Nghiên cứu xây dựng quy trình bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ nguồn curcuminoid chiết xuất trong nước

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C ... Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Trải qua hai năm học cao học được sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo, cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa học và Luận văn Thạc sỹ Dược học của mình

Với tất cả sự kính trọng, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS TS Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang, DS Nguyễn Thị Vân và CN Phan Tiến Thành đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học và thực hiện Luận văn Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô của Phòng Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt hai năm học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi

và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn Thạc sĩ Dược học

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Phượng

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID 2

1.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 2

1.1.2 Tác dụng dược lý 6

1.1.3 Phương pháp tách hỗn hợp curcuminoid 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ TETRAHYDROCURCUMINOID 11

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 11

1.2.2 Nguồn gốc tetrahydrocurcumin 12

1.2.3 Tác dụng dược lý 12

1.2.4 Tổng quan về các phương pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 18

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu 18

2.1.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Phương pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid 20

2.3.2 Bán tổng hợp hóa học: 20

2.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết 21

2.3.4 Xác định cấu trúc sản phẩm 21

2.3.5 Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp được 21

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID 22

3.2 KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN 26

3.2.1 Khử hóa curcumin I (curcumin) 26

3.2.2 Khử hóa curcumin II (DMC) 34

3.3 KHỬ HÓA HỖN HỢP CURCUMINOID 41

3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 46

3.4.1 Xác định cấu trúc curcumin I (curcumin) 46

3.4.2 Xác định cấu trúc curcumin II (DMC) 48

3.4.3 Xác định cấu trúc THC I (THC) 50

3.4.4 Xác định cấu trúc THC II 53

3.5 THỬ TÁC DỤNG CH NG OXY HÓA CỦA CÁC CHẤT BÁN TỔNG HỢP ĐƯỢC 54

Chương 4: BÀN LUẬN 56

4.1 Về phương pháp tách từng thành phần từ hỗn hợp curcuminoid 56

4.2.Về phản ứng khử hóa từng curcuminoid thành phần 56

4.3 Về phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp 58

4.4 Về xác định cấu trúc 59

4.5 Về tác dụng sinh học 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận ……… 64

2 Kiến nghị ……… 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

(Human immunodeficiency virus)

1H-NMR 1H - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low – density lipoprotein)

MS Phổ khối lƣợng (Mass spectrometry)

OD Mật độ quang (Optical density)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của các curcuminoid 2

Bảng 1.2 Một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid 12

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu 19

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid 23

Bảng 3.2 Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96% 24

Bảng 3.3 Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 25

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C 27

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C 28

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/acid 30

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl 31

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là Zn/HCl 31

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C 35

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là H2/Pd/C 36

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/acid 38

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid đến hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC II từ DMC với tác nhân khử là Zn/HCl 39

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol kẽm/curcumin II đến hiệu suất

phản ứng bán tổng hợp THC II từ Curcumin II với tác nhân khử là Zn/HCl 40 Bảng 3.14 Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 43 Bảng 3.15 Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat 45 Bảng 3.16 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của curcumin 47 Bảng 3.17 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của curcumin 47 Bảng 3.18 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của curcumin 48 Bảng 3.19 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của DMC 48 Bảng 3.20 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC 49 Bảng 3.21 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC 49 Bảng 3.22 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của THC (khử thành phần) 50 Bảng 3.23 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (khử thành phần) 51 Bảng 3.24 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (khử

thành phần) 51 Bảng 3.25 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (tách từ khử hỗn hợp) 52 Bảng 3.26 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (tách

từ khử hỗn hợp) 52 Bảng 3.27 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC II 53 Bảng 3.28 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của THC II 53 Bảng 3.29 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tư do của các mẫu thử theo phương

pháp DPPH 55

DANH MỤC CÁC H NH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của curcuminoid 2

Hình 1.2 Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin 3

Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceto – enol của curcumin trong dung dịch 3

Hình 1.4 Dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 4

Hình1.5 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 5

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcuminoid 11

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pd/C 15

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pt/C 15

Hình 1.9 Sơ đồ phản ứng khử hóa các curcuminoid tạo thành các tetrahydrocurcuminoid tương ứng dùng xúc tác Zn-NiCl2 sử dụng kĩ thuật siêu âm trong dung môi EtOH-H2O 16

Hình 3.1 Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid 22

Hình 3.2 SKLM của các curcuminoid thành phần 26

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd/C 26

Hình 3.4 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân Zn/H+ 29

Hình 3.5 SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 33

Hình 3.6 SKLM của THC trên hệ dung môi AcOEt: n-hexan = 7:3 33

Hình 3.7 Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân H2/Pd/C 34

Hình 3.8 Sơ đồ phản ứng khử hóa DMC với tác nhân Zn/H+ 37

Hình 3.9 SKLM của THC II trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 41

