Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng hóa chất 2,4 d trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ

Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, nhằm góp phần phục vụ công tác đảm bảo chất lượng thuốc có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược HÀ NỘI• •

NGHIÊN cúu XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH■

Dư LƯỢNG ■ HOÁ CHẤT 2,4-0 TRONG Dược LIỆU* ■ ■

ThS Nguyễn Tường Vy

Trung Ương

LÊ THỊ THU TRANG

BẰNG SÂC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

L Ò I C Ẩ M Ơ N

Trước ãêí em xin bày tỏ Còng biết ơn sâu sắc tới *zỵ ‘ĩrẩn Việt ĩCùng,

m s Nguyễn Tường Vy, những người đã trực tiếp íiưâng dân, cíit sảo cho em trong quá trình nghiên cứu và thực diện Cuận văn này.

(Em jỷn gửi ữfi cãân thành cảm ơn tới (Ban giám đốc Viện íịiổn nghiệm

tíiuốc Trung ‘Uơng và toàn thể cán 6ộ %Ịư>a vật [ý đo Cường-Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ‘Ương ẩẫ tuôn giúp đờ và tạo ấiều íịịện cho em trong quá trìnã em thực hiện Cuận văn.

<Em cũng jận chân thành cầm ơn (Ban giấm ẫiệu, cấc thầy cô truồng <Đại Học

(Dicợc Jỉà !Nọị cấc thầy cô và các cán Sộ <BỘ môn ữíoá <Dược, cBộ môn 9íoá phẩn

tích- độc chất đã dạy dỗ, dìu ẩắt, giúp đõ em rất lúiều trong quá trình học tập và ngkiêncứu.

Cuối cùng em vô cùng 6ỉết ơn 6Ốmẹ, anâ trai, người thân, 6ạn 6è đã Cuôn ỏ 6ên em động viên và giúp đd em.

ỈNgày 16 tháng 5 năm 2007

Tấc giả

L<Ê <rm m o <r<RAỉxg

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỂ /

PHẨN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1- TỔNG QUAN VỂ 2,4-D 3

1.1.1 Đặc điểm hoá lý 3

1.1.2 Độc tính của 2,4-D 5

1.1.3 Tinh hình sử dụng 6

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH D ư LƯỢNG 2,4-D 7

1.2.1 Xử lý mẫu 7

1.2.2 Phân tích định tính và định lượng 8

1.3 TỔNG QUAN VỂ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PH Ổ 9

1.3.1 Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ 9

1.3.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 10

1.3.3 Một số kỹ thuật LC-MS 14

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 16

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 20

2.2.1 Chuẩn bị m ẫu 20

2.2.2 Khảo sát xây dựng chương trình sắc k ý 20

2.2.3 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ để định tính và định lượng 2,4-D 23

2.2.4 Xây dựng phương pháp chiết và làm sạch 30

2.2.5 Phân tích mẫu 32

2.2.6 Kết quả phân tích 2,4-D trong một số mẫu dược liệu 33

2.3 BÀN LUẬN 34

2.3.1 Về đối tượng phân tích 34

2.3.2 Về phương pháp phân tích 35

2.3.3 Về kết quả phân tích trên m ẫu 37

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 38

3.1 KẾT LUẬN 38

3.2 ĐỂ XUẤT 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

(Kỹ thuật ion hoá bằng hoá học ở áp suất thường)

Atomic mass unit(Đơn vị khối lượng nguyên tử)Collision Energy

(Năng lượng va chạm)Công thức phân tửDược điển Việt Nam xuất bản lần thứ ba

Electron captured detector (Detector cộng kết điện tử)Environmental protection agency (Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ)Electrospray Ionization

(Kỹ thuật ion hoá bằng phun điện tử)Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thực phẩm,dược phẩm)Good Agriculture Practise

(Thực hành nông nghiệp tốt)Gas Chromatography (Sắc ký khí)

Gas Chromatography-Mass spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

Hoá chất bảo vệ thực vật

HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)LC-MS : Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng ghép khối phổ)

MS : Mass Spectrometry (Khối phổ kế)

PDA : Photo Diod Array (Chuỗi diod quang)

