Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản ( CE )

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM VĂN KIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ TẠP CHẤT ALKALOID có MẶT TRONG • • • MẪU HEROIN BẰNG SẮC KÝ KHÍ VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE) (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC 2001-2006) Người hướng dẫn :GVCTRẦNTÍCH THS. NGUYỄN XUÂN TRưìỉNG Nơi thực hiện : BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH VIỆN KHOA HỌC HÌNH s ự Thời gian thực hiện : 2-5/2006. - - Hà Nội, Tháng 5-2006 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè, và người thân. Nhân dịp hoàn thành khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến : GVC. Trần Tích. ThS. Nguyễn Xuân Trường. Là những người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm đề tài. Đồng thời, tôi xin chân thành cảm 0fn các thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, lãnh đạo Trung tâm giám định ma túy - Viện khoa học hình sự - Bộ Công an đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các phòng ban của trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Hà Nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên Phạm Văn Kiền MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Một số nét chung về mẫu heroin và vấn đề phân tích mẫu heroin 3 1.1.1. Mẫu heroin 3 1.1.2. Tình hình phân tích mẫu heroin trên thế giới và ở Việt Nam 6 1.2. Đại cương vê sắc ký khí 7 1.2.1. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí 7 1.2.2. Những khái niệm và phương trình cơ bản của sắc ký khí 8 1.2.3.Phương thức làm việc của sắc ký khí 10 1.3. Đại cương về điện di mao quản 11 1.3.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 11 1.2.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học micelle (MEKC) 15 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 18 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18 2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 18 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 19 2.2. Kết quả thực nghiệm 20 2.2.1. Phương pháp sắc ký khí 20 2.2.2. Phương pháp điện di mao quản 32 2.3. Bàn luận kết quả 37 2.3.1. Phương pháp sắc ký khí 37 2.3.2. Phương pháp điện di mao quản 37 PHẦN 3: KẾT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHU LUC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3-MAM 3-Mono Acetyl Morphin. 6 -MAM 6 -Mono Acetyl Morphin. AC Acetylcodein. CH Capillary Electrophoresis. CGE Capillary Gel Electrophoresis CIEF Capillary Iso-Electric Focusing c rip Capillary Iso-Tacho-Phoresis. CMC Critical Micellary Concentration. CZE Capillary Zone Electrophoresis. DAD Diode Array Detector. DAM Diacety Imorphin. EFF Electric Field Force. EOF Electro - Osmotic Flow. FID Flame Ionization Detector. GC Gas chromatography. HPLC High Pressure Liquid Chromatography. IS Internal Standard. LT Lượng thêm. MEKC Micellary Electro-Kenetic Capillary. RSD Độ lệch tương đối. SD Độ lệch chuẩn. 'l'B Trung bình. S11 Số thứ tự. TH Thu hồi. TLTH Tỉ lệ thu hồi. SDS Sodium Dedocyl Sulfat. ĐẶT VÂN ĐỂ. Ma tuý là hiểm hoạ của nhân loại. Heroin là chất ma tuý phổ biến nhất hiện nay ở nước ta (chiếm trên 80% số vụ ma tuý các loại) và việc buôn bán này đang có xu hướng diễn biến rất phức tạp. Để có một chiến lược vĩ mô nhằm phòng ngừa từ xa, cũng như trấn áp loại tội phạm này tận gốc, cần phải có những thông tin xác thực để trả lời các câu hỏi: ma tuý được sản xuất ở đâu, sản xuất như thế nào, đã dùng tiền chất nào, được phân phối, vận chuyển như thế nào, ? Do vậy, truy nguyên nguồn gốc heroin ở Việt Nam là một đòi hỏi thực tiễn và cấp bách trong công cuộc phòng chống ma tuý . Heroin là dạng bán tổng hợp từ morphin (qua một bước acetyl hóa), morphin được tinh chế từ thuốc phiện. Thuốc phiện chứa nhiều alkaloid, trong đó có các alkaloid chính là: Morphin, codein, noscapin, papaverin, thebain. Mẫu heroin trên thị trường thường là hỗn hợp các thành phần, ngoài thành phần chính là heroin còn có các alkaloid khác, đó là: Morphin, codein, 6 - MAM, 3-MAM, acetylcodein, papaverin, noscapin Tùy theo nguồn gốc của nguyên liệu (morphin thô) và phương pháp điều chế heroin khác nhau mà hàm lượng các tạp này khác nhau [19]. Các mẫu heroin thu được ở Việt Nam thường gồm có các tạp chất chính là: Morphin, acetylcodein, 6-MAM. Do vậy việc định lượng đồng thời 4 alkaloid; Heroin (nguyên chất), morphin, acetylcodein, 6 -MAM là một vấn đề quan trọng để truy nguyên nguồn gốc Heroin. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có phương pháp nào định lượng đồng thời 4 alkaloid trên. Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp điện di mao quản đã được ứng dụng trong phân tích mẫu heroin ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, đem lại kết quả định lượng tốt. [7], [10] Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản (CE)” nhằm mục tiêu: - Xây dựng phương pháp và triển khai kỹ thuật sắc ký khí mao quản định lượng đồng thời 4 alkaloid (heroin, morphin, acetylcodein, 6-MAM) trong mẫu heroin. - Bước đầu xây dựng phương pháp điện di mao quản vào việc xác định đồng thời 4 alkaloid trong mẫu heroin. Phần 1: TỔNG QUAN. 1.1. MỘT SỐ NÉT CHƯNG VỀ MẪư HEROIN VÀ VAN ĐỀ p h â n t í c h MẪU HEROIN. 1.1.1.Mẫu heroin.[19], [20] Những năm 70 của thế kỷ trước, dạng tổng hợp diacetyl morphin từ morphin (được tinh chế từ thuốc phiện) được công bố vào năm 1874. Năm 1898, công ty Bayer đặt tên thương mại cho sản phẩm này là heroin. Vào những năm đầu của thế kỷ XX, heroin được các giáo sư y học sử dụng một cách rộng rãi và đặc biệt được dùng để thay thế cho codein và morphin trong điều trị lao phổi và một số bệnh về đường hô hấp khác. Sau Hội nghị thế giới về ma tuý năm 1925, thanh tra quốc tế bắt đầu hạn chế cung cấp heroin và bắt đầu từ đó có sự sản xuất lậu heroin. Heroin là dạng bán tổng hợp của morphin (qua một bước acetyl hóa). Tuỳ theo tác nhân acetyl hoá khác nhau mà hình thành con đường bán tổng hợp khác nhau: a, Morphin + anhydrid acetic — > diacetyl morphin b, Morphin + acetyl clorid — > diacetyl morphin c, Morphin + acid Trifluoroacetic — > diacetyl morphin d, Morphin + ethylidene diacetate — > diacetyl morphin e, Demethyl hoá codein — > morphin (+ anhydrid acetic). Morphin được tinh chế từ thuốc phiện. Thuốc phiện (opium) là sản phẩm tự nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện (Papaver somniferum L.). Morphine cũng được thông báo tìm thấy ờ các cây Papaver setigerum; Papaver decaisnei và Papaver rhoeas. Trong thuốc phiện thô các thành phần chính bao gồm: mảnh thực vật, chất nhựa, các sterol, các alcol triterpenoid, acid béo, alcol, polysaccharid và trên 30 alkaloid khác nhau. Trong đó có 5 alkaloid chính được chia thành 2 nhóm theo cấu trúc hoá học: cấu trúc nhân phenanthren (gồm morphine, codeine, thebaine) và nhân benzylisoquinolin (gồm narcotine, papaverine). Alkaloid thứ sáu được đề cập gần đây là narceine, nhưng trong phần lớn các trưòfng hợp thì nồng độ của nó thấp hofn năm alkaloid kia. Ngoài ra trong thuốc phiện còn có acid meconic hàm lượng thay đổi khác nhau tuỳ theo loại thuốc phiện. Trong quá trình bán tổng họfp heroin từ morphin không tinh khiết thì sẽ tạo thành các tạp alkaloid trong mẫu heroin. Trong đó: - Acetyl hóa morphin tạo thành heroin, 3-MAM, 6 -MAM. - Acetyl hóa codein tạo thành acetylcodein. Trong