Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích phtalat trong nhựa bằng phương pháp chiết kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong đó, phtalat là một trong những nhóm được sử dụng rộng rãi nhất của hóa chất công nghiệp và đã được xác định là gây rối loạn nội tiết dựa vào các nghiên cứu dịch tễ học gần đây [29]

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát chung về các hợp chất Phtalat 2

1.1.1 Cấu tạo, tên gọi 2

1.1.2 Tính chất của Phtalat 5

1.1.3 Ứng dụng của các hợp chất Phtalat và nguồn gốc phát thải 6

1.1.4 Độc tính của Phtalat 8

1.2 Các hợp chất thay thế phtalat 12

1.3 Các phương pháp xác định phtalat 15

1.3.1.Phương pháp HPLC – UV xác định phtalat 15

1.3.2 Các phương pháp khác xác định phtalat 16

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực 18

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 19

2.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 19

2.2.1 Chất chuẩn 19

2.2.2 Hóa chất 20

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu – phương pháp RP-HPLC 21

2.3.1 Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC 21

2.3.2 Phương pháp định tính và định lượng 23

2.4 Phương pháp phân tích 23

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 23

2.4.2 Phương pháp phân tích 24

2.5 Thực nghiệm 24

2.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 25

2.5.3 Xây dựng đường chuẩn 25

2.5.4 Đánh giá phương pháp phân tích 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký 27

3.1.1 Van bơm mẫu 27

3.1.2 Cột tách 28

3.1.3 Detector 28

3.1.4 Bước sóng hấp thụ cực đại của các phtalat 29

3.1.5 Khảo sát và chọn tỉ lệ thành phần pha động phù hợp 29

3.1.6 Khảo sát và chọn tốc độ dòng pha động phù hợp 32

3.1.7 Khảo sát độ lặp lại của thiết bị 34

3.1.8 Điều kiện tối ưu cho quá trình tách các phtalat 35

3.2 Đường chuẩn hỗn hợp xác định 05 phtalat 37

3.2.1 Khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector 37

3.2.2 Dựng đường chuẩn 38

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 39

3.2.4 Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0 41

3.2.5 Kiểm tra sự sai khác giữa b và b’ 42

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 43

3.3.1 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu 43

3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 44

3.4 Phân tích mẫu thực tế 45

3.5 Hàm lượng cho phép của hàm lượng phtalat trong đồ chơi trẻ em 48

KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tên viết tắt Tên đầy đủ

DEHP, DOP Di(2-etylhexyl) phtalat

DEP Dietyl phtalat

DEPA Denmark Environmental Protection Agency: cơ quan bảo vệ môi

trường Đan Mạch DINP Diisononyl phtalat

DPP Di-n-propyl phtalat

ECD Electron capture detector: detector bắt điện tử

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals : hóa chất gây rối loạn nội tiết FID Flame ionization detector: detector ion hóa ngọn lửa

HPLC High performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu năng cao KLPT Khối lượng phân tử

LOD Limit of Detection: Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation: Giới hạn định lượng

MS mass spectrometry : phổ khối

PDA Photo-diode-array: mảng điot điện tử

ppm Part per million: phần triệu

PVC Polyvinyl clorua

RP-HPLC Reverse phase-HPLC: sắc ký lỏng pha đảo

UV-Vis Ultra-violet: tử ngoại và khả kiến

US EPA United States Environmental Protection Agency: cơ quan bảo vệ môi

trường Hoa Kỳ

% RSD % Relative Standard Deviation:% độ lệch chuẩn tương đối

THF Tetrahydro furan

Hình 2.1: Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC 23

Hình 3.1: Phổ UV của 05 phtalat nghiên cứu trong luận văn 29

Hình 3.2: Sắc đồ của 05 phtalat với chương trình gradient 1 30

Hình 3.3: Sắc đồ của 05 phtalat với chương trình gradient 2, 3 và 4 31

Hình 3.4: Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 33

Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại của thiết bị 36

Hình 3.6: Khoảng tuyến tính và khoảng động học của detector 37

Hình 3.7: Đường chuẩn 05 phtalat nghiên cứu trong luận văn 40

Hình 3.8: Sắc đồ của mẫu thực 47

Bảng 1.1: Tên gọi, công thức hóa học của một số Phtalat thông dụng 3

Bảng 1.2: Tính chất lý hóa của một số Phtalat 6

Bảng 1.3: Mức độ sản xuất, tiêu thụ, xuất nhập khẩu của một số Phtalat (tấn/năm) ở EU 7

Bảng 1.4: Tỉ lệ cho các ứng dụng cụ thể của một số Phtalat trong một năm ở EU (năm 2001) 8

Bảng 1.5: Các chất hóa dẻo thay thế 13

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu được chọn phân tích 19

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn phtalat 20

Bảng 3.1: Độ lặp lại thời gian lưu của các phtalat 34

Bảng 3.2: Độ lặp lại diện tích pic của các Phtalat 35

Bảng 3.3: Các dung dịch đường chuẩn 38

Bảng 3.4: Diện tích pic trung bình thu được của các phtalat 38

Bảng 3.5: Phương trình đường chuẩn của 05 Phtalat 39

Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 39

Bảng 3.7: Kết quả so sánh giữa giá trị a của phương trình đường chuẩn của 05 phtalat với giá trị 0 42