QIT : Quadrupole lon Trap

(Bộ phân tích khối bẫyion)RSD : Relative Standard Deviation

(Độ lệch chuẩn tương đối)SIM : Selected lon Monitoring

S/N : Signal to noise Ratio

(Tỷ số tín hiệu trên nhiễu)SPE : Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TIC : Total lon Chromatogram

(Chế độ quét toàn bộ ion)UV-VIS : Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến)

WHO : World Health Organization

(Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max 16 Hình 2.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 2,4-D trong pha động nồng độ lppm, tốc độdòng 0,5 mL/phút 21Hình 2.3 Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các dung dịch chuẩn 2,4-D (0,5-10ppm) phân tích theo chương trình sắc ký sử dụngdetectorPDA 22Hình 2.4 Phổ khối của 2,4-D nồng độ lOppm trong pha động 25Hình 2.5 Phổ khối của 2,4-D 10 ppm trong pha động, CE = 30 V 25Hình 2.6 Phổ khối (MS2) của 2,4-D nồng độ 10 ppm trong pha động, CE = 25%,mảnh mẹ 219-> mảnh con 161 26Hình 2.7 Phổ khối (MS2) của 2,4-D nồng độ 10 ppm trong pha động, CE = 5%,mảnh mẹ 221-> mảnh con 163 27Hình 2.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 2,4-D pha trong pha động nồng độ 0,5 ppm,tốc độ dòng 0,2 mL/phút 28Hình 2 9 Tương quan hồi quy tuyến tính giữa diện tích píc và nồng độ của các dung dịch chuẩn 2,4-D (0,01-lppm) phân tích theo chương trình sắc ký LC-MS30 Hình 2.10 Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb 2,4-D, tốc độ dòng 0,3 mL/phút 33

ĐẶT VẨN ĐỂ

Dược liệu là nguồn nguyên liệu quan trọng của nền y học cổ truyền và của ngành công nghiệp dược phẩm Trong những năm gần đây xu hướng trên thế giói dùng thảo dược không tách hoạt chất ngày càng nhiều Ngày nay, hiệu quả điều trị và tính an toàn của thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày càng được quan tâm Hơn nữa, trong mối quan hệ mật thiết vói y học hiện đại, việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược đòi hỏi cần phải có các chứng cứ khoa học lâm sàng chứ không đơn thuần dựa vào kinh nghiệm [18]

Từ xa xưa con người đã biết dùng các chất độc để phòng trừ dịch hại Sản xuất nông nghiệp ngày càng phát triển, dịch hại ngày càng nhiều và đa dạng, hoá chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) cũng được phát minh và sử dụng rất phổ biến đem lại nhiều lợi ích to lớn

Ở nước ta, HCBVTV được sử dụng rộng rãi với mục đích phòng trừ sâu bệnh, chuột, cỏ dại có hại cho cây trồng và nông sản, trong đó bao gồm cả các loài thảo dược Bên cạnh những mặt tích cực, HCBVTV cũng đã để lại những hậu quả xấu, phá vỡ cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, thực phẩm, thảo dược gây ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người

Nếu như trước đây với thảo dược người ta chỉ quan tâm đến hoạt chất có tác dụng sinh học thì ngày nay còn cần phải đảm bảo sử dụng an toàn Trong

đó, việc kiểm tra và khống chế dư lượng HCBVTV trong thảo dược là hết sức cần thiết

Chất 2,4-D (acid 2,4-Diclorophenoxyacetic) thuộc nhóm trừ cỏ, sử dụng

ở nồng độ thấp có tác dụng kích thích sinh trưởng, được Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn cho phép sử dụng [5] Uỷ ban Tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (CODEX Alimentarius) cũng như nhiều nước trên thế giới cho phép dùng 2,4-D làm chất trừ cỏ dại [20] Hỗn hợp 2 chất 2,4-D và 2,4,5-T (Acid

triclorophenoxy acetic) với tỷ lệ 50:50 có chứa một tạp chất rất độc là 2,3,7,8 TCDD (Tetra Cloro Dibenzo-p-Dioxin) hay còn gọi là dioxin, rất độc với môi

sinh và sức khoẻ con người ở nồng độ rất thấp, hiện nay đã bị cấm sử dụng

trong nông nghiệp

Hóa chất 2,4-D dùng diệt cỏ dại tồn lưu trong đất có thể lây nhiễm cho cây trồng hoặc có thể lạm dụng làm chất kích thích trong trồng cây thuốc Dư lượng của 2,4-D được quy định trong nông sản từ 0,1- 0,5 mg/kg, trong môi trường là 0,07 mg/L [30]