Hình 3.10 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân H2/Pd/C 42

Hình 3.11 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân Zn/H+ 43

Hình 3.12 SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1 46

Hình 3.13 SKLM của THC II trên hệ dung môiCH2Cl2: MeOH = 20:1 46

Hình 3.14 Cấu trúc enol và liên kết hydro của phân tử curcumin I 60

Hình 3.15 Dạng hỗ biến ceto-enol của tetrahydrocurcumin 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa, củ nghệ đã được sử dụng phổ biến ở một số nước châu Á như một thứ gia vị chính giúp điều hương, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm Không những thế, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thương,… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, người ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid – tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ nhưng là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ Bên cạnh đó, khi xu hướng của thế giới ngày càng ưa chuộng những sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển những hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Dược Việt Nam, trong đó có nhóm chất màu curcuminoid

Curcuminoid là tên gọi chung của các chất mang khung diarylheptadien được

phân lập từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), bao

gồm curcumin I (curcumin), curcumin II (demethoxycurcumin), curcumin III (bisdemethoxycurcumin) và một số chất khác Các curcuminoid được nghiên cứu và chứng minh với các tác dụng dược lý như: chống lại quá trình đông máu, chống viêm, chống oxy hóa và chống ung thư [2][8][9][27] Tuy nhiên, các curcuminoid có màu vàng và rất khó rửa sạch, nên nhu cầu sử dụng của các curcuminoid bị hạn chế, đặc biệt trong mỹ phẩm Sản phẩm khử hóa của curcuminoid là tetrahydrocurcuminoid có những ưu điểm là không màu nên được sử dụng rộng rãi hơn trong mỹ phẩm Mặt khác tetrahydrocurcumin còn được chứng minh có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa tốt hơn curcumin [18][19][22][24][25]

Chính vì thế, việc nghiên cứu khử hóa curcuminoid thành tetrahydrocurcuminoid là một hướng có triển vọng trong mỹ phẩm và dược phẩm Do

vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ nguồn curcuminoid chiết xuất trong nước”

Với những mục tiêu sau:

 án tổng hợp tetrahydrocurcuminoid ở quy mô phòng thí nghiệm;

 Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp được

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMINOID

1.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Cấu trúc hóa học:

Nhóm chất màu curcuminoid là hỗn hợp của 3 chất - thành phần quan trọng nhất

của củ nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), có công thức cấu tạo

Curcumin II

(Desmethoxy-curcumin)

(2)

(4-hydroxy-3-

1-(4-hydroxyphenyl)-7- 1,6-dien-3,5-dion

methoxyphenyl)hepta-Curcumin III

(Bisdesmethoxy-

curcumin) (3)

hydroxyphenyl) -hepta- 1,6-dien-3,5-dion

Tinh thể hình kim, màu vàng cam

Tinh thể hình kim, màu vàng cam tím

Tính chất hóa học:

 Tính chất của nhóm polyphenol:

- Tan trong dung dịch kiềm

- Tác dụng với các tác nhân oxy hóa: nhóm –OH hoạt hóa nhân thơm, làm nhân thơm nhạy cảm đối với các tác nhân oxy hóa, nên curcumin rất dễ bị oxy hóa [1]

- Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: với Fe3+ tạo phức màu xanh đen, với thiếc (Sn), kẽm (Zn), đồng (Cu), canxi (Ca), magnesi (Mg) tạo hợp chất có màu từ vàng cam đến nâu đen

 Tính chất của nhóm diceton:

Trong môi trường acid acetic, curcumin dễ phản ứng với các hợp chất có cấu trúc kiềm (Y-NH2) như hydroxylamin (Y = -OH), hoặc phenylhydrazin (Y = C6H5-NH-) tạo sản phẩm lần lượt là 3,5-bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)isoxazol và 3,5-bis(3-methoxy-4-hydroxylstiryl)-1-phenylpirazol Các sản phẩm này đều có hoạt tính kháng nấm và chống oxy hóa tốt [3]

Hình 1.2 Phản ứng amin hóa β-diceton của curcumin

Trong dung dịch nước, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dưới dạng diceton; ngược lại, ở pH > 8, dạng enol chiếm ưu thế hơn 27 Tùy theo từng dung môi thích hợp, có thể có trên 95% curcumin tồn tại ở dạng enol [13]

 Ảnh hưởng của pH tới dạng tồn tại của curcuminoid trong dung dịch nước (Hình 1.4) [13]

Động học của phản ứng thủy phân curcumin trong dung dịch nước trong khoảng

pH = 1 – 11 đã được nghiên cứu bằng phương pháp HPLC

- Ở pH < 1, dung dịch nước của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A+

- Ở khoảng pH = 1 – 7, curcumin rất ít tan trong nước Ở khoảng pH này, dung dịch nước của curcumin có màu vàng và tồn tại chủ yếu ở dạng trung tính H3A

- Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-, HA2- và

A3- lần lượt tương ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0

Hình 1.4 Dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

 Độ ổn định:

Curcumin tương đối ổn định ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH>7 Các sản phẩm phân hủy curcumin ở pH = 7 – 10 được xác định bằng phương pháp HPLC Các sản phẩm tạo thành ban đầu là acid ferulic và feruloylmethan, ngoài ra còn

có các sản phẩm ngưng tụ Sau đó feruloylmethan nhanh chóng bị chuyển màu (chủ

yếu là từ vàng đến vàng nâu) rồi bị phân hủy thành vanillin và aceton (Hình 1.5) [13]