Bảng 3.8: Một số đại lượng thống kê của tập giá trị b và b’ trong phương trình hồi quy của DPP 42

Bảng 3.9: Độ lặp lại của phương pháp xử lý mẫu 44

Bảng 3.10: Hiệu suất thu hồi của các phtalat 45

Bảng 3.11:Hàm lượng các phtalat trong mẫu thực 46

MỞ ĐẦU

Hiện nay đã có một sự quan tâm và sự quan tâm này ngày càng tăng đối với việc nghiên cứu các tác động của hóa chất trên động vật hoang dã, con người và môi trường Những nghiên cứu cho thấy một số chất tổng hợp và tự nhiên trong môi trường có thể ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của hệ thống nội tiết Một trong những nhóm chính là hóa chất gây rối loạn nội tiết (EDCs) Trong những năm gần đây, các hóa chất gây rối loạn nội tiết đã trở thành một trong những chủ đề quan trọng nhất của nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học môi trường Chúng được đề cập đến như là các chất ngoại sinh gây ảnh hưởng bất lợi trong các sinh vật hoặc con cháu của chúng, hậu quả gây thay đổi chức năng nội tiết Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường do số lượng sử dụng của chúng lớn trong các ứng dụng công nghiệp, khu dân cư và nông nghiệp Sự thay đổi trong hành vi sinh sản tình dục, hệ thống nội tiết của động vật hoang dã đã được báo cáo tại các khu vực bị ô nhiễm với EDCs Trong đó, phtalat là một trong những nhóm được sử dụng rộng rãi nhất của hóa chất công nghiệp và đã được xác định là gây rối loạn nội tiết dựa vào các nghiên cứu dịch tễ học gần đây [29]

Phtalat đã được xác định là các chất độc hại cho sự phát triển và sinh sản, mặc dù độc tính của chúng có thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của từng phtalat cụ thể Việc sản xuất toàn cầu hàng năm của phtalat được ước tính là 11 tỷ bảng Sản phẩm nhựa polyvinyl clorua (PVC) có thể chứa lên đến 50 % trọng lượng chất hoá dẻo, phổ biến nhất là phtalat Hơn nữa, những chất này không tạo liên kết trong mạng lưới của nhựa mà chỉ được thêm vào nhựa như một chất phụ gia vì vậy rất dễ thôi nhiễm ra ngoài môi trường (nhất là môi trường nhiều chất béo như dầu, mỡ ) [13] Sáu trong số phtalat thường được sử dụng trong các sản phẩm tiêu dùng là di-2-etylhexyl phtalat (DEHP hoặc DOP), diisononyl phtalat (DINP), dibutyl phtalat (DBP), diisodecyl phtalat (DIDP), di-n octyl phthalate (DnOP), và benzyl butyl phtalat (BBP hoặc BzBP) Ngoài ra, cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (US EPA ) phân loại DEHP và BBP như chất có thể gây ung thư cho con người Vì vấn đề sức

khỏe, kể từ tháng 2 năm 2009 Đạo luật cải tiến an toàn sản phẩm tiêu dùng đã giới hạn DEHP, DBP và BBP trong đồ chơi trẻ em và chăm sóc trẻ em ở nồng độ không vượt quá 0,1 % DINP, DIDP và DnOP bị cấm sử dụng Mặc dù sáu phtalat đang bị hạn chế trong các sản phẩm của trẻ em ở Mỹ và Liên minh châu Âu (EU) nhưng chúng không được kiểm soát và tiếp tục được sử dụng trong làm đồ chơi ở nhiều nơi khác trên thế giới như Trung Quốc và Ấn Độ [29]

Ngày nay sản phẩm nhựa PVC đang được sử dụng rất rộng rãi vì tính tiện

dụng cũng như giá thành rẻ của nó Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích Phtalat trong nhựa bằng phương pháp chiết kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao” để phần nào đánh giá mức độ ô nhiễm phtalat

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát chung về các hợp chất phtalat

1.1.1 Cấu tạo, tên gọi

Phtalat là este dialkyl hoặc alkyl aryl của axit 1,2-benzendicacboxylic Công thức cấu tạo chung của phtalat như sau:

Tên gọi, công thức hóa học của một số phtalat thông dụng được thể hiện trong bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.1: Tên gọi, công thức hóa học của một số phtalat thông dụng [8]

