Dùng phƣơng pháp tách thích hợp thu đƣợc từng thành phần riêng biệt: Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III. Sơ đồ tách đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid
Cách tiến hành
Bột curcuminoid có thành phần curcumin I (62,1 %), curcumin II (24,6%), và curcumin III (8,3%) đầu tiên đƣợc kết tinh lại 3 lần trong dung môi thích hợp, các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Hòa tan hoàn toàn 3,00 g curcuminoid trong 250 ml dung môi ở 60oC, sau đó để kết tinh.
- Tinh thể kết tinh đƣợc lọc hút chân không, rửa, kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng SKLM.
- Dịch lọc kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, cất quay chân không đến kiệt thu sản phẩm thô. Tiếp tục đem kết tinh lại lần 2,3 tƣơng tự nhƣ lần 1.
H A TAN ĐỂ KẾT TINH - Curcuminoid - Dung môi LỌC S C K CỘT Dicloromethan : Methanol (20:1) CURCUMIN II
CURCUMIN I CURCUMIN III
23
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của dung môi dùng kết tinh đến quá trình kết tinh.
Tiến hành khảo sát với 2 dung môi là EtOH 96% và MeOH. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid
STT Dung môi kết tinh Nhiệt độ kết tinh (oC) Thời gian kết tinh (h) KL curcumin I (g) Tonc (oC) 1 MeOH to phòng 24 1,08 182 – 184 2 EtOH 96% to phòng 24 1,02 182 – 184 Nhận xét:
- Với hai dung môi sử dụng là EtOH 96% và MeOH, khi để kết tinh để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24h, tinh thể thu đƣợc là curcumin I với nhiệt độ nóng chảy phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của curcumin I trong các tài liệu đã đƣợc công bố..
- Dung môi sử dụng là MeOH cho khối lƣợng tinh thể curcumin I nhiều hơn, nhƣng không đáng kể, mặt khác MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH 96%.
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH 96% có nhiều ƣu điểm hơn, do đó EtOH 96% đƣợc chọn làm dung môi kết tinh, kết tinh tại nhiệt độ phòng trong 24h.
Sau khi chọn đƣợc các điều kiện kết tinh thích hợp, tiến hành kết tinh 3 lần, lọc, rửa, sấy, cân định lƣợng thu đƣợc tinh thể curcumin I. Kết quả kết tinh đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
24
Bảng 3.2. Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96%
Lần kết tinh Vdung môi (ml) KL tinh thể (g) Hiệu suất (%)
1 250 1.02
2 150 0,26
3 50 0,08
Tổng: 1,36 73,12
Nƣớc cái cuối cùng là hỗn hợp curcuminoid ba thành phần, trong đó curcumin II và III đã đƣợc làm giàu, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1 để thu lấy từng curcuminoid từng thành phần.
Các bƣớc tiến hành sắc ký cột:
ƣớc 1: Chuẩn bị
- Cân 100,00 g silicagel, ngâm trong pha động trong khoảng 30 phút.
- Cột rửa sạch, sấy khô, lót đáy cột bằng bông, cố định cột sắc ký song song, th ng góc với trục của giá đỡ.
ƣớc 2: Nhồi cột
- Cho dung môi đến khoảng nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silicagel vào cột cho đến hết lƣợng silicagel cần nhồi, đồng thời gõ nhẹ để nén các lớp silicagel. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silicagel để tránh hiện tƣợng khô cột.
- Đặt một miếng giấy lọc lên trên bề mặt lớp silicagel.
ƣớc 3: Đƣa chất phân tích vào cột
- Hòa tan mẫu vào một lƣợng tối thiểu dung môi pha động.
- Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mực giấy lọc, rồi nạp hết dung dịch chất phân tích vào cột.
ƣớc 4: Triển khai sắc ký cột
- Cho dung môi rửa giải chạy qua cột, hứng các phân đoạn có thể tích khoảng 40 ml.
- Các phân đoạn đƣợc cất quay chân không để loại bớt dung môi, sau đó kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1.
25
ƣớc 5: Thu hồi các phân đoạn
- Các phân đoạn có Rf giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy khô và cân định lƣợng.
Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1
Phân đoạn Tổng thể tích
(ml) Thành phần Khối lƣợng (g)
1 - 18 720 Curcumin I 0,46
19 - 22 160 Curcumin I, Curcumin II 0,13
23 - 45 880 Curcumin II 0,61
46 - 52 280 Curcumin II, Curcumin III 0,29
53 - 55 120 Curcumin III 0,04
Nhận xét:
- Nƣớc cái thu đƣợc sau khi kết tinh hỗn hợp curcuminoid, đem chạy sắc ký cột, thu đƣợc các curcumin thành phần, trong đó chủ yếu là curcumin I (0,46 g), curcumin II (0,61 g), còn curcumin III thu đƣợc một lƣợng rất nhỏ (0,04 g).
Kiểm tra độ tinh khiết của các curcuminoid thành phần:
Các curcuminoid thành phần sau khi tách, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển dicloromethan : methanol (20:1). Kết quả cho thấy các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ (Hình 3.1). Trong đó Rf curcumin I = 0,8 ; Rf curcumin II = 0,46 và Rf curcumin III = 0,34.
26
Hình 3.2. SKLM của các curcuminoid thành phần