Ở nước ta, hiện chưa có phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong dược liệu

Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, nhằm góp phần phục vụ công tác đảm bảo chất lượng thuốc có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng hoá chất 2,4-D trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ” với hai mục tiêu chính:

1) Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong dược liệu bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS).

2) Khảo sát dư lượng 2,4-D trong một số mẫu dược liệu.

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Độ tan: khó tan trong nước (620 mg/L ở 25°C), tan trong ethanol và một

số dung môi hữu cơ khác Là một acid mạnh ăn mòn kim loại

Tổng hợp 2,4-D [25]

2,4-D thường được tạo ra bởi sự ngưng tụ của 2,4-Diclorophenol và acid

monocloroacetic trong một kiềm mạnh ở nhiệt độ thường hoặc do sự khử clo

của acid phenoxy

Môi trường kiềm và nhiệt độ phản ứng cao trong suốt quá trình sản xuất2,4-D dẫn đến sự tạo thêm các sản phẩm dẫn chất clo của dibenzo-p-dioxin (CDD)

Ngày nay vói công nghệ hiện đại có thể sản xuất 2,4-D không có tạp dioxin, nhưng người ta đã chứng minh không thể sản xuất 2,4,5-T tinh khiết

không có dioxin.Vì lẽ đó mà 2,4,5-T đã bị cấm sử dụng ở Mỹ từ năm 1983 và sau đó cũng dần bị cấm sử dụng ở nhiều nước trên thế giói.

Các muối kim loại của 2,4-D được sản xuất bởi phản ứng của 2,4-D vói các base kim loại thích hợp Các muối thường gặp là Na, Ca, Fe và Mg

Các muối amin thu được bằng phản ứng hoá học của amin và 2,4-D trong dung môi thích hợp

Các ester được tạo thành bằng phản ứng ester hoá với sản phẩm chưng cất đẳng phí của nước với xúc tác acid hoặc bằng phản ứng tổng hợp thẳng từ ester của acid monocloroacetic vói diclorophenol

Dẫn xuất của 2,4-D [12],[25]

Có nhiều dạng dẫn xuất của 2,4-D như: các ester, các amin và muối.Nhiệt phân các muối amin khác nhau của 2,4-D tạo ra các amin tươngứng

Nhiệt phân 2,4-D và dẫn xuất của nó có khả năng tạo ra sản phẩm chứa các đồng phân CDD (polycloro-dibenzo-p-dioxin)

Các ester của 2,4-D với alcol mạch ngắn rất dễ bay hơi Điều này gây ảnh hưởng đáng kể đến hiệu lực của chúng khi sử dụng cho cây trồng, gây hậu quả cho các cây trồng lân cận và làm ô nhiễm bầu khí quyển

Các muối kali hoặc amin ít bay hơi hơn các ester nên được ưu tiên hơn khi sử dụng.

Khi tiếp xúc với 2,4-D (công nhân ở nhà máy sản xuất 2,4-D, nông dân

khi phun thuốc ) có thể nhiễm độc 2,4-D 2,4-D và các dẫn xuất của nó có thể được hấp thu theo đường miệng, qua da và đường hô hấp, nhưng hơn 90% tổng lượng 2,4-D hoặc các hợp chất clorophenoxy khác vào cơ thể là do xâm nhập qua da 2,4-D phân bố đến khắp cơ thể nhưng sự tích luỹ của nó thì không được biết rõ ràng và được bài tiết chủ yếu theo đường nước tiểu dưới dạng acid và base phenoxy kết hợp [25]

Các triệu trứng thường thấy khi nhiễm độc 2,4-D [25],[29]

