2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu.
Mẫu phân tích trƣớc khi xử lý đƣợc làm sạch bằng nƣớc cất và cắt nhỏ cỡ 2 mm2 bằng dao cạo.
Mẫu đƣợc cân với khối lƣợng khoảng 0,05 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 20ml. Thêm 5 ml THF rung siêu âm từ 30 phút đến 2 giờ ở 40oC cho tới khi mẫu tan hoàn toàn. Tiếp theo cho 5ml n-hexan để kết tủa polyme kết hợp làm mát, khi kết tủa ổn định thì lọc bỏ kết tủa, dịch lọc đem
24
cô quay chân không ở 40oC để loại THF và n-hexan còn dƣ. Dịch thu đƣợc đƣợc hòa tan trong 1 ml ACN, pha loãng các nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành phân tích HPLC. Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện với cùng quá trình trên để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu.
2.4.2. Phương pháp phân tích.
Phép phân tích các phtalat đƣợc thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bƣớc sóng 224 nm. Các điều kiện chạy máy đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
- Nhiệt độ cột 300C - Van bơm mẫu 25 µl
- Hệ pha động gồm 2 kênh. Kênh A là nƣớc. Kênh B là ACN.
- Chế độ gradient tỉ lệ thành phần pha động: từ 0 – 8 phút chạy hệ pha động ACN/H2O với tỉ lệ 70/30, tiếp đó tăng tỉ lệ ACN lên 100% trong 2 phút từ phút thứ 8 đến phút thứ 10 và giữ tỉ lệ này trong 12 phút. Sau đó giảm tỉ lệ pha động xuống 70/30 nhƣ ban đầu trong 2 phút và giữ tỉ lệ này trong 6 phút. Tổng thời gian chạy 1 mẫu là 30 phút. Tốc độ pha động đƣợc giữ trong suốt quá trình chạy mẫu là 0,5 ml/phút .
2.5. Thực nghiệm.
2.5.1. Khảo sát điều kiện tối ưu.
Các điều kiện tối ƣu trên hệ máy sử dụng cũng nhƣ quá trình xử lý mẫu đã đƣợc khảo sát.
Đầu tiên là tỉ lệ thành phần pha động: các tỉ lệ của 2 dung môi ACN/H2O đƣợc lựa chọn để khảo sát từ 70/30 đến 85/15. Sau khi lựa chọn đƣợc tỉ lệ thành phần pha động chúng tôi tiếp tục khảo sát tốc độ dòng pha động. Tốc độ dòng đƣợc chọn là: 0,4 – 0,8 ml/phút.
25
2.5.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của thiết bị đƣợc xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị. Đối với thiết bị sắc kí này dung dịch hỗn hợp chuẩn Phtalat có nồng độ xấp xỉ 10 µg/ml (10 ppm). Tiến hành bơm lặp dung dịch này từ 8-10 lần, thể tích bơm mẫu là 25 µl.
Độ lệch chuẩn đƣợc tính theo công thức:
Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn
xi: hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu lặp i
x: hàm lƣợng trung bình chất phân tích trong mẫu lặp N: số mẫu lặp
Giới hạn phát hiện (LOD) : đƣợc xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà hệ thống còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền, đƣợc tính thông qua công thức :
LOD = 3× SD
Giới hạn định lƣợng (LOQ): đƣợc xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền đƣợc tính theo công thức :
LOQ= 10× SD
2.5.3. Xây dựng đường chuẩn.
Để phù hợp với thiết bị sắc kí lỏng HPLC – UV nên chúng tôi xây dựng các đƣờng chuẩn của các hợp chất phtalat với nồng độ từ 10 – 480 ppm.
Thông tin về các đƣờng chuẩn của các hợp chất phtalat đƣợc trình bày trong phần kết quả.