Hình1.5 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

Đặc biệt, curcumin không bền dưới tác dụng của ánh sáng, nhất là trong dung dịch Sau khi chiếu bức xạ quang học, các sản phẩm được xác định giống như các sản phẩm phân hủy là acid ferulic, acid vanillic và vanillin [13]

Sản phẩm ngưng tụ

) và oxyd nitric (NO) Các diarylheptanoid, curcumin I,

curcumin II, curcumin III là những hoạt chất được phân lập từ Curcuma longa, có tác

dụng quét peroxynitrit Các hợp chất trên đã thể hiện hoạt tính quét peroxynitrit với

IC50 lần lượt là 4,0; 6,4 và 29,7 μm [2]

Trong các nghiên cứu về sự bảo vệ quá trình peroxy hóa lipid, curcumin đã thể hiện sự ức chế mạnh (18 – 80%) Tùy thuộc liều dùng mà quá trình peroxy hóa lipid

bị ức chế Quá trình này gây bởi Fe-NTA (ferric nitrilotriacetat) và H2O2 được đo bằng

sự hình thành malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học trong các vi thể thận [2]

Theo nghiên cứu của Khopde và các cộng sự, tác dụng chống oxi hóa của curcuminoid gấp ít nhất 10 lần các chất chống oxy hóa khác thậm chí cả vitamin E [16]

- Bảo vệ tế bào thần kinh:

Bệnh Alzheimer (sa sút trí tuệ, giảm trí nhớ, rối loạn chức năng ở tuổi già) bắt nguồn từ sự tích tụ tinh bột (Abeta), tổn thương do chứng viêm và sự oxy hóa protein

ở vỏ não, được chữa trị bằng việc sử dụng chất chống viêm và chống oxy hóa Curcumin trong nghệ vàng có hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa mạnh có thể

ngăn chặn những tổn thương nói trên gây ra ở vùng chất xám trên vỏ não In vitro,

curcumin ức chế sự tích tụ Abeta 42 tốt hơn Ibuprofen và Naproxen, ngăn chặn sự hình thành chất oligomer Abeta 42 Khi nuôi chuột nhắt trưởng thành Tg2576, sự tích

tụ tinh bột đã hoàn chỉnh, ở các mảnh đánh dấu curcumin thấy giảm mức độ tích tụ tinh bột làm giảm gánh nặng cho mảnh Như vậy curcumin đã trực tiếp liên kết những

loại s-amyloid nhỏ để bao vây sự tích tụ và hình thành xơ in vitro và in vivo Cơ chế

tác dụng của curcumin là làm giảm sự tích tụ tinh bột và chống oxy hóa protein tế bào não Curcumin có thể dễ dàng liên kết với các kim loại oxy hóa- khử sắt và đồng, các

kim loại này tập trung trên vỏ não, có khả năng gây ngưng kết tinh bột và oxy hóa protein Ngoài ra có thể ngăn chặn tổn thương viêm bằng cách ngăn ngừa sự cảm ứng kim loại của NF- kappaB Những dữ liệu trên cho thấy curcumin đã phá vỡ sự kết tụ các thành phần của mảng có hiệu quả, đồng thời ngăn chặn được tổn thương do viêm

và oxy hóa-khử protein trên vỏ não Vì thế curcumin từ nghệ vàng hoàn toàn có thể sử dụng trên lâm sàng để dự phòng và điều trị bệnh Alzheimer [2]

- Tác dụng chống viêm

Curcuminoid có hoạt tính chống viêm cao Curcuminoid làm bất hoạt các enzym tham gia vào phản ứng viêm, thông qua cơ chế chủ yếu là ức chế receptor NF-κ [2] Jayaraj Ravindran và đồng nghiệp (2010) đã chứng minh Bisdesmethoxycurcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn curcumin (ức chế receptor NF-κ ) Khi cho tiến hành so sánh tác dụng chống viêm với curcumin, hispolon, hispolon methyl ether, dehydroxy hispolon, hydroxy hispolon, methoxy hispolon methyl ether, và methoxy hispolon, (hispolon có cấu trúc tương tự curcumin nhưng thiếu một nhân thơm, có tác dụng chống viêm) nhận thấy tác dụng chống viêm như sau: Bisdesmethoxycurcumin = Hispolon > hispolon methyl ether > hydroxy hispolon

> Curcumin > methoxy hispolon methyl ether > methoxy hispolon > dehydroxy hispolon Điều này cho thấy việc thay thế 1 nhóm methoxy cho 1 nhóm hydroxy tại vị trí metha ở vòng phenyl của curcumin tăng cường đáng kể tác dụng chống viêm [14][31]

- Bảo vệ dạ dày, chống viêm loét dạ dày- tá tràng

Cao nước hoặc cao methanol nghệ vàng cho thỏ uống, làm giảm tiết dịch vị và tăng lượng chất nhầy Cho chuột cống trắng uống cao nghệ, làm giảm tiết dịch vị và

bảo vệ niêm mạc dạ dày, tá tràng

Nghệ kích thích sản sinh chất nhầy ở thành ruột của chuột Cho bệnh nhân uống bột nghệ ngày 4 lần, trong 7 ngày thấy có hiệu quả tốt với rối loạn tiêu hóa do acid, do đầy hơi và do mất trương lực cơ