mẫu heroin gặp ở Việt Nam, ngoài diacetyl morphin hay gặp các tạp alkaloid là: Morphin, acetylcodein, 6 -MAM. Dưới đây là một số tính chất vật lý của 4 alkaloid: Công thức hóa học, công thức cấu tạo, nhiệt độ nóng chảy, độ hòa tan. 13.1.1. Heroin (dmmorphin, diacetylmorphin, acetomorphin). [8 ], [19] Nhiệt độ nóng chảy (°C): C H 3C 0 0 N-CH3 Công thức phân tử: C2JH23NO5. Trọng lượng phân tử: 369.40. Base HCl (IH2O) 173 243-244 Độ hòa tan Base HCl Nước không tan dễ tan Methanol tan dễ tan Ethanol tan tan Chloroform dễ tan dễ tan Hằng số phân ly: pHg = 7,6 1.3.1.2. Morphin (morphium, morphia, duromorph, nepenthe, dolcotin) [8], [19] Nhiệt độ nóng chảy (°C): Base HCICSHP) 247 - 249 200 Độ hòa tan Base HQ Nước rất khó tan tan Methanol tan Ethanol it tan it tan Chloroform rất khó tan không tan Công thức phân tử: C17H19NO3 Trọng lượng phân tử: 285.34 Hằng số phân ly: pHa = 8,0 và 9,9 13.1.3. 6-Acetylmorphin (O^-Monoacetylmorphin, 6-0-Acetylmorphin)[8], [19] Nhiệt độ nóng chảy (°C): Base HCKSHP) 201 265-267 Base HCl rất khó tan tan Độ hòa tan Nước Methanol Ethanol Chloroform tan tan tan tan tan tan Công thức phân tử: C19H21NO4. Trọng lượng phân tử; 327.37 Nhiệt độ nóng chảy (°C): 1.31.4. Acetylcodein (6-Acetylcodein) [8], [19] Công thức phân tử: C20H23NO4. Trọng lượng phân tử: 341.41 Base HCKIHP) 133 345 Độ hòa tan Base HCl Nước rất khó tan tan Methanol tan tan Ethanol tan tan Chloroform tan tan 1.1.2. Tình hình phân tích mẫu Heroin trên thê giới và ở Việt Nam. Trên thế giới hiện nay có ba kĩ thuật được sử dụng để xác định các tạp chất chính trong mẫu Heroin: - Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao - HPLC [13], [14]: Từ những năm 1986, HPLC cột pha đảo được sử dụng để định lượng heroin và các tạp chất alkaloid. Phương pháp này hạn chế khi phải phân tích các mẫu có nồng độ các chất cách nhau quá xa, dẫn tới việc vượt qua giới hạn tuyến tính của detectơ. Hơn nữa, về mặt kinh tế cần phải dùng nhiều dung môi có độ tinh khiết cao và thời gian phân tích dài. Nếu giảm thời gian phân tích thì độ đúng và độ chính xác của morphin bị hạn chế, do nó rửa giải quá sớm gần thời gian chết của cột. Phương pháp này đã được ứng dụng tại Mỹ từ 1986, nhưng đến năm 2003 được thay thế bằng phương pháp Điện di mao quản. - Kĩ thuật sắc ký khí - GC [6 ], [10], [11], [12], [15], [16], [17], [18]: Từ năm 1982, phương pháp sắc ký khí được ứng dụng để phân tích các tạp chính trong mẫu heroin. Năm 1992 phương pháp này được nghiên cứu trên mẫu dẫn [...]... lượng các tạp chất trong mẫu Heroin - Kĩ thuật điện di mao quản - CE [6 ], [7]: Được tiến hành với cả hai loại: Điện di mao quản vùng (CZE) và điện di mao quản động học micelle (MEKC) Đây là phương pháp mới, có nhiều ưu điểm về độ phân giải, thời gian phân tích, do đó có thể được ứng dụng nhiều trong tương lai Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu nào về các tạp chất chính trong mẫu heroin ở Việt... đồng thời các tạp chất chính trong mẫu Heroin bằng 2 phương pháp sắc ký khí và điện di mao quản như hai mục tiêu của khóa luận đã nêu trên 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỂ SẮC KÝ KHÍ.[1], [4] 1.2.1 Thiết bị sắc ký khí Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector Nhờ có khí mang chứa trong bom khí (hoặc máy phát kh ) , mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều... Điện di mao quản vùng : CZE - Điện di mao quản điện động học micelle ; MEKC - Điện di mao quản loại gel : CGE - Điện di mao quản hội tụ đẳng điện : CIEFL - Điện di mao quản đẳng tốc độ : CITP 1.3.1.5 ưu, nhược điểm của phương pháp điện di mao quản. {?