• Kích thích da, mắt và đường hô hấp

• Hít vào có thể gây cảm giác nóng mũi, ngực, cổ họng, hoa mắt

• Đau đầu, ôn mửa, ỉa chảy

• Các hành vi hỗn loạn, kì quái hoặc hung hãn

• Ảnh hưởng xấu đến thận (nặng có thể suy thận), làm chậm nhịptim

• Acid hóa chuyển hoá gây mùi lạ cho hơi thở

Trong các sản phẩm 2,4-D thường có một số lượng chất clophenol không được tổng hợp hết (gọi là phenol tự do) tạo nên mùi nặng, khó chịu của2,4-D

Trong tự nhiên, clorophenol tồn tại tương đối lâu và có thể chuyển hoá thành chất dioxin (2, 3, 7, 8-tetraclorodibenzo-p-dioxin) [5] Đây là chất có độc tính rất cao, rất bền vững, độ tan trong nước rất thấp [2] Dioxin rất nguy

hiểm với môi trường, có khả năng kích thích tế bào ung thư phát triển, gây đột biến tế bào và dị dạng cơ thể ngưòi và động vật máu nóng.

Lượng clorophenol nhiều hay ít tuỳ thuộc trình độ công nghệ sản xuất2,4-D Theo quy định của tổ chức y tế thế giới (WHO) hàm lượng clorophenol trong các chế phẩm 2,4-D dùng trong nông nghiệp không được quá 0.3% [5]

1.1.3 Tình hình sử dụng [5],[12],[20],[25],[27],[28]

Trên thế giới

Là chất diệt cỏ dại đầu tiên, sử dụng ở Mỹ từ đại chiến thế giới thứ II,

trở nên nổi tiếng do là thành phần trong chất độc chiến tranh sử dụng làm chất

khai quang ở Việt Nam Do là chất diệt cỏ kinh điển, không còn bảo hộ bản

quyền cho nên 2,4-D được rất nhiều công ty hóa chất nông nghiệp khác nhau trên thế giới sản xuất, có thời gian sử dụng tràn lan, và cũng do sử dụng trong một thời gian lâu dài nên đã để lại những vấn đề về môi trường 2,4-D là chất diệt cỏ chọn lọc, diệt trừ các loại cỏ năn lác và lá rộng cho các cây trồng hòa bản như lúa, ngô, mía Ngoài ra còn có tác dụng điều hoà sinh trưởng nhóm Auxin, do đó còn sử dụng là chất kích thích đặc biệt là mầm, rễ [12]

2,4-D gây trở ngại quá trình sinh trưởng bình thường của thực vật Nó được hấp thu qua lá, thân, rễ Trong thực vật 2,4-D bị thoái hóa bởi các con đường hoá học và sinh học khác nhau [25]

Ở Việt Nam

Hiện nay, 2,4-D vẫn thuộc danh mục hoá chất diệt cỏ được phép sử

dụng ở Việt Nam (theo danh mục hoá chất bảo vệ thực vật được phép, hạn chế

và cấm sử dụng ở Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2004) [5]

Gần đây có rất nhiều thông tin về việc lạm dụng 2,4-D để làm chất kích thích như ngâm giá đỗ ở Hà Nội và thông tin hoa quả nhập từ Trung Quốc về Việt Nam cũng bị ngâm 2,4-D

Vì được sử dụng làm thuốc diệt cỏ và kích thích sinh trưởng, nên dư lượng của 2,4-D được quy định trong nông sản theo Uỷ ban dinh dưỡng của liên hợp quốc (CODEX ALIMENTARIUS) là từ 0,1- 0,5 mg/kg [20].

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG 2,4-D

1.2.1 Xử lý mẫu

Bao gồm các kỹ thuật chiết, làm sạch và làm giàu chất phân tích Hiện nay có rất nhiều quy trình xử lý mẫu nhằm chiết 2,4-D từ các đối tượng môi trường (đất, nước bề mặt ), thực phẩm và nông sản

1.2.1.1 Chiết thông thường [8],[15]

• Chiết lạnh

Nguyên tắc: sử dụng dung môi hữu cơ để chiết chất phân tích tan trong

dung môi từ mẫu đã được nghiền nhỏ ở nhiệt độ thường Sau đó làm sạch bằng

hấp phụ pha rắn Có thể sử dụng một số tác nhân vật lý bổ trợ như: lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm

Áp dụng: Là kỹ thuật phổ biến nhất sử dụng chiết HCBVTV từ nông

sản và dược liệu

Dung môi: Aceton, hexan, ether dầu hoả.