Các proteinase kim loại cơ bản (MMP - matrix metalloproteinase) đóng vai trò quan trọng trong điều tiết dịch vị và làm lành vết thương sau viêm Curcumin đẩy nhanh quá trình làm lành vết loét và bảo vệ vết loét thông qua việc ức chế hoạt tính

MMP- 9 và kích thích hoạt tính MMP- 2 Nhóm S Swarnakar đã nghiên cứu tác dụng của curcumin từ nghệ vàng trên mô hình loét dạ dày gây bởi indomethacin Kết quả cho thấy curcumin chống loét mạnh với loét dạ dày cấp tính bằng cách dự phòng sự suy kiệt glutathion, chống peroxy hóa lipid, tái tạo lớp biểu mô nhằm chống lại sự bào mòn bề mặt thành dạ dày do các tổn thương gây ra trong khoang dạ dày Sử dụng curcumin tùy theo liều qua đường uống hay đường tiêm phúc mạc đều có thể ngăn chặn viêm loét dạ dày tá tràng [2][29]

Helicobacter pylori là vi khuẩn gây viêm loét trên tế bào biểu mô thành dạ dày

Tế bào biểu mô nhiễm vi khuẩn này dẫn tới sự hoạt hóa yếu tố sao chép NF- kappaB gây cảm ứng gen cytokin/chemokin- là gen kích thích gây viêm, đáp ứng gen động tế bào (sự phát tán tế bào) Curcumin ức chế sự hoạt hóa NF- kappaB và sự phát tán tế bào, do đó hạn chế quá trình tạo kháng nguyên gây viêm và ngăn chặn được sự phát triển của vi khuẩn Vì vậy, curumin rất có tiềm năng trong điều trị viêm loét dạ dày

khởi phát từ Helicobacter pylori [2]

- Phòng và điều trị ung thư

Curcuminoid ngăn chặn biến đổi, khởi phát u, phát triển u, xâm lấn, hình thành mạch và di căn Nghiên cứu in vivo cho thấy curcumin ức chế chất gây ung thư da, ruột già, ruột kết, gan ở chuột, động vật có vú, ức chế sinh sôi tế bào u gồm tế bào bạch cầu ,T, ung thư biểu mô ruột kết, biểu bì, vú

Có những báo cáo về sự tác động của curcuminoid đối với sự tăng sinh tế bào MCF7 (dòng tế bào gây ung thư tuyến vú của con người) Theo đó desmethoxycurcunin là chất ức chế mạnh nhất MCF-7, tiếp theo đó là curcumin và bisdesmethoxycurcumin [28]

Curcumin là chất gây độc tế bào theo cơ chế diệt các tế bào ác tính, vô hiệu hóa

tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành tính Trong khi đó, nhiều thuốc khi diệt tế bào ác tính cũng diệt luôn tế bào lành tính, làm cơ thể suy kiệt Những thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy không có giới hạn liều dùng độc tính khi dùng những liều tới 10 gam/ngày Do đó, curcumin hiện nay được nghiên cứu sử dụng phổ biến trong các chế phẩm ngăn chặn

sự khởi phát, phát triển và di căn của khối u [21]

Curcumin có khả năng loại bỏ gốc tự do, ức chế các loại men và hoạt tính của một số chất gây đột biến tế bào có khả năng dẫn đến ung thư trong đồ uống hay thức

ăn được chế biến và bảo quản không đảm bảo chất lượng, giúp cơ thể ngăn ngừa ung

thư một cách tích cực Một số thử nghiệm in vitro và in vivo phát hiện thấy curcumin

có khả năng ức chế hoạt tính gây ung thư của các chất này [2][6][21]

- Dùng ngoài: kháng khuẩn, chống nấm, chóng lành vết thương và liền sẹo

Trong điều trị bỏng, kem nghệ có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, loại trừ tổ chức hoại tử bỏng, có tác dụng tái tạo tổ chức và liền sẹo Cao nghệ chiết với cloroform 10% được dùng tại chỗ vùng bệnh nấm, tốt với các bệnh nấm da

Nghệ có tác dụng kháng khuẩn nhờ một số thành phần hóa học như: Curcumin I

có tác dụng ức chế in vitro sự phát triển một số loài vi khuẩn mà trong đó điển hình là trực khuẩn lao Salmonella paratyphi Chất ar- tumeron từ tinh dầu và dịch chiết n-

hexan từ lá nghệ diệt ấu trùng muỗi Aedesaegyti [2]

Trong quá trình làm lành vết thương có vai trò quan trọng của sự giải phóng chậm các chất chống oxy hóa và sự hỗ trợ tái tạo mô của collagen Một số nghiên cứu tạo liên kết giữa curcumin và collagen cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của curcumin

có hiệu quả trong việc quét sạch các gốc tự do gây viêm loét, kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thương ở mô [2]

