút. Cần khảo sát. Điều kiện 1:

+ Cột phân tích: Ecosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc loại tƣơng đƣơng.

+ Pha động: Acetonitrile : TBA 0,4%, pH = 8,0  0,05, tỷ lệ 60 : 40. + Nhiệt độ buồng cột 40 0C.

+ Đầu dò huỳnh quang: ở λex = 350 nm và λem = 430 nm. + Thể tích bơm mẫu: 10 µL.

+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút. Cần khảo sát. Điều kiện 2:

+ Cột phân tích: Ecosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc loại tƣơng đƣơng.

+ Pha động: MeOH: H2O, theo tỷ lệ Gradient dung môi: + Nhiệt độ buồng cột 400C.

+ Đầu dò huỳnh quang: ở λex = 350 nm và λem = 430 nm. + Thể tích bơm mẫu: 10 µL.

+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút; Cần khảo sát.

Thiết lập khảo sát chƣơng trình gradient:

Bảng 2.2: Chƣơng trình hệ dung môi pha động methanol : nƣớc.

Gradient 0 Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 Gradient 4 T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH 0,01 10 0,01 10 0,01 30 0,01 50 0,01 50 - - 5,00 50 5,00 50 5,00 50 5,00 50 7,00 90 7,00 90 7,00 90 7,00 90 7,00 50 15,00 90 15,00 90 15,00 90 15,00 90 15,00 50 - - 17,00 50 17,00 50 17,00 50 17,00 50 20,00 10 20,00 10 20,00 30 20,00 50 20,00 50 30,00 30,00 30,00 30,00 30,00

Gradient 5 Gradient 6 Gradient 7 Gradient 8 T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH T (phút) % MeOH 0,01 50 0,01 50 0,01 50 0,01 50 5,00 50 5,00 50 5,00 50 5,00 50 7,00 60 7,00 70 7,00 80 7,00 95 15,00 60 15,00 70 15,00 80 15,00 95 17,00 50 17,00 50 17,00 50 17,00 50 20,00 50 20,00 50 20,00 50 20,00 50 30,00 30,00 30,00 30,00

Khảo sát tốc độ dòng: Với chƣơng trình gradient đã chọn lọc. Chúng

ta tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động: 0,5 ml/phút, 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2 ml/phút.

2.3.2. Trình tự bơm mẫu, tính toán kết quả.

Khi tiến hành phân tích trên thiết bị HPLC theo trình tự bơm mẫu nhƣ sau:

+ Mẫu trắng (dung môi).

+ Các điểm chuẩn của đƣờng chuẩn. + Mẫu trắng (dung môi).

+ Mẫu thử (khoảng 10 mẫu thử).

+ Mẫu kiểm soát (điểm chuẩn hoặc mẫu thử thêm chuẩn). + Mẫu trắng (dung môi).

+ Mẫu trắng (dung môi).

Tính toán kết quả: Kết quả của mẫu thử đƣợc tính toán bằng cách dựa

vào đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn, căn cứ vào diện tích pic mẫu thử tính hàm lƣợng tinopal CBS-X (µg/kg) và đƣợc tính theo công thức sau:

* * C V F X m  (2.1) Trong đó :

V: Thể tích định mức dịch chiết cuối cùng chạy máy HPLC (ml).

C: Nồng độ tinopal CBS-X trong dịch chiết mẫu tính theo đƣờng chuẩn (µg/L).

m: Khối lƣợng của mẫu phân tích (g). F: Hệ số pha loãng (nếu có).

X: Hàm lƣợng tinopal CBS-X trong mẫu thử (µg/kg).

Yêu cầu về độ tin cậy của phƣơng pháp[1], [5]:

+ Khoảng làm việc của phƣơng pháp: Độ tuyến tính của đƣờng chuẩn phải có hệ số tƣơng quan hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤ 1.

+ Độ ổn định của thiết bị: RSD < 2 %. + Độ lặp lại của phƣơng pháp: RSD< 15 %. + Hiệu suất thu hồi: từ 70 % đến 110 %.

2.4. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu phân tích

Mẫu phải đƣợc lấy tại vị trí phản ánh đƣợc bản chất của sản phẩm. Đảm bảo tính đại diện và đồng nhất của sản phẩm. Lƣợng mẫu lấy tối thiểu 200 g để đồng nhất.

2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Dụng cụ lấy mẫu phải sạch và không tƣơng tác với mẫu. Bao bì chứa mẫu phải thật sạch, khô, không chứa chất gây nhiễm.

Mẫu thử phải còn nguyên vẹn, đƣợc chứa trong bao gói thích hợp không có nhiễm bẩn, không có hƣ hỏng, bảo quản mẫu từ 0 oC đến 4 o