2.3.1. Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC.
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn đƣợc phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một tốc độ và thành phần pha động nhất định, hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển mà bị pha tĩnh giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng nhƣ cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan khác nhau, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung môi để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lƣu giữ lâu trên cột, có chất tan bị lƣu giữ ít. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
22 - Tƣơng tác hấp phụ
- Tƣơng tác trao đổi ion
- Tƣơng tác theo cơ chế rây phân tử
Tƣơng tác với 3 cơ chế trên có 3 phƣơng pháp tiến hành tách khác nhau:
- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thƣờng NP-HPLC) và hấp phụ pha ngƣợc RP- HPLC).
- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC) - Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)
Nhƣ vậy phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thƣớc nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thƣớc đủ nhỏ để đáp ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt đƣợc lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chuyển tới cuối cột tách đƣợc chuyển tới detector để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại detector khác nhau.
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ chức năng của thiết bị HPLC
1. Bộ phận cấp dung môi (pha động) 2. Bơm cao áp
3. Van bơm mẫu 4. Cột tách (pha tĩnh) 5. Detector 6. Máy ghi tín hiệu
23
2.3.2. Phương pháp định tính và định lượng.
- Phương pháp phân tích định tính:
Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc trƣng của tín hiệu tƣơng ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng. Trong sắc kí lỏng ngƣời ta sử dụng yếu tố đặc trƣng là thời gian lƣu để nhận diện các cấu tử bằng cách so sánh thời gian lƣu của chúng với thời gian lƣu của chất chuẩn. Sử dụng phƣơng pháp HPLC – UV , ngoài việc nhận diện các cấu tử thông qua yếu tố thời gian lƣu, chất cần phân tích còn đƣợc nhận diện thông qua việc so sánh cực đại hấp thụ đặc trƣng và cực đại hấp thụ của chất chuẩn với chất cần phân tích .
- Phương pháp phân tích định lượng:
Trong sắc kí, hai phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để định lƣợng chất phân tích là phƣơng pháp ngoại chuẩn và phƣơng pháp nội chuẩn. Nguyên tắc của phƣơng pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu đƣợc) trong mẫu chƣa biết với dung dịch chuẩn của chất đó. Trƣớc tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng độ thích hợp. Từ các kết quả thu đƣợc ta xây dựng đƣờng chuẩn có dạng: y = a + bx. Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đƣờng chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x). Trong trƣờng hợp này, các thông số làm việc của máy nhƣ nhiệt độ, tốc độ dòng …phải rất ổn định, các lần bơm mẫu phải có độ lặp lại cao.
2.4. Phƣơng pháp phân tích.
2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu.
Mẫu phân tích trƣớc khi xử lý đƣợc làm sạch bằng nƣớc cất và cắt nhỏ cỡ 2 mm2 bằng dao cạo.
Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng khoảng 0,05 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 20ml. Thêm 5 ml THF rung siêu âm từ 30 phút đến 2 giờ ở 40oC cho tới khi mẫu tan hoàn toàn. Tiếp theo cho 5ml n-hexan để kết tủa polyme kết hợp làm mát, khi kết tủa ổn định thì lọc bỏ kết tủa, dịch lọc đem
24
cô quay chân không ở 40oC để loại THF và n-hexan còn dƣ. Dịch thu đƣợc đƣợc hòa tan trong 1 ml ACN, pha loãng các nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành phân tích HPLC. Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện với cùng quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu.
2.4.2. Phương pháp phân tích.
Phép phân tích các phtalat đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bƣớc sóng 224 nm. Các điều kiện chạy máy đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Nhiệt độ cột 300C - Van bơm mẫu 25 µl
- Hệ pha động gồm 2 kênh. Kênh A là nƣớc. Kênh B là ACN.
- Chế độ gradient tỉ lệ thành phần pha động: từ 0 – 8 phút chạy hệ pha động ACN/H2O với tỉ lệ 70/30, tiếp đó tăng tỉ lệ ACN lên 100% trong 2 phút từ phút thứ 8 đến phút thứ 10 và giữ tỉ lệ này trong 12 phút. Sau đó giảm tỉ lệ pha động xuống 70/30 nhƣ ban đầu trong 2 phút và giữ tỉ lệ này trong 6 phút. Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 30 phút. Tốc độ pha động đƣợc giữ trong suốt quá trình chạy mẫu là 0,5 ml/phút .
