2.2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích.
* Dung môi pha mẫu: Chọn dung môi pha mẫu là MeOH, do các alkaloid trong mẫu Heroin tan tốt trong MeOH, và MeOH tan trong dung dịch đệm, phù họfp với khả năng phân tích.
* Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách.
Dùng mao quản Silica, đường kính nhỏ hơn lOOỊim sẽ làm mất ảnh hưởng của hiệu ứng nhiệt Joule sinh ra trong ống mao quản, và cho phép áp vào 2 đầu mao quản thế cao (20-300KV). Đường kính của cột mao quản quá nhỏ thì độ nhạy kém, thông thưòỉng đường kính cột mao quản từ 2 0-1 0 0^01. Qua khảo sát chọn cột mao quản có đường kính 50|j,m là thích hợp.
Chiều dài cột mao quản đủ lớn để có thể áp thế cao vào hai đầu mao quản, theo lý thuyết V = 200-600V/cm là thích hợp. Qua khảo sát thấy sử dụng cột mao quản có chiều dài 1 = 60 cm với chiều dài hiệu dụng = 52 cm là thích hợp.
* Xử lý cột mao quản:
- Luyện cột: Với cột mao quản mới cần phải luyện cột bằng NaOH 0,5 M trong 30 phút ở 50°c, sau đó rửa bằng đệm khoảng 20 phút.
- Trước mỗi ngày rửa cột bằng NaOH 0,5M, HjO, đệm theo thứ tự thời
gian là: 4 phút, 3 phút, 2 phút ở 30°c.
- Giữa các lần chạy mẫu; Rửa cột bằng đệm 2 phút (preconditioning). - Sau mỗi lần chạy mẫu: Rửa cột bằng H2O 1 phút (postconditioning). - Cuối mỗi ngày rửa cột bằng H2O 30 phút.
* Nhiệt độ cột: Nhiệt độ cột là yếu tố khó có thể thay đổi nhiều, nếu nhiệt độ cột cao quá sẽ sinh hiệu ứng nhiệt Joule làm giảm hiệu quả tách. Qua khảo sát chọn nhiệt độ cột ở 30°c là thích hợp.
* Phương pháp bơm mẫu:
Phương pháp bơm mẫu bằng thủy động học dùng áp suất được lựa chọn, do bản chất của phương pháp là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu, và tạo chân không ở đầu kia của mao quản trong một thời gian nhất định.
Do áp lực đẩy và hút mà một lượng mẫu nhất định sẽ được đưa vào mao quản. Mẫu có nồng độ đồng đều vào giống với nồng độ chất tan trong mẫu.
Chọn tiêm mẫu bằng phương pháp thủy động học, thời gian tiêm mẫu t = 5s, áp suất bơm p = 50mbar.
* Bản chất, nồng độ đệm:
pKa của các chất phân tích ở trong khoảng 7,5-9,9, nên chúng tôi chọn phương pháp MEKC, khảo sát các hệ đệm có pH kiềm (pH^ện, = pKa±l), thêm SDS để tạo micelle.
- Chọn pH cho đệm
Pha các đệm có cùng nồng độ là 25mM, nồng độ SDS là 50mM, ở các pH khác nhau, tiến hành chạy điện di với các mẫu chuẩn alkaloid.
Điều kiện chạy điện di: Điện thế V = 25 KV.
Tiêm mẫu bằng áp suất 50mbar X 5 giây. Bước sóng phát hiện X = 206nm.
Nhiệt độ cột mao quản t° = 30°c.
Qua quá trình khảo sát, chúng tôi thấy ở pH 9,4 thì các chất tách ra khỏi nhau là tốt nhất, do đó chọn pH của đệm là 9,4 (xem phụ lục 1).
- Nồng độ đệm:
Pha đệm Borat pH = 9,4 với các nồng độ 20mM, 40mM, 60mM, 80mM, với nồng độ SDS là 50mM. Tiến hành chạy điện di dung dịch chất chuẩn với các điều kiện trên và các dung dịch đệm.
Qua quá trình khảo sát chúng tôi chọn được nồng độ của đệm là 40 mM. Tại nồng độ này, các chất tách khỏi nhau là tốt nhất, thời gian phân tích phù hợp nhất. Với nồng độ đệm là 20mM, thời gian phân tích tăng lên đến 30 phút, các pic tách tốt nhưng pic không gọn. Với nồng độ đệm là 60mM, 80 mM, thời gian phân tích ngắn (18 phút, và 20 phút), nhưng hai chất AC và 6-MAM không tách ra khỏi nhau, (xem Phụ lục 2)
- Nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS:
Pha đệm Borat pH 9,4, nồng độ 40 mM, với các nồng độ SDS là: 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM. Tiến hành chạy mẫu chuẩn với các dung dịch đệm trên, giữ nguyên điều kiện về điện thế, nhiệt độ cột, áp suất bơm và thời gian bơm mẫu.