- Hỗ trợ chức năng gan, mật

Curcumin cho chuột cống trắng ăn, có tác dụng kích thích hoạt tính men arylhydroxylase là men phụ thuộc vào cytocrom P450 của ty lạp thể trong tế bào gan, giúp giải độc và bảo vệ tế bào gan, chống viêm nhiễm, hoại tử, giúp tế bào gan hồi phục A Raysid đã chứng minh, curcumin tạo ra tác dụng động học đối với mật Với 20mg curcumin có khả năng làm co ngắn túi mật 29% khi quan sát trong 2 giờ Do đó curcumin có tiềm năng trong điều trị dự phòng sự hình thành sỏi trong túi mật, có thể dùng trên lâm sàng để thúc đẩy dòng mật hoặc đẩy dạng bùn mật trong túi mật ra ngoài Ngoài việc làm tăng lưu lượng mật, curcumin còn làm tăng lượng cholesterol và acid mật do mật tiết ra [26]

- Các tác dụng khác:

Curcumin từ nghệ vàng có tác dụng kháng virus, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan , C Đặc biệt, curcumin đã được nghiên cứu về tác dụng ức chế integrase HIV- 1, ức chế protease HIV- 1 và HIV- 2 để triển khai các chất chống HIV, “chặt đứt” một trong tám mắt xích của quá trình nhiễm HIV [26]

Curcumin chiết từ nghệ có tác dụng ức chế sự tan hồng cầu gây bởi hydrogen peroxyd ở nồng độ thấp nhưng không ức chế ở nồng độ cao, không có tác dụng làm giảm số lượng bạch cầu đa nhân trung tính với nồng độ thử nghiệm [7

1.1.3 Phương pháp tách hỗn hợp curcuminoid:

Năm 2002, Guaddadarangavvanahally K Jayaprakasha và cộng sự đã tách ba thành phần trong hỗn hợp curcuminoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, hệ dung môi sử dụng là benzene và ethyl acetat với độ phân cực tăng dần Curcumin thu được với hệ dung môi benzene : EtOAc (82:18 tt/tt), trong khi DMC và DMC thu được tương ứng với hệ dung môi benzene : EtOAc (70:30 tt/tt) và (58:42 tt/tt) Các phân đoạn thu được từ cột sắc ký được cô chân không và kết tinh lại Hiệu suất tách tương ứng của các chất curcumin, DMC và BDMC là 2,2; 4,46 và 3,4% [11 Năm 2003, Vajragupta O và cộng sự đã tách hỗn hợp curcuminoid thu các thành phần đơn lẻ bằng phương pháp sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CHCl3 : MeOH : AcOH (98 : 5 : 2), bột curcumin được hòa tan trong aceton Theo phương pháp này, curcumin được rửa giải trước, sau đó là hỗn hợp curcumin với DMC, tiếp theo là BDMC tinh khiết DMC tiếp tục được tách lần thứ hai bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : MeOH (95:5) [33]

Năm 2005, L Pe´ret-Almeida và cộng sự đã cải tiến phương pháp tách các curcuminoid Trong một vài nghiên cứu trước đây, các tác giả thực hiện tách các curcuminoid bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột Pha tĩnh được sử dụng hầu hết là silica gel 60G với các hệ dung môi khác nhau bao gồm benzen, ethyl acetat, ethanol, cloroform, acid acetic, n-hexan và methanol trong sắc ký lớp mỏng và benzen, nước, toluen, và ethyl acetate trong sắc ký cột Tuy nhiên, do độ phân giải kém chỉ thu được curcumin có hàm lượng 80% Hơn nữa không tách được demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin

Trong nghiên cứu này, các tác giả đã thực hiện tách từng curcuminoid ra khỏi hỗn hợp như sau:

a Kết tinh curcumin:

Việc kết tinh curcumin được thực hiện bằng cách hòa tan mẫu trong methanol ở

60oC Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm từ từ nước cất, hỗn hợp được giữ ở 5oC trong 2h Tinh thể curcumin được tách ra khỏi dung dịch ban đầu bằng cách lọc

Tetrahydrocurcuminoid có công thức cấu tạo như hình 1.6

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của tetrahydrocurcuminoid

Cấu tạo và một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid thể hiện ở bảng

1.2 [10]

Bảng 1.2 Một số tính chất vật lý của các tetrahydrocurcuminoid

THC I

(Tetrahydro- curcumin)

3-methoxyphenyl)- hepta-3,5-dion]

[1,7-Bis-(4-hydroxy-THC II

tetrahydrocurcumin)

(Desmethoxy- (4-hydroxy-3-

[1-(4-hydroxyphenyl)-7- 3,5-dion]

methoxyphenyl)hepta-THC III

(Bisdesmethoxy- tetrahydrocurcumin)

[1,7-Bis- (4-hydroxyphenyl) - hepta-3,5-dion]

Chất bán rắn – Chất nhày không màu Tinh thể không màu Điểm chảy

1.2.2 Nguồn gốc tetrahydrocurcumin:

Các nghiên cứu cho thấy, trong cơ thể tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin,

và octahydrocurcumin là những chất chuyển hóa của curcumin ở đường tiêu hóa Hexahydrocurcumin tìm thấy ở mô gan cả chuột cái và chuột đực, trong khi đó ở chuột đực hình thành octahydrocurcumin nhiều hơn là THC, còn ở chuột cái THC lại được hình thành nhiều hơn so với octahydrocurcumin [12]

1.2.3 Tác dụng dược lý

1.2.3.1 Tác dụng chống viêm:

Curcumin và 4 chất tổng hợp tương tự được nghiên cứu Hoạt lực chống viêm của curcumin, các dẫn xuất của curcumin và phenylbutazon được thiết lập theo thứ tự giảm dần như sau:

Natricurcumin  THC  Curcumin  Phenylbutazon  triethylcurcumin

Khi so sánh curcumin và các dẫn xuất của nó trong các mô hình viêm cấp và bán cấp thì các dẫn chất của curcumin có tác dụng làm giảm viêm cấp tốt hơn curcumin [22]

1.2.3.2 Tác dụng chống oxy hóa:

Hoạt tính chống oxy hóa của THC đã được nghiên cứu cả trên in vivo và in vitro

Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng THC có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn curcumin, các curcuminoid khác và vitamin E [22][25]

Poorichaya S và cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxy hóa của curcumin cùng các dẫn xuất của nó đối với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và chỉ ra rằng THC thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH cao nhất với giá trị IC50 = 18,7 µM Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự: THC > HHC = OHC > curcumin > DMC > BDMC Nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng THC có khả năng

ức chế mạnh nhất đối với AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihydroclorid) - một tác nhân gây ra quá trình peroxy hóa lipid Lý giải cho những điều này, các tác giả cho rằng chính sự có mặt của nhóm methoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên hợp trong mạch carbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng kể [24]

Một nghiên cứu in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của tetrahydrocurcumin

và các curcuminoid khác đã được thực hiện trên tế bào hồng cầu thỏ và gan chuột, sử dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nước, được phân tích bằng phương pháp thiocyanat và phương pháp TBA Kết quả cho thấy rằng tetrahydrocurcumin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid [19][22]

Tác dụng ức chế của curcumin và tetrahydrocurcumin đối với quá trình peroxy hóa lipid trên màng hồng cầu gây bởi tert-butylhydroperoxid đã được nghiên cứu gần đây Kết quả đã chứng minh rằng THC cho thấy hiệu quả tốt hơn curcumin Các tác giả kết luận rằng, THC có khả năng dọn các gốc tự do như tert-butoxyl và peroxyl một cách triệt để [19]

Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so với curcumin, các tác giả cho rằng THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đường tiêu hóa Họ cho rằng THC đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chống oxy hóa

của curcumin trong cơ thể, khi mà curcumin được chuyển hóa thành THC Nhóm phenolic đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa bằng THC Mặt khác, nhóm β-diceton cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa của THC, bởi vì sự phân cắt liên kết C–C trong khung β-diceton được quan sát thấy trong quá trình chống oxy hóa Như vậy, nhóm β-diceton đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn sau của quá trình chống oxy hóa [19][22]

1.2.3.3 Tác dụng trên tế bào ung thư:

Nghiên cứu chứng minh rằng THC có tác dụng mạnh hơn curcumin trong việc ức chế sự phát triển tụ điểm ẩn khác thường ACF (aberrant crypt foci) và sự tăng nhanh tế bào THC phù hợp trong việc sử dụng để chống lại tác nhân gây ung thư trong cơ thể cũng như curcumin [18][34]

1.2.4 Tổng quan về các phương pháp bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid

1.2.4.1 Phương pháp của Uehara và cộng sự (1987)

Các tác giả đã tiến hành hydro hóa curcumin trong hệ dung môi ethyl acetat/ acid acetic ở 50oC và 3,3 at trên xúc tác PtO2 Sau phản ứng, cất loại dung môi thu được cặn gôm màu vàng Hòa tan cặn trong iso propanol nóng và để kết tinh qua đêm ở 2 –

4oC Lọc, rửa chất rắn tạo thành, tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan/ethyl acetat đã thu được tinh thể THC màu trắng, to

nc 98 – 99oC với hiệu suất 30% [32]

1.2.4.2 Phương pháp của Junko Ishida và cộng sự (2002)

Các hợp chất curcumin I (1), curcumin II (2), curcumin III (3) thu được bằng sắc

ký cột (silica gel, CHCl3 – MeOH) từ curcumin, trong đó 2 và 3 chiếm một tỷ lệ nhỏ

[15]

Hydro hóa 1 với Pd/C thu được 4, 5, 6 [15] Dung dịch 1 trong MeOH được khử

hóa trong 4 h ở nhiệt độ phòng, 1 atm với xúc tác Pd/C 10% Sơ đồ phản ứng như trên

hình 1.7

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin,

hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pd/C

1.2.4.3 Phương pháp của Su-Lin Lee và cộng sự (2005)

Từ curcumin 1, nhiều sản phẩm khử 4, 5, 6 được mô tả trong tài liệu Những điều

kiện khác nhau của xúc tác Pt/C trong phản ứng hydro hóa cũng được xem xét Hiệu

suất tối ưu của hexahydrocurcumin 5 từ 1 là 30% và octahydrocurcumin 6 là 91,8 % dưới áp suất cao và thời gian phản ứng dài Mặc dù 5 và 6 có thể thu được từ 3 bằng

phản ứng khử hóa với NaBH4, nhưng hiệu suất rất thấp [30] Sơ đồ phản ứng được thể

hiện trên hình 1.8

Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin tạo thành tetrahydrocurcumin,

hexahydrocurcumin, octahydrocurcumin dùng xt Pt/C

1.2.4.4 Phương pháp của Trần Khắc V và cộng sự (2011)

Việc tổng hợp các tetrahydrocurcuminoid được mô tả ở sơ đồ dưới đây Các

curcuminoid nguyên liệu phản ứng 1, 2 và 3 được phân lập từ hỗn hợp ba thành phần curcumin I (1), curcumin II (2) và curcumin III (3) được chiết xuất từ củ nghệ vàng

(Curcuma Longa L.) Hỗn hợp gồm ba thành phần trên được sắc ký cột silicagel với hệ

dung môi rửa giải diclorometan : methanol tăng dần từ CH2Cl2 : MeOH (100 : 0 đến

90 : 10) thu được curcumin I, II, III Các tetrahydrocurcuminoid được điều chế chủ yếu từ phản ứng khử hóa nối đôi liên hợp 1,3-diceton sử dụng xúc tác Pd/C trong dung

môi ưa nước [5] (xem hình 1.9)

Hình 1.9 Sơ đồ phản ứng khử hóa các curcuminoid tạo thành các

tetrahydrocurcuminoid tương ứng dùng xúc tác Zn-NiCl 2 sử dụng kĩ thuật siêu âm

trong dung môi EtOH-H 2 O

Ở sơ đồ trên, các curcuminoid (1, 2, và 3) được hòa tan trong hệ dung môi

(ethanol : nước), sau đó hòa tan muối NiCl2 và cuối cùng bột kẽm được cho vào từ từ đồng thời tiến hành siêu âm Theo d i quá trình phản ứng cho thấy, trong khoảng 30 phút đầu, khí hydro mới sinh thoát ra mạnh và sau khoảng thời gian này các curcuminoid dần dần bị mất màu, chuyển hóa thành các tetrahydrocurcuminoid Quá trình chuyển hóa được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, hệ dung môi n-hexan : ethylacetat Để tránh bột kẽm nhanh bị ngộ độc bề mặt vì nhiều lý do dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, lượng kẽm được cho vào thành nhiều đợt trong khoảng thời gian 30 phút Quá trình khử hóa các curcuminoid thành các tetrahydrocurcuminoid cao nhất là 82% đối với curcumin trong thời gian 2 giờ với tỷ lệ mol của curcumin : Zn : NiCl2 là 1 : 6 : 1,5 Cấu trúc của sản phẩm được kh ng định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và

13C-NMR Cơ chế chính xác của quá trình khử hóa này vẫn chưa r Tuy nhiên các công bố chỉ ra vai trò quan trọng của NiCl2 trong việc hoạt hóa bột kẽm để giải phóng hydro mới sinh dưới tác dụng của năng lượng siêu âm, còn sự có mặt của nước giúp hòa tan tốt hơn muối NiCl2 [5]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT Ị

Đề tài sử dụng một số nguyên liệu, hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyên liệu curcuminoid được lấy từ Công ty cổ phần dược phẩm Bắc Ninh, có thành phần curcumin I 62,1%

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu

13 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer (Viện Hóa

học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ

14

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR) Bruker AV-500 (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam)

Mỹ

15 Máy đo phổ khối lượng Varian 320 Ms (Viện Hóa học –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ

Tiến hành phản ứng khử hóa curcuminoid với hai tác nhân khử khác nhau là khí hydro

có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid

- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp

và đo nhiệt độ nóng chảy

- Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

- Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm bán tổng hợp được bằng phương pháp

DPPH

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid

- Dùng phương pháp kết tinh phân đoạn

- Dùng sắc ký cột với hệ dung môi thích hợp

2.3.2 Bán tổng hợp hóa học:

Bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ curcuminoid bằng phản ứng khử hóa sử dụng

các tác nhân khử hóa khác nhau:

- Dùng khí hydro với xúc tác Pd/C 5 %

- Dùng kim loại trong môi trường acid

2.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết

 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu được bằng phương pháp SKLM và phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy

 SKLM: Tính giá trị hệ số lưu giữ Rf

 Dung môi hòa tan: ethanol

 Hệ dung môi chạy sắc ký: Dicloromethan : Methanol = 20:1

C-2.3.5 Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp được

Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phương pháp DPPH) được thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viên hàn lâm khoa học & công nghệ Việt Nam

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID

Dùng phương pháp tách thích hợp thu được từng thành phần riêng biệt:

Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III Sơ đồ tách được thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid

 Cách tiến hành

Bột curcuminoid có thành phần curcumin I (62,1 %), curcumin II (24,6%), và

curcumin III (8,3%) đầu tiên được kết tinh lại 3 lần trong dung môi thích hợp, các

- Dịch lọc kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, cất quay chân không đến kiệt thu sản phẩm

thô Tiếp tục đem kết tinh lại lần 2,3 tương tự như lần 1

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi dùng kết tinh đến quá trình kết tinh

Tiến hành khảo sát với 2 dung môi là EtOH 96% và MeOH Kết quả khảo sát

được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh

đến quá trình kết tinh curcuminoid

kết tinh

Nhiệt độ kết tinh ( o C)

Thời gian kết tinh (h)

KL curcumin I (g)

T o nc ( o C)

- Dung môi sử dụng là MeOH cho khối lượng tinh thể curcumin I nhiều hơn, nhưng không đáng kể, mặt khác MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH 96%

Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH 96% có nhiều ưu điểm hơn, do đó EtOH 96% được chọn làm dung môi kết tinh, kết tinh tại nhiệt độ phòng trong 24h Sau khi chọn được các điều kiện kết tinh thích hợp, tiến hành kết tinh 3 lần, lọc, rửa, sấy, cân định lượng thu được tinh thể curcumin I Kết quả kết tinh được trình bày

ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96%

Các bước tiến hành sắc ký cột:

 ước 1: Chuẩn bị

- Cân 100,00 g silicagel, ngâm trong pha động trong khoảng 30 phút

- Cột rửa sạch, sấy khô, lót đáy cột bằng bông, cố định cột sắc ký song song,

th ng góc với trục của giá đỡ

 ước 2: Nhồi cột

- Cho dung môi đến khoảng nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silicagel vào cột cho đến hết lượng silicagel cần nhồi, đồng thời gõ nhẹ để nén các lớp silicagel Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silicagel để tránh hiện tượng khô cột

- Đặt một miếng giấy lọc lên trên bề mặt lớp silicagel

 ước 3: Đưa chất phân tích vào cột

- Hòa tan mẫu vào một lượng tối thiểu dung môi pha động

- Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mực giấy lọc, rồi nạp hết dung dịch chất phân tích vào cột

 ƣớc 5: Thu hồi các phân đoạn

- Các phân đoạn có Rf giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy khô và cân định lƣợng

Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng

sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1

II (0,61 g), còn curcumin III thu đƣợc một lƣợng rất nhỏ (0,04 g)

 Kiểm tra độ tinh khiết của các curcuminoid thành phần:

Các curcuminoid thành phần sau khi tách, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển dicloromethan : methanol (20:1) Kết quả cho thấy các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết

phụ (Hình 3.1) Trong đó Rf curcumin I = 0,8 ; Rf curcumin II = 0,46 và Rf curcumin III = 0,34

Hình 3.2 SKLM của các curcuminoid thành phần

3.2 KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN

Chúng tôi đã thực hiện phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trường acid

3.2.1 Khử hóa curcumin I (curcumin)

3.2.1.1 Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5%

 Sơ đồ phản ứng: được thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H 2 /Pd/C

 Tiến hành phản ứng:

Hoạt hóa xúc tác: Cho xúc tác Pd/C 5% vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích

250 ml, thêm 20 ml dung môi, khuấy từ ở nhiệt độ khoảng 0-5oC trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) trong 100 ml dung môi, cho dung dịch thu được vào bình phản ứng trên Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trong quá

trình phản ứng ở áp suất khí quyển Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp

 Xử lý hỗn hợp phản ứng:

Hỗn hợp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác Dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 50oC Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan:

methanol = 20:1 Các bước tiến hành sắc ký cột tương tự như phần 3.1

 Khảo sát phản ứng:

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, bao gồm dung môi phản ứng và tỷ lệ khối lượng xúc tác so với curcumin

a Khảo sát dung môi phản ứng

Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là MeOH, EtOH tuyệt đối và EtOH 96%

Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H 2 /Pd/C

ứng

Tỷ lệ KL xt/curcumin (%)

KL sp (g)

Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH có nhiều ưu điểm hơn, do đó EtOH tuyệt đối được chọn làm dung môi cho các phản ứng khảo sát tiếp theo

b Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng

Sau khi chọn được dung môi thích hợp cho phản ứng là EtOH tuyệt đối, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng Tiến hành khảo sát với các tỷ lệ khối lượng xúc tác là 2%, 5%, 8% và 10% so với curcumin

Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C

curcumin (g)

KL xt (g)

Tỷ lệ KL xt/curcumin (%)

t pư (h)

KL sp(g)

- Nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm thu được từ các thí nghiệm khảo sát các tỷ

lệ xúc tác khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể

- Khi tăng tỷ lệ xúc tác thì thời gian phản ứng giảm, hiệu suất phản ứng cũng thay đổi Với tỷ lệ xúc tác là 2%, thời gian phản ứng là 24h, hiệu suất phản ứng là thấp nhất (56,41%) Hiệu suất phản ứng đạt được cao nhất là 65,32% khi tỷ lệ xúc tác là 5%, thời gian phản ứng là 18h Tiếp tục tăng tỷ lệ xúc tác thì hiệu suất phản ứng giảm

Từ các dữ liệu trên, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ xúc tác là 5%, với thời gian phản ứng là 18h

Từ các kết quả khảo sát trên đã thấy rằng, điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% là:

- Dung môi: Ethanol tuyệt đối

- Tỷ lệ khối lượng xt/curcumin: 5%

Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu

ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml Sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng, thêm acid vào bình phản ứng

Cân bột kẽm, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt trong thời gian khoảng 30 phút Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, duy trì pH acid trong suốt quá trình phản ứng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3 để xác định thời gian phản ứng thích hợp, so sánh với THC tinh khiết thu được ở phản ứng khử hóa với tác nhân H2/Pd/C

- Lớp dung môi hữu cơ được gộp lại, thêm 5,00g Na2SO4 khan, lắc đều, để yên khoảng 1h để loại nước Sau đó lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40oC