Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, quá trình tách sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể tiến hành theo các cơ chế sau:
+ Pha tĩnh là chất lỏng: đƣợc phủ lên trên bề mặt chất mang trơ nhồi trong cột tách tạo thành một lớp màng mỏng có độ dày từ 2 – 3 µm. Cơ chế quá trình tách là phân bố (sắc ký phân bố) của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn, còn đƣợc gọi là sắc ký chiết.
+ Pha tĩnh là chất rắn: cơ chế của quá trình tách là hấp thụ (sắc ký hấp thụ).
+ Pha tĩnh là chất rắn chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi ion với mẫu phân tích, cơ chế quá trình tách là trao đổi ion (sắc ký trao đổi ion).
+ Pha tĩnh là các loại hạt rắn có kích thƣớc lỗ xốp khác nhau, khi đó các phân tử mẫu có kích thƣớc nhỏ sẽ chui sâu vào bên trong lỗ xốp nên đƣợc pha động rửa giải ra sau. Các phân tử có kích thƣớc lớn nằm ở bên ngoài nên đƣợc rửa giải ra trƣớc, cơ chế quá trình tách là rây phân tử (sắc ký gel).
+ Pha tĩnh là chất rắn bất đối có khả năng tách chọn lọc các dạng của đồng phân quang học, cơ chế của quá trình tách xảy ra các tƣơng tác khác nhau giữa pha tĩnh bất đối với các dạng đồng phân quang học nhƣ liên kết hydro, tƣơng tác π – π, tƣơng tác lƣỡng cực,... (sắc ký các đồng phân quang học).
Phƣơng pháp sắc ký hấp phụ hiệu năng cao là chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
+Pha tĩnh: Pha tĩnh là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên bề mặt của chất mang trơ, thƣờng là những bột mịn, silicagen và nhôm oxit,…. Nếu là hạt thì phải có kích thƣớc đồng đều, có thể dƣới dạng hình cầu hoặc mảnh. Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện
sắc ký. Các chất càng bị phân cực càng bị lƣu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải.
+ Pha động: Thƣờng ở trạng thái lỏng, có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là hỗn hợp hợp chất hữu cơ với nƣớc. Các chất này phải thỏa mãn các điều kiện sau: hòa tan đƣợc các chất hữu cơ; trơ với pha tĩnh; có độ nhớt càng thấp càng tốt, bền theo thời gian, có độ tinh khiết cao; cân bằng động thiết lập nhanh; phù hợp với detector đem sử dụng…
Trong HPLC nhiều thông số phải đƣợc xác định và thiết lập trƣớc khi mẫu đƣợc cho vào trong máy. Vì thế, khi thực hiện phân tích mẫu với HPLC, cần thời gian để thiết lập chế độ và điều kiện hoạt động thích hợp cho máy trong mỗi phép phân tích. Điều này có thể mất hàng giờ hoặc ngày tùy theo kinh nghiệm và kiến thức của ngƣời phân tích.