Sau khi khảo sát, chúng tôi chọn được nồng độ SDS là 50 mM, ở nồng độ này cho kết quả tách tốt và thời gian phân tích hợp lí (25 phút). Với nồng độ SDS là 25mM, 2 chất AC và 6-MAM không tách ra khỏi nhau. Với nồng độ SDS là 75mM, lOOmM các chất tách tốt ra khỏi nhau, nhưng thời gian phân tích dài (35 phút với nồng độ SDS 75mM, 50 phút với nồng độ SDS lOOmM).
Qua các quá trình khảo sát trên chọn được hệ đệm: 40 mM Borat, 50 lĩiM SDS, pH = 9,4.
* Khảo sát điện thế:
Tiến hành chạy các mẫu chuẩn vói hệ đệm tối ưu ở các hiệu điện thế 20KV, 25KV, 30 KV. Với điện thế V = 20 KV, 2 chất AC và 6-MAM ít tách ra khỏi nhau. Điện thế V = 30KV, thời gian phân tích dài, cường độ dòng lớn, sinh ra hiệu ứng Joule, kết quả không ổn định. Cuối cùng, chúng tôi chọn điện thế đặt vào hai đầu mao quản y = 25 KV, tại điện thế này, các chất tách tốt ra khỏi nhau (Rac-mam ~ 1»45).
* Detector: Heroin và các tạp alkaloid trong mẫu Heroin có khả năng hấp thụ ánh sáng u v nên dùng Detector u v (Diode Arrav Detector: DAD), để xác
định chính xác vị trí của pic chất phân tích và chọn bước sóng hấp thụ cực đại của mẫu trong môi trường phân tích mẫu.
Tiến hành quét phổ hấp thụ của từng alkaloid có trong mẫu Heroin, mẫu trắng là đệm Borat 40 mM, pH 9,4. Kết quả được trình bày ở Bảng 10. (xem Phụ lục 3, Phụ lục 4, Phụ lục 5, Phụ lục 6)
Bảng 10: Cực đại hấp thụ (X^ax) 4 alkaloid trong mẫu Heroin. Tên chất Heroin Morphin Acetylcodein 6-MAM
?^max (nm) 203 2 1 2 2 1 0 206
Nhận xét: Với hệ đệm 40 mM Borat, 50 mM SDS, pH = 9,4, điện thế 25
KV, nhiệt độ cột 30°c, cho kết quả điện di tốt, khả năng tách giữa các chất tốt * Với các kết quả khảo sát trên, chúng tôi đưa ra điều kiện điện di như sau: - Cột mao quản: chiều dài 1 = 60 cm, lgff = 52 cm, đường kính trong 50 ịim. Cột được rửa bằng đệm 2 phút trước mỗi lần tiêm mẫu và rửa bằng nước 1 phút sau mỗi lần chạy mẫu.
- Nhiệt độ trong cột mao quản: 30°c.
- Tiêm mẫu; Sử dụng phương pháp tiêm mẫu bằng áp suất 50mbar X 5s. - Bước sóng phát hiện X = 203, 206, 210, 2 1 2 nm.
- Hệ dung dịch đệm: 40 mM Borat, 50 mM SDS, pH = 9,4. - Điện thế giữa hai đầu mao quản V = 25 KV.
— ... _____ ___ __
ị * V
---5---...m .... ---2 0--- --- ^ L — Í E L Hình 9: Điện di đồ tách hỗn hợp 4 alkaloid.
(1): morphin, (2): DAM, (3): AC, (4): 6-MAM.
(Tất cả các dung dịch trước khi được bơm vào cột mao quản đều phải được lọc qua màng lọc 0 ,2 ịxm).
Thời gian lưu của từng chất trình bày ở Bảng 11.
Bảng 11: Thời gian điện di của 4 alkaloid bằng phương pháp điện di mao quản
Hoạt chất Morphin Heroin Acetylcodein 6-MAM
Ir (phút) 12,16 17,49 24,04 24,44
Nhận xét:
Do thời gian làm đề tài không cho phép chúng tôi tiến hành tiếp công việc thẩm định phương pháp. Nhưng qua khảo sát chúng tôi đã tìm ra điều kiện tối ưu để tách đồng thời 4 alkaloid trong mẫu Heroin.