Ưu, nhược điểm: Kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém Tuy nhiên, nhược điểm

là sử dụng dung môi hữu cơ gây tổn hại đến môi trường và sức khoẻ, nếu chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực hàm ẩm trong mẫu không được quá lớn

• Chiết nóng trong dụng cụ Soxhlet

Nguyên tắc: Dùng dung môi ở nhiệt độ cao chiết liên tục và chiết kiệt

chất phân tích trong mẫu đã nghiền nhỏ

Áp dụng: Cho mẫu đất, nông sản, môi trường, chè và dược liệu.

Dung môi: Hỗn hợp ether dầu hoả hoặc hexan và aceton.

ưu, nhược điểm: Là kỹ thuật chiết kinh điển nhưng hiệu quả Nhiệt độ

sôi của hỗn hợp dung môi hữu cơ không quá cao tránh làm phân hủy các chất phân tích Nhược điểm là thường tốn dung môi hữu cơ và thời gian chiết dài

Hiện nay, phương pháp phân tích 2,4-D trong đất (TCVN 6134:1996)

sử dụng kỹ thuật chiết Soxhlet

1.2.1.2 Làm sạch và làm giàu chất phân tích trong mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) [1],[8],[15],[17],[26]

Nguyên tắc: Chất phân tích được tách từ mẫu bằng một chất rắn, sau đó

rửa giải bằng dung môi thích hợp

Cột Silica gel dùng trong phân tích dư lượng rất phân cực, có tính chất hấp phụ mạnh hoạt động theo nguyên tắc giữ lại tạp chất phân cực và để chất phân tích ít hoặc không phân cực đi qua cột

Áp dụng: Sử dụng SPE với pha tĩnh là Silica gel để chiết, làm sạch chất

phân tích

Ưu, nhược điểm: Có thể giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ được sử

dụng, chiết khá chọn lọc, thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi chất cao, hiệu quả chiết tốt, độ lặp lại cao và có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn còn khá đắt, sử dụng chưa thật phổ biến ở Việt Nam

1.2.2 Phân tích định tính và định lượng

Phương pháp phân tích 2,4-D trong môi trường theo Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA), hoặc theo Hiệp hội hoá học phân tích quốc tế (AOAC)

là sử dụng sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC-MS) [22]

Phương pháp phân tích 2,4-D trong thực phẩm theo cơ quan quản lý thực phẩm, dược phẩm (FDA) của Mỹ cũng tương tự Ngoài ra, người ta còn tạo dẫn xuất methyl ester của 2,4-D dễ bay hơi, phân tích bằng sắc ký khí với detector MS hoặc ECD

sử đụng sắc ký khí [25]

2,4-D là một acid hữu cơ, khá phân cực, ít bay hơi tuy nhiên có thể làm bay hoi nhờ dẫn xuất hoá Để phân tích 2,4-D bằng sắc ký khí, kỹ thuật thường dùng nhất là tạo dẫn xuất ester (ví dụ tạo methylester bằng phản ứng với BF3-methanol, diazomethal hoặc với hỗn hợp acid sulfurid-methanol) Sau

đó thực hiện kỹ thuật lấy mẫu không gian hoi (head space) Để phân tích, sử dụng sắc ký khí mao quản với detector ECD (do 2,4-D có 2 nguyên tử clo trong phân tử, do đó ECD rất nhạy vói 2,4-D) hoặc khối phổ

Sử dụng sắc ký lỏng [4]