2 Diethyl phthalate DEP C6H4(COOC2H5)2 222

3 Diallyl phthalate DAP C6H4(COOCH2CH=CH2)2 246

phthalate ODP CH3(CH2)7OOCC6H4COO(CH2)9CH3 418

19 Diisononyl DINP C6H4[COO(CH2)6CH(CH3)2]2 418

Bảng 1.2: Tính chất lý hóa của một số phtalat [5]

trong mỹ phẩm để tạo độ tươi mới, tạo độ mịn và hấp dẫn cho loại mỹ phẩm đó, hơn nữa trong sơn móng tay các phtalat còn làm cho màu sơn sáng bóng hơn và bền lâu hơn, bám dính hơn Chất DEP còn được dùng như một chất định hương trong nước hoa, giúp nước hoa giữ mùi thơm được lâu hơn và mùi không bị biến mùi trong các điều kiện thời tiết khác nhau Trong ngành vật liệu xây dựng: ván sàn, vòi hoa sen, ống nước, sơn tường,…Đồ gia dụng: rổ rá, làn, túi xách, đầu vú, bình sữa, can, chai, túi bao gói,… Trong giải trí: các loại đồ chơi trẻ em Trong thực phẩm: thạch rau câu, nước ngọt, sữa [20] Trong ngành sản xuất các loại dụng cụ, thiết bị y tế: túi nhựa đựng máu, dây truyền nước và hóa chất, ống thông tiểu, ống súc dạ dày [23] Chúng còn được sử dụng trong ngành dược như DEP được dùng như một chất trị bệnh ghẻ vì nó có tính diệt khuẩn Đặc biệt, DEP được dùng làm chất hóa dẻo trong bao phim viên thuốc, nhưng lớp phim bao này thường rất mỏng cộng với việc sử dụng hàng ngày chỉ một lượng nhỏ nên coi như lượng vào cơ thể không đáng kể [19] Bảng 1.3 dưới đây thể hiện lượng sản xuất, tiêu thụ, xuất nhập khẩu trong một năm của một số phtalat ở EU và bảng 1.4 thể hiện tỉ lệ cho các ứng dụng cụ thể của một số phtalat trong một năm ở EU

Bảng 1.3: Mức độ sản xuất, tiêu thụ, xuất nhập khẩu của một số Phtalat (tấn/năm) ở

Bảng 1.4: Tỉ lệ cho các ứng dụng cụ thể của một số Phtalat trong một năm ở EU

(năm 2001) [5]

Hợp chất Polyme

dẻo (%)

Chất kết dính (%)

Mực in (%)

Sơn (%)

Gốm (%)

Khác (%)

1.1.4 Độc tính của phtalat

1.1.4.1 Tiếp xúc

Việc sử dụng phổ biến phtalat trong sản xuất nhựa, các sản phẩm chăm sóc

cá nhân và vật liệu đóng gói thực phẩm hay chính quá trình tạo ra các sản phẩm đó

là nguyên nhân cho việc tiếp xúc phtalat rộng rãi tới cộng đồng Con người tiếp xúc với phtalat có thể là trực tiếp hay sử dụng sản phẩm có chứa phtalat do thôi nhiễm,

ví dụ như bao bì thực phẩm hoặc dịch truyền tĩnh mạch, hay do sự ô nhiễm của môi

trường xung quanh Nuốt phải, hít phải, tiêm tĩnh mạch và sự hấp thụ da là các con đường tiềm năng tiếp xúc phtalat [5]

Nuốt phải : tuyến đường tiếp xúc này có thể bắt nguồn từ

 Thức ăn: Phtalat có thể được thôi nhiễm từ hộp nhựa vào thực phẩm khi

để trong lò vi sóng Hay thực phẩm hấp thu từ môi trường trong quá trình canh tác hoặc do di chuyển từ các thiết bị chế biến, vật liệu đóng gói

 Nước: Phthalates được tìm thấy trong nước ngầm và nước uống Từ năm

1987 đến năm 1993, theo thống kê về phát thải chất độc hóa học của EPA thì trong đất và nước DEHP giải phóng ra đạt hơn 500.000 lbs, trong đó

 Đồ chơi: đồ chơi polymer dẻo với phtalat là một nguồn tiềm năng tiếp xúc bằng miệng ở trẻ em Năm 1999, Liên minh châu Âu tạm thời cấm tiếp thị đồ chơi cho tất cả các trẻ em có chứa DEHP, DBP và BBP cũng như đồ chơi có chứa DINP, DnOP, và DIDP dành cho trẻ em dưới 3 tuổi DINP là phtalat chính được sử dụng trong đồ chơi tại Mỹ Các ước tính trung bình trẻ em tiếp xúc với DINP qua hoạt động ngậm đồ chơi trong khoảng 5,7 – 44 µg/ kg / ngày

Hít thở không khí

 Không khí trong nhà và bụi nhà: Hơi phát ra từ vật liệu xây dựng, đồ nội thất và nước hoa là nguồn tiềm năng trong nhà của phơi nhiễm phtalat Một nghiên cứu ở Na Uy tìm thấy trung bình có 960 mg tổng phtalat / g bụi Trong đó DEHP đã có mặt ở các cấp độ cao nhất là 640μg / g bụi Các nhà nghiên cứu ước tính trung bình người lớn hít phải DEHP từ nguồn này là 0,76 mg / ngày Một nghiên cứu khác tìm thấy một mối tương quan giữa nồng độ trong nước tiểu và nồng độ bụi trong nhà của DEP, DBP và BBP Điều này cho thấy rằng khi hít phải bụi nhà có thể là một nguồn quan trọng của tiếp xúc với phtalat trọng lượng phân tử thấp

