2.2.5.I. Phân tích các mẫu nhân sâm nhiễm đánh giá độ đúng của phương pháp, so sánh hai phương pháp chiết và làm sạch
Tiến hành chiết các mẫu nhân sâm nhiễm có các nồng độ 0,01ppm,
0,lppm, lppm đã được chuẩn bị ở trên và làm sạch bằng SPE như đã mô tả.
Kết quả phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ được ghi trong bảng 2.3
Bảng 2. 3. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi ở các nồng độ khác nhau
Mẫu nhiễm Tỷ lệ thu hồi Chiết lạnh, làm sạch bằng SPE Chiết Soxhlet, làm sach theo TCVN 6134:1996 So sánh Test F TestT 0,01ppm (ìoppb) 66,2 % RSD=10,3% (n=3) 0,1 ppm (lOOppb) 88,7 % RSD=7,2 % (n=3) 93,3 % RSD=10,6 % (n=3) P(test F) = 0,59 > 0,05 P(test T) = 0,27 > 0,05 1 ppm (lOOOppb) 96,3 % RSD=6,5 % (n=3) 93,8 % RSD= 9,9 % (n=3) P(test F) = 0,62 > 0,05 P(test T) = 0,36 > 0,05
Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ thu hồi là chấp nhận đối với phân tích dư lượng ( theo EP, USP quy định là từ 70 - 110%).
Kết quả so sánh phương pháp chiết và làm sạch theo quy trình chúng tôi xây dựng và áp dụng theo TCVN 6134:1996 cho thấy:
Hai phương pháp có độ lặp lại và tỷ lệ thu hồi khác nhau không có ý nghĩa thống kê ở mức p = 0,95.
Như vậy có thể sử dụng cả 2 phương pháp chiết và làm sạch nêu trên để chiết 2,4-D từ mẫu dược liệu.
2.2.5.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb sau khi chiết và phân tích vẫn cho đáp ứng có tỷ số S/N>10, chứng tỏ giói hạn định lượng (LOQ) < 10 ppb (hình 2.10).
Giói hạn phát hiện LOD = 0,3 LOQ. Do đó giới hạn phát hiện LOD < 3ppb
Ginseng spied 2,4-D 10 ppb
RT: 1.58 NL:
MA. 207173 2.03E4
Hình 2.10. Mẫu nhân sâm nhiễm 10 ppb 2,4-D, tốc độ dòng 0,3 mL/phút
2.2.6. Kết quả áp dụng phương pháp phân tích dư lượng 2,4-D trong một số mẫu dược liệu
Chúng tôi đã áp dụng quy trình phân tích trên (chiết lạnh bằng aceton, làm sạch mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng pha tĩnh Silica gel và phân tích định tính, định lượng 2,4-D bằng sắc ký lỏng khối phổ) để phân tích dư lượng 2,4-D trên 3 mẫu chè dây được sản xuất theo quy trình thực hành nông
nghiệp tốt (GAP) của Công ty Traphaco, mẫu trồng ở thị trấn Sa Pa tỉnh Lào Cai. Kết quả khảo sát cho các mẫu này đều không nhiễm chất diệt cỏ 2,4-D, đủ tiêu chuẩn sạch không có dư lượng 2,4-D để xuất khẩu sang CHLB Đức. 2.3. BÀN LUẬN
2.3.1. Về đối tượng phân tích
Hiện nay, các chất diệt cỏ sử dụng trong nông nghiệp và trong trồng cây thuốc có rất nhiều loại, mặc dù 2,4-D là chất diệt cỏ kinh điển nhưng do có thời gian sử dụng tràn lan nên ảnh hưởng đến môi trường đất và nước, do đó có thể gây nhiễm cho nông sản và cây thuốc. Chính vì thế, dư lượng 2,4-D trong đối tượng môi trường, nông sản, thực phẩm vẫn được quan tâm trên thế
giới cũng như ở Việt Nam.
