Để xác định cấu trúc sản phẩm, chúng tôi đã tiến hành ghi và phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR). Kết quả phổ đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau:
3.4.1. ác định cấu trúc curcumin I (curcumin)
Phổ đồ MS, 1H-NMR, 13C-NMR của curcumin I đƣợc trình bày ở các phụ lục 1,
2, 3, 4, và 5.
Kết quả phân tích phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR của curcumin I đƣợc trình bày lần lƣợt trong các bảng 3.16, 3.17 và 3.18.
Hình 3.12. SKLM của THC trên hệ dung môi CH2Cl2: MeOH = 20:1
Hình 3.13. SKLM của THC II trên hệ dung môiCH2Cl2: MeOH = 20:1
47
Bảng 3.16. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của curcumin
Cấu trúc của curcumin KLPT
(g/mol) m/z
368,38
369,06 [M+H]+ 391,04 [M+Na]+
Bảng 3.17. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của curcumin
Cấu trúc của curcumin δ (ppm), dạng tín hiệu, vị trí H
3,83 (6H, s, 2 O-CH3) 6,05 (1H, s, =CHenol, H-4) 6,75 (2H, d, J = 15,5 Hz, H-2, H-6) 6,82 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-5’, H-5’’) 7,15 (2H, dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,5 Hz, H-6’, H-6’’) 7,31 (2H, d, J = 1,5 Hz, H-2’, H-2’’) 7,55 (2H, d, J = 16,0 Hz, H-1, H-7) 9,64 (2H, s, 2 -OH phenol)
48
Bảng 3.18. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của curcumin
Cấu trúc của curcumin δ (ppm), vị trí C
55,68 (C-8’, C-8’’) 100,79 (C-4) 111,35 (C-2’, C-2’’) 115,70 (C-5’, C-5’’) 121,08 (C-2, C-6) 123,08 (C-6’, C-6’’) 126,32 (C-1’, C-1’’) 140,67 (C-1, C-7) 147,97 (C-3’, C-3’’) 149,33 (C-4’, C-4’’) 183,18 (C-3, C-5) 3.4.2. ác định cấu trúc curcumin II (DMC)
Phổ đồ MS, 1H-NMR, 13C-NMR của curcumin II đƣợc trình bày ở các phụ lục 6,
7, 8, 9 và 10.
Kết quả phân tích phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR của curcumin II đƣợc trình bày lần lƣợt trong các bảng 3.19, 3.20 và 3.21.
Bảng 3.19. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của DMC
Cấu trúc của DMC KLPT
(g/mol) m/z
338,35
361,00 [M+Na]+
49
Bảng 3.20. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC
Cấu trúc của DMC δ (ppm), dạng tín hiệu, vị trí H
3,94 (3H, s, O-CH3) 5,80 (1H, s, =CH enol, H-4) 6,47 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-2) 6,48 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-6) 6,84 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’’, H-5’’) 6,90 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’) 7,07 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’) 7, 11 (1H, dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 2,0 Hz, H-6’) 7,44 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’, H-6’’) 7,57 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-1) 7,59 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7)
Bảng 3.21. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 & MeOD) của DMC
Cấu trúc của DMC δ (ppm), vị trí C 56,02 (C-8’) 101,21 (C-4) 110,14 (C-2’) 115,25 (C-5’) 116,02 (C-3’’, C-5’’) 121,16 (C-2) 121,58 (C-6) 123,00 (C-6’)
50 126,89 (C-1’) 127,58 (C-1’’) 130,10 (C-2’’, C-6’’) 140,69 (C-1) 140,80 (C-7) 147,40 (C-3’) 148,35 (C-4’) 159,29 (C-4’’) 182,75 (C-5) 183,43 (C-3) 3.4.3. ác định cấu trúc THC I (THC)
Phổ đồ IR, MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin I (khử thành phần) đƣợc trình bày ở các phụ lục 11, 12, 13 và 14.
Kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin I (khử thành phần) đƣợc trình bày lần lƣợt trong các bảng 3.22, 3.23 và 3.24.