26
2.5.4. Đánh giá phương pháp phân tích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp phân tích thể hiện tính đúng đắn trƣớc tiên phải thể hiện độ lặp lại. Trong nghiên cứu chúng tôi đã khảo sát độ lặp lại của hệ thiết bị HPLC sau khi chọn các điều kiện tối ƣu. Đánh giá độ lặp của hệ thiết bị dựa trên độ lặp diện tích và thời gian lƣu của các cấu tử trong dung dịch khảo sát. Một mẫu có nồng độ xác định nằm trong giới hạn tuyến tính của đƣờng chuẩn các phtalat đã chọn. Mẫu đƣợc bơm vào hệ 3 lần sau đó lấy diện tích pic và thời gian lƣu trung bình của các lần và tính đƣợc giá trị % RSD. Giá trị này đánh giá độ lặp cần khảo sát.
Sau khi có đầy đủ các điều kiện tối ƣu, tiến hành dựng đƣờng chuẩn 05 phtalat đã khảo sát và thu đƣợc 05 phƣơng trình đƣờng chuẩn. Đánh giá sai số hệ thống qua các hệ số trong phƣơng trình hồi quy sử dụng các chuẩn Student và Fisher để đánh giá và kết luận. Thu đƣợc một phƣơng trình đƣờng chuẩn mới, sau đó mới tiến hành phân tích mẫu thực tế.
Khi phân tích mẫu thực thì độ lặp lại quá trình xử lý mẫu cũng đƣợc khảo sát và đánh giá. Cùng một mẫu đƣợc cân khối lƣợng gần giống nhau, xử lý cùng một điều kiện. Mỗi mẫu sau xử lý đƣợc bơm 3 lần để thu đƣợc hàm lƣợng trung bình. Các giá trị trung bình đó đƣợc sử dụng để đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu. Giá trị % RSD cũng đƣợc dùng làm giá trị đánh giá độ lặp của phƣơng pháp xử lý mẫu.
Mẫu thêm chuẩn cũng đƣợc thực hiện để đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu. Mẫu thực đƣợc thêm một lƣợng nhất định các phtalat chuẩn vào ở 3 mức nồng độ sao cho tổng hàm lƣợng các phtalat sau khi xử lý không bị vƣợt quá đƣờng chuẩn. Xử lý mẫu theo quy trình đã chọn và phân tích trên hệ thu đƣợc hàm lƣợng các chất đƣợc thêm vào và đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp xử lý mẫu.
27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký.
3.1.1. Van bơm mẫu.
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu đƣợc nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thƣờng, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu đƣợc dòng pha động nạp trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lƣợng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi đƣợc thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào việc mở rộng chân pic sắc ký (doãng pic). Nếu nhƣ vòng mẫu chứa quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.
Lƣợng mẫu đƣợc xác định bằng lƣợng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu > Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký cũng không tăng đƣợc nữa mà lúc đó pic sắc ký sẽ tù và doãng , không sắc nét nữa. Vì vậy việc chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu vòng mẫu quá dài, lƣợng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tƣợng doãng chân pic càng cao. Nếu thể tích bơm mẫu là quá nhỏ thì sai số cũng sẽ rất lớn, ví dụ nếu sai số của van bơm mẫu là 0,05l, khi bơm thể tích mẫu là 1l thì sai số sẽ là 5%, còn nếu thể tích mẫu bơm là 25l thì sai số là 0,2%.
Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, vì vậy chúng tôi lựa chọn loại van này và thể tích mẫu bơm là 25l.
28
3.1.2. Cột tách.
Cột tách có vai trò rất quan trọng trong một phép tách sắc ký, nó quyết định hiệu quả tách của quá trình. Để chọn đƣợc một pha tĩnh hay một cột tách phù hợp nhất ta phải dựa trên những đặc điểm nhƣ: độ phân cực của chất phân tích, chất phân tích đƣợc pha trong môi trƣờng nhƣ thế nào, có pH ra sao thì mới quyết định chọn pha tĩnh phù hợp. Chất phân tích đƣợc chọn là các phtalat, không tan trong nƣớc, đƣợc pha trong ACN, chất phân tích kém phân cực nên phải sử dụng pha tĩnh có bản chất kém phân cực giống nhƣ chất phân tích. Vì vậy, cột pha đảo RP-HPLC là lựa chọn tối ƣu nhất. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng cột tách C18 inertsil ODS-3 (250mm × 2,1mm × 5µm) để tách các phtalat và định lƣợng chúng. Nhiệt độ cột 300C.