Như đã biết, do quá trình quang hóa phân hủy và do sự phân giải của đất, 2,4-D phân hủy tương đối nhanh trong đất (vài ngày đến vài tuần) trừ một
số vùng đất có đặc tính cơ, lý hóa yếu thì 2,4-D có thể tồn tại lâu hơn (vài
tháng đến vài năm). Do 2,4-D không phải là hợp chất bền vững nên khả năng lây nhiễm cho dược liệu từ môi trường là không nhiều. Khả năng có thể dẫn đến lây nhiễm
2,4-D ở mức độ nguy cơ cao là việc sử dụng hóa chất này tràn lan thiếu kiểm soát đối với một số dược liệu trồng và thu hoạch nhanh hoặc việc sử dụng 2,4- D để ngâm tẩm với mục đích kích thích sinh trưởng.
Bên cạnh đó, trong xuất khẩu, nông sản từ Việt Nam nói chung và dược liệu nói riêng, vấn đề dư lượng 2,4-D là tương đối nhạy cảm và thường được quan tâm. Gần đây, nhiều thuốc diệt cỏ 2,4-D có nguồn gốc Trung Quốc vẫn được nhập về Việt Nam và được sử dụng trong trồng trọt. Chính vì thế, phân tích xác định dư lượng 2,4-D trong dược liệu là cần thiết.
Việc lựa chọn 2,4-D còn nhằm mục đích như khai thác và chứng minh thế mạnh của sắc ký lỏng khối phổ LC - MS khi phân tích dư lượng chất độc hại trong dược liệu ở mức độ vết
2.3.2. Về phương pháp phân tích
Dư lượng HCBVTV trong dược liệu cũng như trong các sản phẩm khác đều ở dạng vết hoặc siêu vết, do vậy phải lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp cho phân tích vết. Giai đoạn xử lý mẫu, tách chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi mẫu ở mức độ vết, làm sạch và làm giàu chúng là khâu rất quan trọng.
2.3.2.1. Xử lý mẫu
Đối với phương pháp chiết mẫu, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật chiết Soxhlet theo TCVN 6134:1996 (phương pháp xác định 2,4 D trong đất) và cũng đã khảo sát kỹ thuật chiết lạnh bằng aceton. Qua khảo sát tỷ lệ thu hồi chúng tôi thấy cả hai phương pháp đều có tỷ lệ thu hồi nằm trong giới hạn cho phép. Như vậy vó thể áp dụng cả hai phương pháp này để chiết chất phân tích trong dược liệu.
Kết quả so sánh giữa hai phương pháp chiết và làm sạch theo quy trình mà chúng tôi xây dựng và theo TCVN 6134:1996 (mục 2.2.5.1.) cho thấy hai phương pháp chiết và làm sạch khác nhau không có ý nghĩa thống kê về độ lặp lại và độ đúng. Tuy nhiên do điều kiện thời gian, chúng tôi chưa làm được nhiều thực nghiệm để có sự so sánh và đánh giá mang tính hệ thống và đầy đủ.
So với phương pháp làm sạch theo TCVN 6134:2006, sử dụng cột SPE đã được chuẩn hoá để làm sạch và làm giàu chất phân tích đem lại nhiều ưu điểm hơn như: có thể giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ được sử dụng, chiết chọn lọc, thòi gian chiết nhanh, độ lặp lại tốt và có thể tự động hoá toàn bộ quá trình chiết.
23.2.2. Lựa chọn phương pháp phân tích
Theo TCVN 6134:1996, tiêu chuẩn nhà nước phân tích dư lượng 2,4- D trong đất, kỹ thuật phân tích đinh tính và định lượng sử dụng detector ƯV tại bước sóng 230 nm, phương pháp này mặc dù theo tiêu chuẩn có LOD = 10 ppb, tuy nhiên thiếu tính đặc hiệu và chọn lọc đặc biệt khi áp dụng phân tích 2,4-D trong dược liệu. Thành phần của dược liệu có rất nhiều hợp chất
hữu cơ có khả năng hấp thụ u v ở bước sóng 230 nm, sẽ ảnh hưởng đến
phân tích 2,4-D.