Theo TCVN 6134 : 2006, phương pháp định lượng 2,4-D trong đất, được xây dựng từ năm 1996, để định tính và định lượng 2,4-D, sử dụng sắc ký

lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector u v ở 230 nm Nhược điểm của

phương pháp là có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp

Hiện nay trên thế giới, chủ yếu sử dụng LC-MS để phân tích dư lượng2,4-D trong các đối tượng môi trường, nông sản và thực phẩm Phương pháp này có tính đặc hiệu và có độ nhạy cao

1.3 TỔNG QUAN VỂ SẮC KÝ LỎNG KHỔl PHỔ

1.3.1 Vài nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [10]

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS)

Trong kỹ thuật LC-MS, hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được tách khi qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ

Sự kết nối sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) đầu tiên được thực hiện năm 1950, chỉ 4 - 5 năm sau sự ra đời của GC Sự kết nối sắc ký lỏng với khối phổ kế là rất dễ nhận ra do lĩnh vực rộng lớn của các hợp chất có thể dùng HPLC để phân tích bao gồm những chất kém bền vói nhiệt và các phân tử kém bay hơi không thể sử dụng sắc ký khí, và do độ chọn lọc cao của HPLC

Vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống có độ chân không cao (hệ thống phân tích khối phổ) là nhân tố chủ yếu của sự chậm trễ này Chính vì vậy, mặc dù kỹ thuật sắc ký lỏng ra đời trước sắc ký khí nhưng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) được thực hiện trước kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), mãi đến năm 1970 việc kết nối LC-MS mới thành công.

Người ta thường sử dụng phương pháp LC-MS cho: [9]

+ Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi(GC-MS rất khó thực hiện hay không thực hiện được)

+ Các phân tích kiểm nghiệm phức tạp mà HPLC thường không giảiquyết được

+ Các nghiên cứu về cấu trúc một số phân tử có nguồn gốc tự nhiên.Phân tích khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức cấu tạo, định tính và định lượng các chất trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên [1],[19]

1.3.2 Thiết bị sắc ký lỏng khôi phổ [1],[3],[9],[10],[11],[19],[21]

1.3.2.1 Pha động

Trong sắc ký lỏng, thành phần của dung môi rửa giải (pha động) là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách Pha động thường là các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch nước

Có hai cách dùng pha động để rửa giải:

• Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký

• Gradient: Pha động thường là hỗn hợp dung môi, thuờng là 2 đến 4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi)

1.3.2.2 Bơm

Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký Yêu cầu của bơm là phải đẩy được dung môi rửa giải

thành dòng qua cột tách và không có xung ở áp suất cao Dòng không liên tục

sẽ gây nhiễu đường nền

1.3.2.3 Cột tách

Cột HPLC thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm Kích thước hạt của chất nhồi trong cột thường là 5-10 |j.m Các chất nhồi thường được sử dụng là Silica gel, hoặc các loại pha đảo C2, C8, C18

Cột tách sắc ký lỏng phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và

có thể chịu được áp suất cao

1.3.2.4 Detector khối phổ

Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC là detector Việc chọn detector để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của chất cần phân tích Hiện nay người ta hay sử dụng các loại detector sau:

Detector hấp thụ tử ngoại (UV), detector huỳnh quang, detector điện hóa, detector chiết suất vi sai, detector khối phổ, detector đo độ dẫn

Việc sử dụng khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại một số ưu điểm:

• Có thể đưa ra thồng tin về cấu tạo hoá học của chất phân tích, thông tin này đặc hiệu hơn là khi sử dụng các loại detector khác (detector tử ngoại khả kiến, detector hồng ngoại, detector điện hoá

• Có tính chọn lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích

• Có độ nhạy cao (phân tích được dư lượng các chất ở mức ppb) vì dòng khối phổ nhạy [10]

Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic)

có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

b Nhiệm vụ của detector khối phổ [9]

- Đối với phân tích định tính: Khi ghép vói thiết bị sắc ký lỏng, hoá chất được xác nhận bằng:

+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định tR đặc trưng cho hoá chất tR này

chính là thời gian từ lúc hoá chất bắt đầu vào cột và ra khỏi cột để vào detector khối phổ

+ Phổ khối tương ứng của hoá chất hoặc phổ khối biểu diễn cường độ các ion sinh ra từ một ion nhất định của hóa chất

Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu

- Đối với phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho định lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao

c Các bộ phận của detector khối phổ [1],[9],[19]

- Bộ nạp mẫu:

Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ

+ Nhiệm vụ:

• lon hoá chất cần phân tích

• Chuyển ion từ pha dung dịch vào pha hoi

• Khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối

• Cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong

chân không sâu

• Rút ra ngoài các phân tử trung hoà và ion khác dấu có thể ảnhhưởng đến phép đo

+ Kỹ thuật ion hoá: Hiện nay sử dụng chủ yếu hai kỹ thuật phun điện tử (ESI) và ion hoá bằng hoá học ở áp suất thường (APCI)

Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI, kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất trong LC-MS Kỹ thuật này được mô tả như sau:

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3 - 5 KV (điện thế dương ở đầu kim tạo

ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy chất khảo

sát) và sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản Dưới tác dụng của điện thế cao và luồng khí phun nitơ, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện thoát ra từ đầu ống mao quản

Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bể dần ra thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ bị bơm hút ra ngoài

- Bộ phận phân tích khối:

Bộ phân tích khối được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Các ion được

gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector.

- Bộ phận phát hiện ỉon:

Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện

tử của máy khối phổ

1.3.3 Một số kỹ thuật LC-MS [9],[19]

1.3.3.1 Kỹ thuật phân tích toàn thang (Full scan)

Giả sử ta có một hỗn hợp A, B, c được tách ra sau khi qua cột sắc ký lỏng và lần lượt đưa vào detector khối phổ:

A -► A+l, Aj, A2, A3

Khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ A, B, c Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram) và phổ khối được lấy toàn

bộ (FULL SCAN MS) các ion sinh ra từ A, B, c.

c

B

A

Trong sắc đồ toàn ion , mũi A biểu diễn tổng cường độ các ion A+l, Aj, A2, A3 sinh ra từ mũi A, mũi B biểu diễn tổng cường độ các ion B+l, Bj, B2, B3 sinh ra từ B và tương tự cho mũi c.

FƯLL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

1.3.3.2 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ỉon (SIM, Selectỉve Iort Monitoring)

Nếu ngay từ đầu ta chỉ cho khối phổ kế nhận diện ion Aj (z = 1) mà thôi

và ghi sắc đồ theo thời gian, ta nói đã áp dụng kỹ thuật SIM để phát hiện, và sắc đồ lúc bấy giờ chỉ ghi tất cả các mũi có chứa Aj mà thôi Ta nói lấy khối phổ SIM (m/z = Aj) Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền

và do đó tăng độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu s/nhiễu đường nền N

Có thể sử dụng kỹ thuật SIM để định lượng với điều kiện biết chắc chắn

là mũi ở thời gian lưu tA đúng là mũi của hợp chất A thuần tuý, không có tạp

chất nào có ion Aj có cùng thời gian lưu tA Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một nền mẫu phức tạp

Kỹ thuật SIM nhạy hơn so vói FULL SCAN

1.3.3.3 Kỹ thuật MS/MS

Đối với kỹ thuật MS/MS, một ion chọn lọc ồ chế độ MS lần 1 được

phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy tạo ra một hoặc vài ion

con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2.

Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đưòng nền rất đáng kể Trong một nền phức tạp, sử dụng kỹ thuật này giúp xác nhận cấu trúc và định lượng tốt hơn

PHẦN 2

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Dụng cụ chiết pha rắn (SPE Maniíold, Supelco).

- Cột chiết pha rắn 3 mL, nhồi 0,5g Silica gel tinh khiết dùng cho phân tích dư lượng có kích thước 63-200 |um (Altech)

- Máy cất quay chân không (Rovator, Buchi RE 111)

- Máy lắc siêu âm Branson 5200

- Thuyền tán, rây

2.1.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là dư lượng 2,4-D trong dược liệu Do 2,4-D là chất diệt cỏ nên chúng tôi chọn dược liệu là bộ phận dưới mặt đất như rễ, thân

Để xây dựng phương pháp, chúng tôi sử dụng mẫu Nhân Sâm Hàn Quốc sạch Mẫu này không có 2,4-D và được cung cấp bởi khoa kiểm nghiệm Đông dược Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Xử lý mẫu

- Chuẩn bị mẫu: bao gồm mẫu chuẩn và mẫu nhiễm.