3.1.3. Detector.
Detector là một bộ phận có vai trò theo dõi, phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc ký chảy ra một cách liên tục, nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích. Trên thực tế, hầu hết các chất nghiên cứu đều hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại UV – VIS, vì vậy detector UV – VIS thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu. Hiện nay mảng diot–photo–array phát triển, chúng có vai trò nhƣ một deetector UV – VIS, nhƣng chúng có khả năng theo dõi chất ở nhiều bƣớc sóng khác nhau ở cùng một thời điểm, và độ nhạy của nó cao hơn detector UV-VIS. Tuy nhiên, dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và mục tiêu của nghiên cứu, chúng tôi quyết định chọn detector PDA để phát hiện các chất phân tích.
3.1.4. Bước sóng hấp thụ cực đại của các phtalat.
Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn nghiên cứu định lƣợng 05 phtalat. Chúng có cấu tạo rất giống nhau. Chỉ khác nhau 2 nhóm R và R’ đƣợc thay bằng các gốc rƣợu khác nhau, vì vậy bƣớc sóng hấp thụ quang của các phtalat này đều giống nhau ở 224 nm. Dải phổ hấp thụ của các phtalat này đƣợc quét trên detector PDA từ 190 nm đến 700 nm. Hình 3.1 là phổ UV của 05 phtalat.
29
Hình 3.1: Phổ UV của 05 phtalat nghiên cứu trong luận văn.
3.1.5. Khảo sát và chọn tỉ lệ thành phần pha động phù hợp.
Thành phần pha động ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả tách chất. Pha động có thể ảnh hƣởng tới những vấn đề sau của sự tách sắc ký của các chất:
Độ chọn lọc của hệ pha
Thời gian lƣu giữ của chất tan Hiệu lực cột tách (đại lƣợng Nef)
Độ phân giải của chất trong một pha tĩnh. Độ rộng của pic sắc ký.
Pha động trong sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng tách có độ phân cực lớn và trung bình thƣờng chủ yếu là nƣớc. Tỉ lệ thành phần pha động đƣợc lựa chọn sao cho phù hợp với quá trình tách.
Các chất phân tích là các chất kém phân cực, pha tĩnh đƣợc chọn cũng là cột pha ngƣợc, kém phân cực, vậy pha động dùng để tách phải có độ phân cực vừa phải thì các chất mới có thể tách các phtalat.
Trong quá trình khảo sát riêng rẽ từng phtalat với chƣơng trình chạy đẳng dòng tỉ lệ thành phần pha động ACN/H2O là 85/15 chúng tôi nhận thấy thứ tự ra (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30
khỏi cột của các phtalat có thể chia làm hai nhóm: nhóm đầu gồm DPP, BBP và DBP, nhóm sau gồm DOP và DINP. Vì vậy chúng tôi chọn chƣơng trình thử nghiệm chạy gradient với các chƣơng trình nhƣ sau để khảo sát khả năng tách của các phtalat.
