2.1.2.1. Xử lý mẫu
- Chuẩn bị mẫu: bao gồm mẫu chuẩn và mẫu nhiễm.
- Xác định hàm ẩm: Tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 5.16. Xác định mất khối lượng do làm khô.
- Chiết đối tượng nghiên cứu từ mẫu dược liệu:
Khảo sát 2 kỹ thuật chiết: rê
+ Chiết lạnh. + Chiết Soxhlet. - Làm sạch:
+ Tiến hành theo TCVN 6134:1996 (Xác định dư lượng 2,4-D trong đất)
- Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch:
Dựa vào hiệu suất (tỷ lệ) thu hồi (ký hiệu là %R) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm được tạo ra từ mẫu dược liệu sạch bằng phương pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phương pháp đã nêu trên, phân tích sắc ký và xác định hiệu suất thu hồi.
Tiêu chuẩn đánh giá phương pháp chiết: Áp dụng tiêu chuẩn ghi trong dược điển Mỹ hoặc dược điển Châu Âu, phương pháp chiết được chấp nhận nếu 70% < %R < 110%.
2.1.2.2. Định tính và định lượng 2,4-D chiết ra từ mẫu dược liệu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ
a. Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký
Sử dụng dung dịch chuẩn 2,4-D ìoppm trong pha động tiêm vào hệ thống HPLC với detector PDA, để khảo sát xây dựng chương trình sắc ký (pha động, tốc độ dòng...)
b. Xây dựng chương trình sắc ký khối phổ phân tích 2,4-D
- Chương trình sắc ký: pha động, tốc độ dòng... đã được khảo sát ở trên
- Khảo sát điều kiện khối phổ:
+ Kỹ thuật MSI lần, phân tích toàn thang xác định mảnh mẹ (ion phân tử). + Kỹ thuật MS 2 lần, phân tích toàn thang tìm những ion đặc trưng (mảnh mẹ và mảnh con) để định tính.
+ Kỹ thuật chọn lọc ion (SIM), sử dụng ion phân tử (mảnh mẹ) để định lượng.
c. Đánh giá phương pháp - Khảo sát độ tuyến tính
Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi qui giữa diện tích píc và nồng độ chất phân tích. Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu xác định phương trình hồi qui (y= ax +b) và hệ số tương quan r.
- Khảo sát độ lặp lại: Xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích píc của cùng mẫu chuẩn tiêm 6 lần.
- Khảo sát độ đúng: Bằng phương pháp thêm chất chuẩn và định lượng để xác định khả năng tìm lại.
- Khảo sát giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định bằng 3 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó.
Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện. Ngoài ra, giới hạn định lượng còn xác định bằng nồng độ chất cho đáp ứng có tỷ số S/N =10.
2.1.2.3. Phương phấp xử lý số liệu
Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào các hàm số trong Microsoít Excel.
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = = X 100
X
Tương quan hồi quỉ tuyến tính:
- Phương trình hồi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện
tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:
+ Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoít Excel. + Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoít Excel. - Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoít Excel.
Độ lệch chuẩn: SD , hàm Stdev trong Microsoít Excel.
(Vào phần mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nó trên Desktop, chọn Insert \ Function).