- Xác định hàm ẩm: Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 5.16 Xác định

mất khối lượng do làm khô

- Chiết đối tượng nghiên cứu từ mẫu dược liệu:

Khảo sát 2 kỹ thuật chiết:

- Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch:

Dựa vào hiệu suất (tỷ lệ) thu hồi (ký hiệu là %R) trên mẫu nhiễm Mẫu nhiễm được tạo ra từ mẫu dược liệu sạch bằng phương pháp thêm chuẩn Chiết

và làm sạch mẫu nhiễm theo phương pháp đã nêu trên, phân tích sắc ký và xác định hiệu suất thu hồi

Tiêu chuẩn đánh giá phương pháp chiết: Áp dụng tiêu chuẩn ghi trong dược điển Mỹ hoặc dược điển Châu Âu, phương pháp chiết được chấp nhận nếu 70% < %R < 110%

2.1.2.2 Định tính và định lượng 2,4-D chiết ra từ mẫu dược liệu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ

a Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký

Sử dụng dung dịch chuẩn 2,4-D ìoppm trong pha động tiêm vào hệ thống HPLC với detector PDA, để khảo sát xây dựng chương trình sắc ký (pha động, tốc độ dòng )

b Xây dựng chương trình sắc ký khối phổ phân tích 2,4-D

- Chương trình sắc ký: pha động, tốc độ dòng đã được khảo sát ở trên

- Khảo sát điều kiện khối phổ:

+ Kỹ thuật MSI lần, phân tích toàn thang xác định mảnh mẹ (ion phân tử) + Kỹ thuật MS 2 lần, phân tích toàn thang tìm những ion đặc trưng (mảnh mẹ và mảnh con) để định tính

+ Kỹ thuật chọn lọc ion (SIM), sử dụng ion phân tử (mảnh mẹ) để định lượng

c Đánh giá phương pháp

- Khảo sát độ tuyến tính

Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích píc và nồng

độ chất phân tích Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui (y= ax +b) và hệ số tương quan r

- Khảo sát độ lặp lại: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

diện tích píc của cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần

- Khảo sát độ đúng: Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng

để xác định khả năng tìm lại

- Khảo sát giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định bằng 3 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó

Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện

Ngoài ra, giới hạn định lượng còn xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỷ số S/N =10

Tương quan hồi quỉ tuyến tính:

- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:

+ Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoít Excel.

+ Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoít Excel.

- Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoít Excel.

Y = ax + b

(Vào phần mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nó trên Desktop, chọn Insert \ Function).

+ Dãy các dung dịch chuẩn 2,4-D có nồng độ: 0,01ppm, 0,025ppm, 0,25ppm, 0,5ppm, lppm trong pha động để khảo sát độ lặp lại và độ tuyến tính đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc ký lỏng khối phổ

+ Mẫu nhân sâm nhiễm 2,4 D: tạo các mẫu nhân sâm nhiễm 2,4-D vói các tỷ lệ khác nhau: 0,01ppm, 0,lppm, lppm bằng cách:

Thêm lượng chính xác dung dịch chuẩn 2,4-D vào 2,5 g bột Nhân Sâm, lắc mạnh và lắc trên máy lắc cơ học tối thiểu 3h, để qua đêm, sau đó tiếp tục lắc kỹ

Mẫu này dùng để xây dựng phương pháp chiết, khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và khảo sát tỷ lệ thu hồi

2.2.2 Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký

Trước khi tiến hành xây dựng chương trình sắc ký khối phổ, chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình sắc ký sử dụng detector PDA đối với mẫu chuẩn

2.2.2.1 Khảo sát điều kiệtt sắc ký

Sử dụng các dung dịch chuẩn, qua các quá trình thực nghiệm, chúng tôi xác định được điều kiện sắc ký như sau:

+ Cột sắc ký sử dụng: Cột BetaBasic C18 (5 cm X 2,1 mm ; 5 um)