So sánh một số điểm giữa phương pháp phân tích định tính và định lượng 2,4-D theo TCVN 6134 và bằng LC-MS được trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. So sánh 2 phương pháp phân tích
pp phân tích theo TCVN 6134:1996 Phương pháp LC - MS/MS
HPLC - detector ƯV 230 nm HPLC - MS/MS, SIM
219,221,161.163 Không đặc hiệu, không phân tích được
các mẫu có nền phức tạp.
Đặc hiệu, mang tính khẳng định, thực hiện được với các mẫu có nền
phức tạp
Cột C18, 25 cm Cột C18, 5 cm
Thòi gian chạy 1 mẫu 10 phút Thời gian chạy 1 mẫu 3 phút
Giới hạn phát hiện LOD 10 ppb LOD nhỏ hơn 3 ppb
Không được chấp nhận ở Châu Âu, Nhật, Mỹ
Được chấp nhận [28]
Hiện nay, phân tích 2,4-D ngoài phương pháp như vừa nêu và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này, còn có kỹ thuật như sắc ký khí vói
detector ECD hoặc khối phổ. Để phân tích 2,4-D bằng sắc ký khí, cần thiết phải tạo dẫn xuất ester dễ bay hơi ví dụ như dẫn xuất methylester. Phương pháp này cho độ nhạy cao, quá trình tạo dẫn xuất bay hơi và lấy mẫu không gian hơi có thể loại bỏ tương đối có hiệu quả ảnh hưởng của nền mẫu. Tuy nhiên để thực hiện kỹ thuật cũng không đơn giản.
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS có thể phân tích trực tiếp 2,4-D một cách có hiệu quả và khá nhanh chóng mặc dù sử dụng bất cứ phương pháp nào, đối với phân tích dư lượng thì xử lý mẫu vẫn là một vấn đề cần quan tâm nhất và thường mất thời gian và công sức. Hiện nay, Cơ quan bảo vệ môi trường EPA hay cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm dược phẩm FDA (Mỹ) và các cơ sở phân tích hiện đại trên thế giới đều sử dụng LC- MS/MS phân tích dư lượng 2,4-D trong môi trường và nông sản [22].
2.3.3. Vê kết quả phân tích trên mẫu
Do thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ áp dụng qui trình phân tích phân tích 3 mẫu Chè Dây xuất khẩu sang CHLB Đức. Các dược liệu này được trồng và sản xuất theo qui trình GAP. Kết quả phân tích cho thấy các dược liệu này đều không bị nhiễm 2,4-D từ đất và không có dư lượng 2,4-D.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. KẾT LUẬN
- Sau một thời gian nghiên cứu, đã có cơ hội tiếp cận và hiểu thêm về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng như các bước cơ bản trong phân tích dư lượng các chất độc hại sử dụng sắc ký lỏng khối phổ. Đây là phương pháp mói hiện nay, được sử dụng để định tính và định lượng một cách khá chính xác.
- Xây dựng được phương pháp phân tích 2,4-D trong dược liệu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ. Phương pháp phân tích có độ nhạy cao (phân tích được
dư lượng 2,4-D ở mức ppb), có tính đặc hiệu, phân tích đúng và chính xác đối
tượng phân tích. Phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu tiên tiến, theo xu hướng trên thế giới và phù hợp với điều kiện ở Việt Nam.
- Với mục tiêu chính là xây dựng phương pháp phân tích và do hạn chế về thời gian, chúng tôi mới chỉ áp dụng phương pháp phân tích để phân tích 3 mẫu Chè Dây xuất khẩu sang CHLB Đức. Kết quả cho thấy các mẫu này đều không không có dư lượng 2,4-D.