Bảng 3.22. Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của THC (khử thành phần)
Cấu trúc THC Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trƣng (ῡ, cm-1) -OH phenol 3486 =C-H thơm 3072 -C-H no 2931; 2854 -C=O (β-diceton) 1608 -C=C- 1513; 1455
51
-C-O 1271; 1157; 1231
Bảng 3.23. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (khử thành phần)
Cấu trúc THC KLPT
(g/mol) m/z
372,41
395,07 [M+Na]+
Bảng 3.24. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (khử thành phần) Cấu trúc THC δ (ppm), dạng tín hiệu, vị trí H 2,54-2,68 (4H, m, 2 -CH2, H-2, H-6) 2,74 (4H, m, 2 -CH2, H-1, H-7) 3,68; 5,72 (2H, s, H-4) 3,73 (6H, s, 2 O-CH3, H-8’, H-8’’) 6,55-6,59 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-6’, H-6’’) 6,66-6,68 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-5’, H-5’’) 6,74-6,78 (2H, s, H-2’, H-2’’) 8,69, 8,71 (2H, s, 2 -OH, H-7’, H- 7’’)
52
Phổ đồ MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin I (tách từ khử hỗn hợp) đƣợc trình bày ở các phụ lục 15, 16 và 17.
Kết quả phân tích phổ MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin I (tách từ khử hỗn hợp) đƣợc trình bày lần lƣợt trong các bảng 3.25 và 3.26.
Bảng 3.25. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC (tách từ khử hỗn hợp)
Cấu trúc THC KLPT (g/mol) m/z 372,41 373,09 [M+H]+ 395,04 [M+Na]+
Bảng 3.26. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của THC (tách từ khử hỗn hợp) Cấu trúc THC δ (ppm), dạng tín hiệu, vị trí H 2,54-2,67 (4H, m, 2 -CH2, H-2, H-6) 2,73 (4H, m, 2 -CH2, H-1, H-7) 3,68; 5,72 (2H, s, H-4) 3,73 (6H, s, 2 O-CH3) 6,55-6,59 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-6’, H-6’’) 6,64-6,66 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-5’, H-5’’) 6,74-6,77 (2H, s, H-2’, H-2’’) 8,65, 8,68 (2H, s, 2 -OH)
53 3.4.4. ác định cấu trúc THC II
Phổ đồ MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin II (tách ra từ khử hỗn hợp) đƣợc trình bày ở các phụ lục 18, 19, 20 và 21.
Kết quả phân tích phổ MS, 1H-NMR của tetrahydrocurcumin II đƣợc trình bày lần lƣợt trong các bảng 3.27.
Bảng 3.27. Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của THC II
Cấu trúc THC II KLPT (g/mol) m/z 342,39 365,06 [M+Na]+ 397,05 [M+MeOH+Na]+
Bảng 3.28. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của THC II
Cấu trúc THC II δ (ppm), dạng tín hiệu, vị trí H 2,51-2,62 (4H, m, 2 -CH2, H-2, H-6) 2,70-2,86 (4H, m, 2 -CH2, H-1, H-7) 3,86 (3H, s, 1 O-CH3) 3,85; 5,39 (2H, s, H-4) 5,49-5,50 (2H, s, 2 OH phenol) 6,66 (2H, m, H-3’’, H-5’’) 6,69 (1H, s, H-2’) 6,73 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’) 6,82 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’’, H-6’’) 7,02 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6’)
54
3.5. THỬ TÁC DỤNG CH NG OXY HÓA CỦA CÁC CHẤT ÁN TỔNG HỢP ĐƢỢC
Phƣơng pháp thử:
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH phƣơng pháp DPPH: 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do đƣợc dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng = 517 nm.
Cách tiến hành:
Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH). Chất thử đƣợc pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt đƣợc một dãy các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 g/ml. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chƣa phản ứng bằng máy đọc Genios Tecan ở bƣớc sóng 517 nm. % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử đƣợc tính theo công thức sau:
SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%).
EC50 đƣợc tính theo giá trị SC tƣơng quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm đƣợc lặp lại với n = 3, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn đƣợc 50% số gốc tự do DPPH.