>], [5] * í/ím điểm - Hiệu lực tách cao - Yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (vài nanogram) - Tiêu tốn ít thuốc thử và dung môi, dung môi không độc và kinh... cung cấp bởi một nguồn điện thế cao một chiều (1 0-50kV) đặt vào hai đầu mao quản Cơ chế của điện di là sự di chuyển khác nhau của chất tan trong ống mao quản dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (EFF), và tính chất của dòng chảy điện thẩm (EOF) Dòng EOF là một loại dòng chảy khối của chất lỏng trong ống mao quản Dòng EOF sẽ quy t định thời gian tồn tại của chất tan trong ống mao quản Nó tồn... chất hấp phụ ( óng vai trò như chất mang) giữa thành trong của cột và lớp phim của pha tĩnh 1.3 ĐẠI CƯƠNG VỂ ĐIỆN DI MAO QUẢN 1.3.1 Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản. [2], [5], [8] Nguyên tắc của các kỹ thuật tách điện di mao quản là dựa trên cơ sở sự di chuyển của các phân tử chất tan trong ống mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly (có chất đệm pH thích hợp), dưới tác dụng của một điện trường... điện di; Vgp (cm/s): V ep = Li tm : Qiiều dài mao quản từ điểm đầu đến Detector * Cường độ điện trường: E (V/cm) E =^ L V : Điện thế giữa hai đầu mao quản (V) L : Tổng chiều dài của cột (cm) * Độ lưu động điện di; Ịigp (cm^/s) q : Điện tích của tiểu phân r| : Độ nhớt của dung dịch đệm r : Bán kính của tiểu phân * Mối liên quan giữa tốc độ điện di (Vgp) và độ lưu động điện di (figp): 13 V, E Ld •Lt... điều kiện phân tích - Dung môi pha mẫu: Các chất phân tích tan tốt trong methanol, còn chất nội chuẩn heneicosan tan tốt trong ethylacetate Hai dung môi này có thể trộn lẫn vào nhau Vì vậy dung môi pha mẫu được chọn là hỗn hợp methanol ethylacetate ( 1 - 1 ) - Chọn cột mao quản (pha tĩnh): 4 alkaloid có trong mẫu heroin là: diacetylmorphin, morphin, acetylcodein, 6 -MAM là những chất hơi phân cực,... pháp sắc ký khí cho kết quả định lượng tốt đồng thời 4 alkaloid trong 15 mẫu Heroin - Qua kết quả định lượng các mẫu Heroin thực tế, ta thấy tạp Morphin trong mẫu Heroin là rất ít, tạp chủ yếu là 6 -MAM và AC 2.2.2 Phương pháp điện di mao quản 2.2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích * Dung môi pha mẫu: Chọn dung môi pha mẫu là MeOH, do các alkaloid trong mẫu Heroin tan tốt trong MeOH, và MeOH tan trong. .. tiểu phân đó Nó chính là các micelle Các Micelle ở đây hoạt động như một pha tĩnh giả Các phân tử của chất phân tích được phân bố vào cả trong micelle và cả ngoài micelle theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Kị xác định, trong những điều kiện nhất định đã chọn để chạy điện di là mỗi chất tan Xj sẽ có một hằng số phân bố Kị nhất định Nếu các Kj của các chất tan khác nhau rõ rệt thì sẽ có kết... độ: Có ảnh hưỏíng đến độ nhót và độ dẫn điện của đệm, vì thế nó ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển Trong một số trường hợp, nhiệt độ trong ống mao quản tăng là nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của Protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân tích - Cột mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) góp phần vào thời gian phân tích và hiệu quả phân tích Nếu tăng cả hai yếu tố (chiều . tốt nghiệp: Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản (CE) ” nhằm mục tiêu: - Xây dựng phương pháp và triển khai. KIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ TẠP CHẤT ALKALOID có MẶT TRONG • • • MẪU HEROIN BẰNG SẮC KÝ KHÍ VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE) (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC 2001-200 6) Người. triển khai kỹ thuật sắc ký khí mao quản định lượng đồng thời 4 alkaloid (heroin, morphin, acetylcodein, 6-MAM) trong mẫu heroin. - Bước đầu xây dựng phương pháp điện di mao quản vào việc xác định