 Thiết bị y tế: Một số phtalat như DEHP, có thể được chuyển thành dạng hơi trong ống dẫn khí hô hấp

 Nung tạo hình đất sét: để tạo hình đất sét họ đưa vào đất sét hỗn hợp phtalat trước khi nung để tạo thành một khối mềm khi ở nhiệt độ thường

và quá trình nung này làm phtalat bay hơi khuếch tán vào không khí

Trong tĩnh mạch: phtalat trong nhựa PVC làm túi, ống truyền dịch,…có thể bị thôi

nhiễm, theo đường truyền và đi vào cơ thể

Sự hấp thu qua da: xảy ra trực tiếp khi sử dụng các sản phẩm chăm sóc thẩm mỹ

chứa phtalat như: kem dưỡng da, dầu gội, nước hoa, sơn móng tay, thuốc xịt tóc,… 1.1.4.2 Độc tính

- Tác động lên con người

Do việc sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhựa và chất dẻo, phtalat là chất gây

ô nhiễm môi trường phổ biến Và nó ngày càng được quan tâm do khả năng gây ung thư và rối loạn nội tiết cho con người khi tiếp xúc Phtalat được biết đến với nhiều loại như DEHP, DBP, BBzP và một vài chất chuyển hóa phtalat như mono-butyl phtalat (MBP), mono-benzyl phtalat (mBzP) và mono- (2-etylhexyl) phtalat (mEHP), là chất gây ung thư gan động vật gặm nhấm và gây quái thai ở động vật

Nakane và cộng sự (2012) đã nghiên cứu tiềm năng cảm ứng của sự gia tăng

sự phá hủy tế bào gan qua 26 tuần với diheptyl phtalat (DHP) DEHP có hiệu ứng gây ung thư gan cho cả chuột cống và chuột nhắt Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về Ung thư cho biết DEHP đã được phân loại là có thể gây ung thư cho con người (Nhóm 2B), cho tác động độc hại và gây ung thư trong một số mô đích (ví dụ như, gan và tinh hoàn) ở chuột Mặt khác, kết quả cho thấy phát triển thần kinh của trẻ

em bị ảnh hưởng bởi phtalat Nó làm giảm sự tỉnh táo và phát triển thiếu tập trung, rối loạn tăng động ở trẻ em gái Bornehag và cộng sự (2004) đã nghiên cứu mối quan hệ tiềm năng giữa các triệu chứng dị ứng dai dẳng ở trẻ em và nồng độ phtalat trong bụi thu thập được từ nhà của họ Kết quả cho thấy BBzP, DEHP, và DBP là những thành phần có hại lớn BBzP có liên quan với viêm mũi (p = 0,001) và chàm (p = 0,001), trong khi DEHP kết hợp với cả hen suyễn (p = 0,022)

Trong tất cả các nghiên cứu, các chàng trai trong nhóm gynecomastia, cô gái với thelarche và bé gái dậy thì sớm thì nước tiểu có nồng độ phatlat cao hơn Tiếp xúc với nhiều phtalat có tác động xấu đến mức độ kích thích tố sinh sản (luteinizing hormone, testosterone tự do, hormone-binding globulin) Theo các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện bởi Wu và cộng sự (2013), người ta thấy rằng huyết thanh hormone kích thích tuyến giáp (TSH) giảm ở trẻ em tiếp xúc với thực phẩm nhiễm độc DEHP Những nghiên cứu này cho thấy DEHP chất chuyển hóa có thể làm gián đoạn các tín hiệu tuyến giáp ở người lớn và trẻ em Việc gián đoạn chức năng tuyến giáp của phtalat có thể đạt được bằng cách ảnh hưởng đến T3 ràng buộc để vận chuyển protein, và sự hấp thu của T3 hoạt động trong màng tế bào Hơn nữa, những con chuột được điều trị bằng DHP đã được quan sát thấy sự giảm triglyceride trong máu, cholesterol toàn phần, phospholipid và lượng đường, có thể là do tác dụng sinh học của các thụ thể peroxisome proliferator kích hoạt (PPAR) chủ vận alpha Ngoài ra, Schmidt (2012) đã kiểm tra ảnh hưởng của phơi nhiễm DEHP chế độ ăn uống vào quá trình chuyển hóa và khả năng sinh sản ở chuột cái Nó đã được quan sát thấy rằng phụ nữ phơi nhiễm DEHP có một mức độ cao hơn trong lượng thức

ăn, trọng lượng cơ thể, và mô mỡ nội tạng và con của phụ nữ tiếp xúc với chế độ ăn

uống thay đổi trong chuyển hóa cũng được tìm thấy Theo kết quả, có thể kết luận rằng khi những con chuột tiếp xúc với liều lượng cao của DEHP, khả năng sinh sản

bị suy giảm và khi những con chuột tiếp xúc với liều lượng phù hợp với môi trường, trọng lượng cơ thể và mỡ nội tạng đã được tăng lên Nó cũng đã được giải thích bằng cách kích hoạt các thụ thể proliferator kích hoạt peroxisome (PPARs), tăng nồng độ leptin và FABP4 (acid béo gắn với protein 4) biểu hiện mRNA, và giảm hàm lượng adiponectin [23]