3.2. ĐỂ XUẤT
- Do thời gian có hạn, chúng tôi mói thực hiện những khảo sát và tiến hành những thực nghiệm nghiên cứu cơ bản. Các số liệu thống kê thu được chưa nhiều, trong thời gian tới, khi áp dụng vào thực tế, đối với mỗi dược liệu cụ thể , cần thiết phải khảo sát thu thập thêm các số liệu nhằm thẩm định phương pháp và đánh giá khả năng áp dụng vào thực tế.
- Khảo sát thêm về dư lượng 2,4 D trong một số mẫu dược liệu trên thị trường, qua đó có những nhận định và đánh giá khách quan về dư lượng chất này trong dược liệu.
- Tiếp tục triển khai và áp dụng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích dư lượng các chất độc hại trong dược liệu và thực phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ môn Hóa phân tích (2004) - Hóa phân tích 2 - Trường đại học Dược
Hà Nội. Tr 107-123, Tr. 173-187, Tr. 326-333.
2. Bộ môn Hoá phân tích (2002) - Môi trường và độc chất môi trường —
Trường đại học Dược Hà Nội. Tr. 156-168.
3. Bộ môn Hóa phân tích (2004) - Kiểm nghiệm thuốc - Trường đại học
Dược Hà Nội. Tr. 81-88.
4. Bộ khoa học, công nghệ và Môi trường (1996), Chất lượng đất- xác định
dư lượng 2,4-D trong đất, phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao - TCVN 6134:1996.
5. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn(2004) - Danh mục thuốc bảo vệ
thực vật được phép, hạn chế và cấm sử dụng ở Việt Nam - Nhà xuất bản Nông nghiệp.
6. Bộ Y tế (2002) - Dựơc điển Việt Nam xuất bản lần thứ ba - Nhà xuất bản
Y học. PL 5.16, PL 4.3.
7. Bùi Thị Bằng(2002)- Bước đầu khảo sát một số chỉ tiêu an toàn dược
liệu - Hội thảo dược liệu an toàn- nghiên cứu trồng và chế biến.
8. Bùi Sỹ Doanh (2001) - Nghiên cứu phân tích, đánh giá dư lượng thuốc
trừ sâu Cypermethrin đối với rau quảy đất và nước - Luận án tiến sỹ dược học - Trường đại học Khoa học tự nhiên.
9. Chu Phạm Ngọc Sơn (2005) - HPLC/MS Advantage Max - Trung tâm
Đào tạo và Phát triển sắc ký TPHCM. Tr. 15-26.
10. Nguyễn Duy Chí (2006) - ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích
một số thuốc tân dược nhóm chống viêm phi steroid có thể trộn trái phép trong thuốc đông dược - Luận văn thạc sỹ dược học- Học viện Quân Y.
11. Phạm Luận (1999) - Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao
- Bộ môn Hóa phân tích - Trường đại học Khoa học tự nhiên.
12. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh (2002) - cẩm
nang thuốc bảo vệ thực vật - Nhà xuất bản nông nghiệp. Tr. 343-345.
13. Phòng Quản lý thuốc BVTV (1999) - Báo cáo về thực trạng quản lý và
sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam - Cục Bảo vệ thực vật.
14. Trần Quang Hùng (1999) - Thuốc bảo vệ thực vật - Nhà xuất bản nông
nghiệp.
15. Trần Việt Hùng (2005)- Khảo sát và nghiên cứu phân tích dư lượng
một sốhoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu - Luận án tiến sỹ dược học.
16. Trần Việt Hùng, Phạm Thanh Kỳ, Trinh Văn Quỳ (2003) - Một sô' kết
quả nghiên cứu phân tích dư lượng đa thành phần hoá chất bảo vệ thực vật dư lượng cơ clo và pyrethoid trên dược liệu được trồng trọt và sử dụng ở Việt Nam - Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, số 4, tr.275-281.
17. Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Quỳ, Phạm Hoàng Việt, Phạm Thanh Kỳ
(2004) - Khảo sát đánh giá tình hình sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật
trong việc trồng cây thuốc ở làng nghề truyền thống Nghĩa Trai, tình Hưng Yên - Tạp chí Dược liệu, số 5, tr. 133-137.
18. Trịnh Văn Quỳ, Phùng Hoà Bình (2005) - Một số vấn đề tiêu chuẩn hoá nâng
cao chất lượng thuốc thảo dược vê độ an toàn, tạp chí Dược học, số 2/2005.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
19. George R. Waller & Otis C.Dermer (1981) - Bỉochemỉcal applications
o/Mass Spectrometry. pp. 9-15.
20. FAO/WHO (1993). Codex Aliurentarius Commỉssỉon.
22. Stafforđ and Alex Khynitsky (2004) - Procedure for the dỉrect analysis o f 2,4-D in water, new methods for food saýety Analysis, U.S.EPA.
23. The European Pharmacopoeia (1997).
24. The United States Pharmacopoeia 26 (2003).
25. WHO(1993). 2,4- Diclorophenoxyacetic acỉd (2,4-D). pp.11-25
26. Winefordner J.D. Chemical analysỉSyVolume 17 “Solid-phase Extractìon,
prìncỉple and practice”, A.Willey-intemscience publication, John Willey &
Son, Inc. pp. 180-186
27. Wikipedia, Hỉstorical use of 2,4-D
Website found at: http://en.mkipedia.org/wiki/Herbicide. 28. Pesticide In/ormation Proỷiles
Website found at: http://www.extoxnet.orst.edu/ghindex.htm. 29.2,4-D, toxỉcỉty, ecologicial toxictíy and reguỉatory ỉnformation
Website found at: http://www.pesticideinfor.org/Detail-chemical.jsp. 30. PAN Pesticides Database
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Một số hình ảnh minh họa quá trình lựa chọn các điều kiện khối phổ trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan
Avantage Max cxs---;v
¥ìew Contrd SoanMode Dí?play Setup D4agr»5tlc5 t-kslp
ụ L © B 1 i ẳQEB ® I © A| u m '*°Q ỉ Ũ]BI
Fcir Help, press F1
:JBstartỊ J\ £ \t
AI ịurer 1
ĩa S ỉ 11 Value ị_3
ESi Souce
Epray Vdtags (kVi 45Ê Sprạịi CuiTêíTt (à&t 11.6? Shsih Sas Fk>w Raíe 1368
Aux/Sw eep c « t Row Rate: -02? Câpìíiaiy RTD OK. Ves CapilỉatyVcìíage M •3074
Capi9a^Tenfip[*Cl 24SA0
ĩiib e is re í^ s p t -3B00
Vacuum
Vacuun DK Ves lon Giiv»je Pressure CK: Yes — lon Gauặs: On lon Gaupe (:<10e ^ Torr). 133
Con<í«íior! pievii.ee: OK. Convsctron Gsugs ỊĨCÍIÌ: 119
T utbo Pump Státus: Rmntig Life |fwupỉi 11991 SpeedỊipmỊ 53933 PcwBf (WattsỊ: 47 ị lon Opbcs Mtiỉipoíe ] Offíset JV> 402 LerKV<*ạjeíVt 19.62
Multipote 2 Offwst IV]- 730
Muttìpote FỈF Airip (Vp-p, íf t 400.00
Ccaree T rđp DC Offssí fi/] 1061
Fir» ĩ rap DC Otfse) 10.19 -1
NUM <(/12/2006 9:58 AM
X Roadroap- Hon® Pagpe j 'jịị 2,40 - Instrument Setup^ j j (pn\LC-MS\HUNG\mí*h... sị
Hình PL1. Cửa sổ LCQ Tune, tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn 2,4-D 10 ppm