Kết quả:
Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do của các mẫu thử đƣợc trình bày ở bảng
55
Bảng 3.29. Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tư do của các mẫu thử theo phương pháp DPPH
STT Tên mẫu
Nồng độ có hiệu quả trung hòa gốc tự do
DPPH EC 50 (µg/ml) 128 µg/ml 32 µg/ml 8 µg/ml 2 µg/ml 0,5 µg/ml 1 Curcumin I 98 70 20 8,9 7 22,4 2 Curcumin hỗn hợp 97,76 76,17 30 3,8 0 18,43 3 THC 95,5 86 40 9,5 0 13,22 4 SP khử hỗn hợp 96,43 88,1 47 0 0 9,76 Resveratrol 8,3 Nhận xét:
Kết quả ở bảng trên cho thấy tất cả các mẫu thử gồm curcumin I, curcuminoid hỗn hợp, THC I, tetrahydrocurcuminoid hỗn hợp (SP khử hỗn hợp) đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh (đƣợc so sánh với chất tham khảo là resveratrol – chất này đƣợc sử dụng nhƣ là một chất chống oxy hóa hiệu quả). Trong đó sản phẩm khử hỗn hợp curcuminoid là tetrahydrocurcuminoid có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất (EC50 = 9,76 µg/ml) và hoạt tính này giảm dần theo thứ tự sau: tetrahydrocurcuminoid > THC > curcuminoid hỗn hợp > curcumin I.
56
Chƣơng 4: BÀN LUẬN
4.1. Về phƣơng pháp tách từng thành phần từ hỗn hợp curcuminoid
Kết tinh curcumin I:
- Việc tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp curcuminod nếu tiến hành ngay bằng sắc ký cột silica gel sẽ gặp rất nhiều khó khăn, tốn kém về dung môi, thời gian, mà hiệu suất tách lại thấp, do đó việc kết tinh loại bớt curcumin I trong hỗn hợp có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tách. Kết tinh đƣợc curcumin I từ hỗn hợp vừa thu đƣợc curcumin I tinh khiết vừa giảm thiểu đƣợc khối lƣợng chất đƣa lên cột, làm cho quá trình tách bằng sắc ký cột đƣợc dễ dàng hơn và hiệu suất tách cao.
- Việc lựa chọn dung môi rất quan trọng trong quá trình kết tinh, trong hầu hết các tài liệu đều kết tinh bằng hệ dung môi MeOH : H2O (5:1). Tuy nhiên với hệ dung môi này, tinh thể thu đƣợc là hỗn hợp curcuminoid 3 thành phần, và vẫn phải tiến hành sắc ký cột để tách riêng 3 thành phần này, điều này không có ý nghĩa trong việc tối ƣu hóa quá trình tách bằng sắc ký cột. Điều này có thể do việc thay đổi dung môi đột ngột khiến cho cả 3 curcuminoid thành phần đều kết tinh trở lại. Khi thực hiện kết tinh bằng 2 dung môi là MeOH và EtOH 96%, có thể thu đƣợc tinh thể curcumin I tinh khiết, trong đó MeOH cho hiệu suất lớn hơn không nhiều, mặt khác MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH, mặt khác EtOH là dung môi rẻ, dễ kiếm, nên việc chọn EtOH là dung môi kết tinh là hoàn toàn hợp lý.
Sắc ký cột:
Khi nƣớc cái đã đƣợc làm giàu 2 thành phần curcmin II và III sau khi kết tinh bớt curcumin I, việc sắc ký cột trở nên đơn giản hơn. Mặc dù vậy, do hàm lƣợng curcumin III trong hỗn hợp quá ít nên việc tách thành phần này cũng rất khó khăn. Một phần do curcumin rất dễ bị oxy hóa, dung môi pha động dễ bay hơi nên việc tách gặp nhiều khó khăn.
4.2.Về phản ứng khử hóa từng curcuminoid thành phần
Các phản ứng khử hóa curcumin đều không chọn lọc. Điều này có thể quan sát thấy trên SKLM. Các sản phẩm phụ của phản ứng có thể là sản phẩm hydro hóa một nối đôi hoặc sản phẩm khử hóa cả nhóm chức ceton không mong muốn. Điều này dẫn
57
đến khó khăn trong việc khử hóa chọn lọc nhóm alken tạo THC cũng nhƣ tinh chế sản phẩm. Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột rất tốn kém, chỉ có thể ứng dụng trong nghiên cứu ở quy mô nhỏ, khó áp dụng đƣợc ở quy mô sản xuất lớn.