- Tác động lên môi trường

Trong số 8 phtalat (BBP, DEHP, DBP, DIBP, DINP, DIDP, DnPP và DnOP) thì ba phtalat là BBP, DEHP và DBP biểu hiện độc tính nhất đối với sinh vật trên cạn, cá và động vật thuỷ sinh Các nghiên cứu độc tính sinh thái với các phtalat cho thấy những tác động xấu của chúng cho sinh vật dưới nước với một phạm vi rộng và

ở những nồng độ trùng với nồng độ môi trường đo Ba phtalat khác là DIBP, DINP

và DIDP thể hiện độc tính thấp hơn nhiều đối với sinh vật dưới nước Không có dữ liệu cho độc tính đối với môi trường của DnPP hay DnOP [24]

1.2 Các hợp chất thay thế phtalat

Trung tâm Lowell cho sản xuất bền vững tại Đại học Massachusetts cung cấp một tổng quan về lựa chọn thay thế phtalat được sử dụng như chất làm dẻo trong một loạt các sản phẩm nhựa polyvinyl clorua (PVC), đặc biệt chú trọng vào các sản phẩm của trẻ em

Một số chất đã được xác định là chất hoá dẻo thay thế Những hợp chất đó bao gồm citrat, sebacat, adipat, và phốt phát Chúng được thay thế trong các sản phẩm truyền thống sử dụng phtalat, chẳng hạn như đồ chơi và thiết bị y tế Ngoài ra

để sử dụng như chất thay thế làm dẻo nhựa PVC, các chất này cũng được sử dụng làm dung môi và chất kìm hãm trong các sản phẩm mỹ phẩm, mực in, chất kết dính,

và các sản phẩm tiêu dùng khác

Hầu hết các chất dẻo thay thế chưa được nghiên cứu về tác động tiềm tàng đối với sức khỏe con người và môi trường Mặc dù nhiều trong số những lựa chọn

này cho thấy tiềm năng ứng dụng đầy hứa hẹn, tiếp xúc đáng kể có thể dẫn đến ảnh hưởng xấu tới sức khỏe Giống như phtalat, các chất làm dẻo thay thế không bị ràng buộc về mặt hóa học với các loại polyme và tan ra của sản phẩm Một số tác dụng

từ việc tiếp xúc với các chất hoá dẻo thay thế hiện đang được sử dụng trong các sản phẩm của trẻ em và các sản phẩm tiêu dùng khác bao gồm mắt, da và kích ứng đường hô hấp Ngoài ra còn có bằng chứng về tác dụng trên thận, gan, lá lách, tinh hoàn, và tử cung Hầu hết các bằng chứng về ảnh hưởng sức khỏe con người có nguồn gốc từ các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm như một vài nghiên cứu dịch

tễ học Ngoài ra, một số chất dẻo thay thế có thể có độc hại cho sinh vật dưới nước

và có thể không phân hủy trong môi trường Bảng 1.5 xác định một số chất thay thế làm chất hóa dẻo hiện đang được sử dụng cho trẻ em và các sản phẩm tiêu dùng khác, và tiềm năng ảnh hưởng sức khỏe và môi trường của chúng

Bảng 1.5: Các chất hóa dẻo thay thế [7]

Hợp chất thay

thế

Chức năng / sản phẩm Mối quan tâm sức

khỏe con người

Mối quan tâm

về môi trường Acetyl tributyl

citrat

- Chủ yếu được sử dụng như một chất làm dẻo trong các sản phẩm mỹ phẩm, đồ chơi, nhựa vinyl, chất kết dính, thiết

bị y tế, lớp phủ tablet dược phẩm, bao bì thực phẩm, chất hương liệu trong thực phẩm, mực in

và nhựa trong bê tông

- Cũng được sử dụng như một chất bôi trơn bề mặt

- Tiếp xúc với tĩnh mạch ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương và máu trong động vật thí nghiệm Có thể có tác dụng kích thích vừa phải trên đôi mắt

và làm tăng trọng lượng gan

- Nghiên cứu cho

- Có thể tích lũy và phân hủy sinh học (trong một phân hủy sinh học vốn có kiểm tra, 80 phần trăm là

bị suy thoái) Tuy nhiên, trong một thử nghiệm chuẩn suy thoái

trong sản xuất hàng kim loại có liên hệ với thực phẩm

thấy rằng nó ức chế sự tăng sinh của các tế bào bạch cầu

aerobic chậm

không có dữ liệu có sẵn trên kỵ khí Bis(2-etylhexyl)

-1,4-benzendi

cacboxylat

- Được sử dụng như một chất làm dẻo trong đồ chơi nhựa PVC, nắp chai

và cửa, lớp phủ cho vải, kết nối điện, các sản phẩm nhựa vinyl khác, và các loại nhựa copolymer PVC / VA

- Không tìm thấy

dữ liệu

- Không tìm thấy dữ liệu

Di(2-etyl hexyl)

adipat

- Được sử dụng như một chất làm dẻo trong đồ chơi, sàn vinyl, dây và cáp điện, văn phòng phẩm, bề mặt gỗ, vải bọc, găng tay, ống, giả da, giày, keo, và thảm đệm

- Cũng được sử dụng trong các bộ phim được

sử dụng trong vật liệu đóng gói thực phẩm, chất độn, sơn và sơn bóng, keo dán, nhựa trong bê tông

và các sản phẩm cao su

- Độc hại nhẹ khi tiêm tĩnh mạch trong nghiên cứu động vật

- Có thể sản xuất thay đổi phụ thuộc vào liều trong cơ thể

- Độc cho tảo, động vật giáp xác và cá

- Dữ liệu mãn tính trên động vật giáp xác cho thấy ảnh hưởng xấu đến sinh sản

- Không phải

là một chất tích tụ sinh học

Di(2-etylhexyl)

phophat

- Chủ yếu được sử dụng như một chất chống cháy trong các sản phẩm với nhu cầu chống cháy cụ thể Cũng được sử dụng như một chất làm dẻo trong các sản phẩm PVC được sử dụng trong các khu vực bệnh viện, bao bì, dây cáp, sàn và tường phủ

- Ở người, hít phải gây ra sự mệt mỏi,

dễ bị kích thích và đau đầu

- Nguyên nhân kích ứng mắt và bỏng da mức độ đầu tiên và thứ hai Báo cáo là ăn mòn da và mắt ở thỏ

- Có tiềm năng tích lũy sinh học thấp

1.3 Các phương pháp xác định phtalat

1.3.1 Phương pháp HPLC – UV xác định phtalat

Do cấu trúc và tính chất tương tự nhau của các hợp chất phtalat nên khi xác định đồng thời các hợp chất này cần một phương pháp đủ mạnh để không có sự chen lẫn phổ giữa các chất và phương pháp HPLC là một trong các phương pháp thực hiện được điều đó Sắc ký lỏng sử dụng detector UV có thể định tính cũng như định lượng được phtalat Tuy nhiên, dạng phổ hấp thụ của các phtalat lại tương đối giống nhau, bước sóng hấp thụ cũng không đặc trưng nên khi phân tích mẫu thực tế cần một phương pháp khác mạnh hơn để kiểm chứng Đối với một số đối tượng mẫu phân tích mà nền mẫu không quá phức tạp thì HPLC – UV lại trở thành phương pháp ưu việt do việc xử lý mẫu đơn giản, kết quả tin cậy và giá thành rẻ

Silvia Marten (2010) [21] đã đưa ra quy trình tách 08 Phtalat là BB, BBP, DBP, DHP, DEHP, DNOP, DINP và DIDP trên hệ RP – HPLC cột Eurospher II 100-3 C18 H, 250 x 3 mm Hệ dung môi là ACN – H2O, với hai kênh A gồm H2O/ACN tỉ lệ 15/85 (v/v) kênh B là ACN Gradient từ 0-3 phút từ 0% kênh B, từ 3,0-6,5 phút tăng từ 0% B đến 100% B, phút thứ 6,5 đến 19,5 phút chạy 100% kênh

ở 0 phút là 5 % B và 5 % C, ở 10 phút là 45 % B và 45 % C, ở 12,45 phút là 45 % B

và 45 % C, ở 12,5 phút là 90 % B, ở 14 phút 5 % B và 5 % C Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nhiệt độ cột 40o C, detector UV đặt ở bước sóng 228 nm Thứ tự các chất

ra khỏi cột là MMP, DMP, DEP, BB, BBP, DBP, DEHP, DNOP và DIDP Tổng thời gian chạy một mẫu là 15 phút

Theo tài liệu [14] tác giả sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao hiệu Hitachi (model L-7100, Tokyo) với hệ bơm mẫu tự động (model L-7200), detector được kết nối với hệ ghép nối Hitachi model D-7000 để tách 05 phtalat DEHP, DEP, DBP, BBP và DNHP Tách sắc ký sử dụng cột C18 Supelcosil 250 mm x 4,6 mm x

5 µm ở nhiệt độ 20 ± 2o C Rửa giải được thực hiện bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp acetonitril – dung dịch đệm 0,08% trietylamin điều chỉnh pH 2,8 với axít photphoric 1M (88:12, v / v) chạy đẳng dòng với tốc độ 0,7 ml / phút Thời gian chạy là 50 phút

1.3.2 Các phương pháp khác xác định phtalat

Ngoài phương pháp HPLC, một phương pháp phổ biến để xác định các phtalat là GC-MS Có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định các phtalat như detector bắt điện tử (ECD) hay ion hóa ngọn lửa (FID)

Theo Yun Zou, Min Cai (2013), các phtalat được xác định trên đối tượng là

đồ chơi trẻ em, sử dụng hệ thiết bị GC – MS Mẫu 1 là một món đồ chơi và mẫu PVC 2 là một núm vú cho trẻ sơ sinh Cả hai mẫu được nghiền hoặc cắt thành từng miếng có kích thước nhỏ hơn 3 mm x 3 mm 1g mẫu được chiết Soxhlet trong 120

ml DCM trong 6h ở 60-80°C Dịch chiết được cô về khoảng 10 ml bằng máy cất cô chân không và sau đó pha loãng với DCM đến 25 ml Đối với những mẫu có hàm

lượng rất lớn các phtalat (ví dụ 45%) thì có thể pha loãng để có nồng độ tập trung trong đường chuẩn Các mẫu thêm chuẩn được thực hiện theo quy trình như trên Chương trình chạy máy GC – MS với cột Agilent J&W DB-5ms Ultra Inert capillary column, 30 m × 0.25 mm, 0.25 µm, tốc độ dòng ban đầu 1 ml/phút, dòng chảy liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ 2900 C, áp suất 35 psi, giữ

ở 500 C trong 1 phút, sau đó tăng 300 C/phút tới 2800 C, sau đó tăng 150 C/phút tới

3100 C, giữ trong 4 phút Thu được thời gian lưu của các chất DBP (m/z=223), BBP (m/z=206), DEHP (m/z=279) ở 7,25 phút và của DNOP (m/z=279) ở 8,7 phút và DINP (m/z=293) ra sau phút 9,0 [28]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng các loại detector mạnh hơn detector UV cũng được sử dụng để phân tích các phtalat Theo nghiên cứu của Bart Tienpont [6], các mẫu môi trường như đất, trầm tích , các mẫu thực phẩm và mẫu nền sinh học cũng đã được đem ra phân tích hàm lượng các phtalat trên hệ máy HPLC-MS với các chế độ ion hóa khác nhau Các phtalat được phân tích chủ yếu là dạng mono-este của axit phtalic như mono-2-etylhexyl phtalat , cơ chế phân mảnh ESI hoặc APCI Hệ thiết bị Agilent 1100 LC, kết hợp với cột 25cm

× 4,6 mm ID × 5 µm, hệ dung môi gồm 2 kênh Kênh A 0,5% đệm amoni axetat trong nước, kênh B là metanol, chạy đẳng dòng tỷ lệ 50%/50% B về thể tích, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, van bơm mẫu 50 µL Thế phân cực 70 V, nhiệt độ 3250 C, tốc độ khí 5l/phút khí N2, các mảnh ion M+1 = 277 (DEHP), 281 (MEHP), 291 (MiNP),

305 (MiDP) Mẫu được chiết các phtalat ra khỏi nền bằng chiết lỏng – lỏng và làm giàu bằng chiết pha rắn

1.3.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực

Trước khi mẫu được đưa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lượng phtalat

có trong mẫu thì nó phải được đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau về dạng lỏng, các phtalat được hòa tan trong dung môi ACN hoặc MeOH Khi đưa vào đầu cột tách có khả năng hấp thu và rửa giải qua cột

Theo Dr Gregory Olufemi Adewuyi (2012) quy trình xử lý mẫu được thực hiện bằng cách: Tất cả các mẫu đồ chơi bằng nhựa PVC được cắt thành những

miếng nhỏ hơn 2 mm2 bằng kéo và lưỡi dao cạo sau đó được nghiền thành dạng bột Khoảng 10 g mỗi mẫu bột được bọc trong 12,5 mm giấy lọc Whatman trước chiết Soxhlet Các mẫu PVC được chiết Soxhlet với 100 ml diclometan (DCM) trong 7 giờ ở 60°C Dịch chiết được cô về khoảng 2 ml bằng máy cất quay chân không ở 30°C Sau đó mẫu được làm sạch và tách sơ bộ trên cột sắc ký (2,0 cm x 20 cm) với khoảng 5 g silicagel (60-120 mesh) và lớp Na2SO4 khoảng 1cm trên lớp silicagel Cột sắc ký được hoạt hóa với 20 ml n-hexan, tốc độ 2 ml / phút Khoảng 2 ml dịch chiết mẫu được chuyển định lượng vào cột và thêm 2 ml hexan, sau đó khoảng 40ml hexan được sử dụng để rửa giải loại các cấu tử không phân cực (phần này được loại bỏ), 40ml etyl acetat dùng để rửa giải phtalat, thu lấy dịch rửa và cô bằng máy cất quay chân không ở 30°C, 1 ml ACN sau đó đã được bổ sung vào mẫu để phân tích TLC và HPLC [14]

Một quy trình xử lý mẫu khác trong tài liệu [16] được đề xuất theo Ủy ban an toàn sản phẩm tiêu dùng Mỹ (CPSC) sử dụng phương pháp thử CPSC-CH-C1001-09.1 thì phtalat được chiết từ các sản phẩm tiêu dùng sau khi nghiền Cân một lượng 0,05 g mẫu nghiền cho vào trong một lọ thủy tinh và 5 ml THF được thêm vào Lắc cho đến khi mẫu được hòa tan hoàn toàn trong 30 phút đến 2 giờ tùy thuộc vào chất liệu Polyme được kết tủa bằng 10 ml hexan hoặc metanol kết hợp với làm mát Khi các polyme đã ổn định, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm PTFE, cô khô và sau đó pha loãng một lần nữa với ACN Sau khi pha loãng (tùy thuộc vào nồng độ phthalat trong mẫu) tiến hành phân tích bằng HPLC

Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các tài liệu tham khảo đã có, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha đảo của Shimadzu, ghép nối với detector PDA, cột C18 inertsil ODS-3 250mm × 2,1mm × 5µm s/n 7GI5008, hệ điều khiển SCL 10A, lò cột CTO-10AS, bộ trộn dung môi, bơm cao áp LC-10Advp, đèn SPD-M10A (đèn D2 và W) Vòng nạp mẫu 25µl Các điều kiện phân tích trên máy và xử lý mẫu đều được khảo sát và tối ưu hóa trước khi phân tích mẫu

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích định lượng xác định đồng thời các phtalat trong một số mẫu nhựa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha đảo (RP-HPLC), detector PDA

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Giống với các loại nhựa PVC dẻo khác, đồ chơi trẻ em cũng được thêm những lượng, những chất phtalat khác nhau để tạo nên độ mềm, độ bền cho sản phẩm Lượng phtalat được thêm vào đồ chơi trẻ em lên tới vài chục phần trăm Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một số mẫu là đồ chơi trẻ em có phần nhựa mềm được mua tại chợ Đồng Xuân – Hoàn Kiếm – Hà Nội Thông tin mẫu được thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu được chọn phân tích

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị

2.2.1 Chất chuẩn

Các chất chuẩn phtalat được mua của hãng Sigma aldrichdạng lỏng, với độ tinh khiết ≥ 98% Các dung dịch chuẩn gốc được cân khối lượng và pha với các nồng độ trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn phtalat

STT Tên viết tắt Khối lượng cân (g) Nồng độ (ppm) Cách pha

Định mức đến 1ml bằng ACN

- Cột pha đảo cột C18 inertsil ODS-3 250mm × 2,1mm × 5µm s/n 7GI5008

- Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g

- Máy lắc

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt

- Máy cất quay chân không

 Dụng cụ:

- Bình định mức: 10, 25, 50 ml, cùng hãng

- Pipet thường 5, 10 ml

2.3 Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP-HPLC

2.3.1 Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy

ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc

độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển mà bị pha tĩnh giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan khác nhau, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung môi để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lưu giữ ít Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký

Quá trình sắc ký có thể xảy theo 3 cơ chế sau:

- Tương tác hấp phụ

- Tương tác trao đổi ion

- Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:

- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-HPLC) và hấp phụ pha ngược HPLC)

RP Sắc ký trao đổi ion (EXRP HPLC)

- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)

Như vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ

số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất Sau khi chuyển tới cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau

Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC

1 Bộ phận cấp dung môi (pha động) 2 Bơm cao áp

3 Van bơm mẫu 4 Cột tách (pha tĩnh)

5 Detector 6 Máy ghi tín hiệu

7 Bơm mẫu tự động 8 Phần điều khiển, xử lý kết quả

- Phương pháp phân tích định lượng:

Trong sắc kí, hai phương pháp thường được sử dụng để định lượng chất phân tích là phương pháp ngoại chuẩn và phương pháp nội chuẩn Nguyên tắc của phương pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu được) trong mẫu chưa biết với dung dịch chuẩn của chất đó Trước tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng độ thích hợp Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn có dạng: y = a + bx Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đường chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x) Trong trường hợp này, các thông số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng …phải rất ổn định, các lần bơm mẫu phải có độ lặp lại cao

cô quay chân không ở 40oC để loại THF và n-hexan còn dư Dịch thu được được hòa tan trong 1 ml ACN, pha loãng các nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45

µm và tiến hành phân tích HPLC Mẫu thêm chuẩn cũng được thực hiện với cùng quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu

2.4.2 Phương pháp phân tích

Phép phân tích các phtalat được thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bước sóng 224 nm Các điều kiện chạy máy được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột 300C

- Van bơm mẫu 25 µl

- Hệ pha động gồm 2 kênh Kênh A là nước Kênh B là ACN

- Chế độ gradient tỉ lệ thành phần pha động: từ 0 – 8 phút chạy hệ pha động ACN/H2O với tỉ lệ 70/30, tiếp đó tăng tỉ lệ ACN lên 100% trong 2 phút từ phút thứ 8 đến phút thứ 10 và giữ tỉ lệ này trong 12 phút Sau đó giảm tỉ lệ pha động xuống 70/30 như ban đầu trong 2 phút và giữ tỉ lệ này trong 6 phút Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 30 phút Tốc độ pha động được giữ trong suốt quá trình chạy mẫu là 0,5 ml/phút

2.5 Thực nghiệm

2.5.1 Khảo sát điều kiện tối ưu

Các điều kiện tối ưu trên hệ máy sử dụng cũng như quá trình xử lý mẫu đã được khảo sát

Đầu tiên là tỉ lệ thành phần pha động: các tỉ lệ của 2 dung môi ACN/H2O được lựa chọn để khảo sát từ 70/30 đến 85/15 Sau khi lựa chọn được tỉ lệ thành phần pha động chúng tôi tiếp tục khảo sát tốc độ dòng pha động Tốc độ dòng được chọn là: 0,4 – 0,8 ml/phút