Chƣơng trình gradient 1:
t (phút) 0 5 7 17 19 25
ACN/H2O 85/15 85/15 100/0 100/0 85/15 stop
Với tốc độ dòng pha động là 0,6 ml/phút chúng tôi thu đƣợc kết quả với sắc đồ đƣợc biểu diễn trên hình 3.2
Hình 3.2: Sắc đồ của 05 phtalat với chƣơng trình gradient 1
Với chƣơng trình gradient này thì nhóm đầu các chất gần nhƣ là chồng pic lên nhau, ko tách đƣợc. Nhóm sau 2 chất đã tách khỏi nhau rõ ràng. Để tách các chất trong nhóm đầu chúng tôi đã giảm tỉ lệ ACN trong thành phần pha động xuống 80%, 75% và 70% với chƣơng trình gradient 2, 3 và 4 nhƣ sau :
Chƣơng trình gradient 2: t (phút) 0 5 7 20 22 30 ACN/H2O 80/20 80/20 100/0 100/0 80/20 stop Chƣơng trình gradient 3: t (phút) 0 6 8 17 20 25 ACN/H2O 75/25 75/25 100/0 100/0 75/25 stop
31 Chƣơng trình gradient 4:
t (phút) 0 8 10 22 24 30
ACN/H2O 70/30 70/30 100/0 100/0 70/30 stop
Cũng với tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Chúng tôi đã thu đƣợc kết quả các chƣơng trình gradient 2, 3, 4 nhƣ hình 3.3 dƣới đây.
Gradient 2
Gradient 3
Gradient 4
32
Từ hình 3.3 cho thấy, với 3 chƣơng trình gradient này thì DPP (nhóm đầu) đã tách ra đƣợc 2 chất còn lại, DOP và DINP (nhóm sau) cho pic rõ ràng, ko có sự chen lấn phổ. Với chƣơng trình gradient 3 và 4 sự chồng pic của BBP và DBP (nhóm đầu) vẫn còn nhƣng không đáng kể điều này có thể là tín hiệu mừng cho các bƣớc khảo sát tiếp theo.
Vì vậy chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 4 để tiếp tục khảo sát với tốc độ dòng pha động.
3.1.6. Khảo sát và chọn tốc độ dòng pha động phù hợp.
Tốc độ pha động khi chạy sắc ký ảnh hƣởng không ít đến kết quả sắc ký. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quyết định đến tốc độ rửa giải các chất trong cột sắc ký vì nó ảnh hƣởng đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan giữa hai pha tĩnh và động. Tốc độ pha động quá nhỏ sẽ gây hiện tƣợng doãng pic, thời gian rửa giải các chất lớn làm giảm tính kinh tế của phƣơng pháp. Khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu không kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tƣợng chen lấn, chồng chéo pic. Vì vậy cần chọn tốc độ pha động phù hợp.
Đối với một hệ pha tĩnh và thành phần pha động đã lựa chọn thì khả năng tách các chất phụ thuộc vào tốc độ pha động. Đối với một cột tách nhất định sẽ có một tốc độ tối ƣu.
Dựa vào kết quả khảo sát tỉ lệ thành phần pha động ở mục 3.1.5 chúng tôi lựa chọn tốc độ pha động từ 0,4 – 0,8 ml/phút để tiến hành khảo sát bƣớc tiếp theo với chƣơng trình gradient 4. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong hình 3.4 dƣới đây.
33 u: 0,8 ml/phút u: 0,7 ml/phút u: 0,6 ml/phút u: 0,5 ml/phút u: 0,4 ml/phút Hình 3.4: Sắc đồ khảo sát tốc độ dòng pha động.
34
Dựa vào kết quả sắc ký đồ thu đƣợc chúng tôi nhận thấy với chƣơng trình gradient 4 thì tốc độ dòng 0,8; 0,7 và 0,6 ml/phút xảy ra hiện tƣợng chồng pic giữa BBP và DBP, với tốc độ 0,4 ml/phút thì hiện tƣợng chồng pic đó không còn nhƣng làm kéo dài thời gian lƣu của các chất phân tích dẫn tới sự doãng chân pic của DINP và kéo dài thời gian phân tích mẫu. Với tốc độ dòng 0,5 ml/phút sự tách của BBP và DBP là rõ ràng hơn, thời gian phân tích một mẫu là 30 phút cũng không dài. Vì vậy chúng tôi chọn tốc độ dòng 0,5 ml/phút để phân tích.
3.1.7. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị.
Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi cho phép. Đối với hệ máy sắc ký, khi đã lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình tách, thì một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phân tích đó là độ lặp của thiết bị, bao gồm cả độ lặp diện tích pic và thời gian lƣu. Bảng 3.1 và 3.2 chỉ ra độ