Phản ứng khử hóa với H2/Pd/C:
Phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu. Trong phản ứng này, để khử hóa chọn lọc nhóm alken, tránh tạo các sản phẩm phụ không mong muốn, cần chú ý kiểm soát tỷ lệ xúc tác và thời gian phản ứng. Khi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ khối lƣợng xúc tác so với khối lƣợng curcumin, chúng tôi nhận thấy khi tăng tỷ lệ xúc tác lên cao hơn 5% thì hiệu suất phản ứng giảm. Điều này có thể là do lƣợng xúc tác nhiều dẫn đến khử hóa thêm một hoặc cả hai nhóm ceton, tạo ra các sản phẩm phụ là monoalcol và dialcol. Hiện tƣợng này cũng có thể gặp phải nếu thời gian phản ứng quá dài.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là sản phẩm tƣơng đối sạch, điều kiện khử hóa khá ổn định; tuy nhiên có nhƣợc điểm là khí hydro tạo hỗn hợp nổ với không khí ở khoảng nồng độ rất rộng (4,1-74,2%), cần chú ý vấn đề an toàn khi thực hiện phản ứng. Phƣơng pháp này khó ứng dụng ở quy mô lớn trong điều kiện của Việt Nam.
Phản ứng khử hóa với Zn/acid:
Khi sử dụng acid acetic thì thấy phản ứng không xảy ra. Điều này có thể là do: - Thứ nhất, lực acid của acid acetic yếu, không đủ mạnh để hoạt hóa kẽm.
- Thứ hai, kẽm phản ứng với acid acetic tạo ra muối kẽm acetat, dạng muối kẽm này có thể tạo phức với curcumin, làm ảnh hƣởng đến khả năng phản ứng của curcumin. Còn dạng muối kẽm clorid hay kẽm sulfat khó tạo phức với curcumin hơn.
Trong khi đó, phản ứng khử hóa xảy ra dễ dàng hơn trong môi trƣờng acid hydrocloric và acid sulfuric.
Để thực hiện tốt phản ứng khử hóa với kẽm trong môi trƣờng acid hydrocloric, thu đƣợc hiệu suất cao, ít sản phẩm phụ, cần lƣu ý một số vấn đề sau:
Để kiểm soát tốc độ phản ứng và khử hóa chọn lọc trên nhóm alken, lƣợng kẽm nên đƣợc cho vào từ từ thành nhiều đợt trong quá trình phản ứng. Nếu cho kẽm quá nhanh
58
có thể khử luôn nhóm chức ceton, tạo nhiều sản phẩm phụ, làm giảm hiệu suất phản ứng và khó tinh chế sản phẩm.
- Tỷ lệ kẽm so với curcumin cũng ảnh hƣởng nhiều đến phản ứng. Nếu lƣợng kẽm không đủ, phản ứng xảy ra không hoàn toàn, curcumin còn dƣ khó loại bỏ sau phản ứng. Nhƣng nếu lƣợng kẽm dƣ quá nhiều có thể khử luôn nhóm chức ceton, tạo nhiều sản phẩm phụ. Điều này cũng xảy ra nếu thời gian phản ứng kéo dài.
- Nồng độ acid sử dụng cũng có ảnh hƣởng đến phản ứng. Kết quả khảo sát cho thấy, khi sử sụng acid loãng (5%, 10%), hiệu suất phản ứng thấp. Điều này có thể do nồng độ acid loãng, kẽm đƣợc hoạt hóa kém, khả năng khử hóa giảm. Nhƣng nếu sử dụng acid HCl đặc, kẽm đƣợc hoạt hóa mạnh, có thể khử cả nhóm ceton, làm giảm hiệu suất phản ứng tạo THC. Để đảm bảo phản ứng xảy ra tốt, cần duy trì môi trƣờng acid trong suốt quá trình phản ứng.
- Nhóm –OH phenol rất dễ bị oxy hóa bởi oxy trong không khí, do đó cần phải sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình trƣớc khi tiến hành phản ứng.
Phƣơng pháp khử hóa curcumin với tác nhân là kẽm trong môi trƣờng acid hiện nay chƣa có tài liệu nào công bố. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là đơn giản, rẻ tiền, hiệu suất tốt, có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp.
4.3. Về phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp
Tƣơng tự nhƣ phản ứng khử hóa curcuminoid thành phần, phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp là phản ứng không chọn lọc.
Tuy nhiên dựa vào việc khảo sát các điều kiện của phản ứng khử hóa các curcuminoid thành phần, áp dụng vào khử hóa curcuminoid hỗn hợp thì phản ứng khử hóa này đƣợc kiểm soát trở nên khử chọn lọc nhóm alken hơn.
Phản ứng khử hóa với H2/Pd/C:
Khi tