Sau khi xác định điều kiện khử hóa thích hợp nhất cho từng curcuminoid thành phần, chúng tôi tiến hành khử hóa hỗn hợp curcuminoid.
3.3.1. Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5%
Các thông số của phản ứng:
- Dung môi phản ứng: Ethanol tuyệt đối. - Tỷ lệ khối lƣợng xt/curcumin II: 5%. - Thời gian phản ứng: 18h.
Sơ đồ phản ứng: được thể hiện ở hình 3.10.
42
Hình 3.10. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcuminoid với tác nhân H2/Pd/C
Tiến hành phản ứng:
Hoạt hóa xúc tác: Cho 0,1 g xúc tác Pd/C 5% vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 500 ml, thêm 50 ml dung môi, khuấy từ ở nhiệt độ khoảng 0-5oC trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng. Hòa tan 2,00 g curcuminoid trong 200 ml ethanol tuyệt đối, cho dung dịch thu đƣợc vào bình phản ứng trên. Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trong quá trình phản ứng ở áp suất khí quyển. Trong suốt thời gian phản ứng, theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
- Hỗn hợp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác. Dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 50oC. Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1. Các bƣớc tiến hành sắc ký cột tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở phần 3.1.
- Dung môi chạy qua cột đƣợc hứng bằng các phân đoạn thể tích bằng nhau V = 40 ml. Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.14.
- Các phân đoạn có kết quả kiểm tra SKLM giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy và cân định lƣợng.
43
Bảng 3.14. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1
Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần Khối lƣợng (g)
1 - 36 1440 THC I 0,79 36 - 38 120 THC I, THC II 0,07 39 - 48 400 THC II 0,31 49-50 80 THC II, THC III 0,07 51-53 120 THC III 0,04 Nhận xét:
- Sản phẩm thu đƣợc chủ yếu là THC I (chiếm > 61,72%), tiếp theo là THC II ( chiếm > 24,21%), THC III chiếm một lƣợng rất nhỏ (3,13%).
3.3.2. Phản ứng khử hóa với tác nhân kẽm trong môi trƣờng acid
Các thông số của phản ứng:
- Acid sử dụng: HCl 20%.
- Tỷ lệ mol Zn/curcuminoid: 18/1. - Thời gian phản ứng: 4h.
Sơ đồ phản ứng: được thể hiện ở hình 3.11.
44
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 2,00 g curcuminoid vào 200 ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 500 ml. Sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng, thêm 10 ml acid HCl 20% vào bình phản ứng.
Cân 3,95 g bột kẽm, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt trong thời gian khoảng 30 phút. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, duy trì pH acid trong suốt quá trình phản ứng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n-hexan = 7:3.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
- Lọc loại chất rắn, thu dịch lọc.
- Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH trung tính, lọc loại tủa.
- Dịch lọc đem cất loại bớt một phần dung môi, sau đó đem chiết với dicloromethan: Lần 1 chiết với 50ml dicloromethan, thêm 30ml nƣớc cất. Lần 2 và 3, mỗi lần 50ml dicloromethan.
- Lớp dung môi hữu cơ đƣợc gộp lại, thêm 10,00g Na2SO4 khan, lắc đều, để yên khoảng 1h để loại nƣớc. Sau đó lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40oC.
- Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexan: ethyl acetat thay đổi từ 50:0 đến 1:1.
+Dung môi chạy qua cột đƣợc hứng bằng các phân đoạn thể tích bằng nhau V = 40 ml. Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.15.
+Các phân đoạn có kết quả kiểm tra SKLM giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy và cân định lƣợng.
45
Bảng 3.15. Kết quả tách các tetrahydrocurcuminoid từ hỗn hợp sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat
Phân đoạn Tổng thể tích (ml) Thành phần Khối lƣợng (g)
1 - 29 1200 THC I 0,74 30 - 32 120 THC I, THC II 0,08 33 - 41 360 THC II 0,28 41-44 160 THC II, THC III 0,08 45-47 120 THC III 0,03 Nhận xét:
- Sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng khử hóa với tác nhân kẽm trong môi trƣờng acid chủ yếu là THC I (chiếm > 61,15%), tiếp theo là THC II ( chiếm > 23,14%), THC III chiếm một lƣợng rất nhỏ (2,48%).
3.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm
- Sau khi bán tổng hợp các chất, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20: 1.
- Sau khi chạy sắc ký, soi bản mỏng dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm, các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ, và cho giá trị Rf trùng với Rf của THC I và THC II thu đƣợc khi khử hóa từng thành phần curcumin I và curcumin II tƣơng ứng: Rf THC I = 0,55; Rf THC II = 0,225 (Hình 3.12 và Hình 3.13).
- Sản phẩm thu đƣợc từ hai phản ứng khử với hai tác nhân khử khác nhau là H2/Pd/C 5% và Zn/HCl đƣợc chấm chồng trên cùng một bản mỏng và chạy sắc ký với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20: 1. Kết quả cho thấy các sản phẩm cho các vết đồng nhất trên bản mỏng ở hệ dung môi sử dụng.
46