2.5. Thực nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.1. Khảo sát điều kiện tối ưu.
Các điều kiện tối ƣu trên hệ máy sử dụng cũng nhƣ quá trình xử lý mẫu đã đƣợc khảo sát.
Đầu tiên là tỉ lệ thành phần pha động: các tỉ lệ của 2 dung môi ACN/H2O đƣợc lựa chọn để khảo sát từ 70/30 đến 85/15. Sau khi lựa chọn đƣợc tỉ lệ thành phần pha động chúng tôi tiếp tục khảo sát tốc độ dòng pha động. Tốc độ dòng đƣợc chọn là: 0,4 – 0,8 ml/phút.
25
2.5.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của thiết bị đƣợc xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị. Đối với thiết bị sắc kí này dung dịch hỗn hợp chuẩn Phtalat có nồng độ xấp xỉ 10 µg/ml (10 ppm). Tiến hành bơm lặp dung dịch này từ 8-10 lần, thể tích bơm mẫu là 25 µl.
Độ lệch chuẩn đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn
xi: hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu lặp i
x: hàm lƣợng trung bình chất phân tích trong mẫu lặp N: số mẫu lặp
Giới hạn phát hiện (LOD) : đƣợc xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà hệ thống còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền, đƣợc tính thông qua công thức :
LOD = 3× SD
Giới hạn định lƣợng (LOQ): đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền đƣợc tính theo công thức :
LOQ= 10× SD
2.5.3. Xây dựng đường chuẩn.
Để phù hợp với thiết bị sắc kí lỏng HPLC – UV nên chúng tôi xây dựng các đƣờng chuẩn của các hợp chất phtalat với nồng độ từ 10 – 480 ppm.
Thông tin về các đƣờng chuẩn của các hợp chất phtalat đƣợc trình bày trong phần kết quả.
26
2.5.4. Đánh giá phương pháp phân tích
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các phtalat đã chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn 05 phtalat đã khảo sát và thu đƣợc 05 phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ thống qua các hệ số trong phƣơng trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết luận. Thu đƣợc một phƣơng trình đƣờng chuẩn mới, sau đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm 3 lần để thu đƣợc hàm lƣợng trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu.
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các phtalat chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các phtalat sau khi xử lý không bị vƣợt quá đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.
27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký.
3.1.1. Van bơm mẫu.
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đƣợc thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào việc mở rộng chân pic sắc ký (doãng pic). Nếu nhƣ vòng mẫu chứa quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng lƣợng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu > Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký cũng không tăng đƣợc nữa mà lúc đó pic sắc ký sẽ tù và doãng , không sắc nét nữa. Vì vậy việc chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu vòng mẫu quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng chân pic càng cao. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 25l thì sai số là 0,2%.
Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, vì vậy chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 25l.
28
3.1.2. Cột tách.
Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích đƣợc pha trong môi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các phtalat, không tan trong nƣớc, đƣợc pha trong ACN, chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm × 5µm) để tách các phtalat và định lƣợng chúng. Nhiệt độ cột 300C.
3.1.3. Detector.
Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trò nhƣ một deetector UV – VIS, nhƣng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các phtalat.
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn nghiên cứu định lƣợng 05 phtalat. Chúng có cấu tạo rất giống nhau. Chỉ khác nhau 2 nhóm R và R’ đƣợc thay bằng các gốc rƣợu khác nhau, vì vậy bƣớc sóng hấp thụ quang của các phtalat này đều giống nhau ở 224 nm. Dải phổ hấp thụ của các phtalat này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 700 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 05 phtalat.
29
Hình 3.1: Phổ UV của 05 phtalat nghiên cứu trong luận văn.
3.1.5. Khảo sát và chọn tỉ lệ thành phần pha động phù hợp.
Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:
Độ chọn lọc của hệ pha
Thời gian lƣu giữ của chất tan Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)
Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh. Độ rộng của pic sắc ký.
Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng tách có độ phân cực lớn và trung bình thƣờng chủ yếu là nƣớc. Tỉ lệ thành phần pha động đƣợc lựa chọn sao cho phù hợp với quá trình tách.
Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn cũng là cột pha ngƣợc, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì các chất mới có thể tách các phtalat.
Trong quá trình khảo sát riêng rẽ từng phtalat với chƣơng trình chạy đẳng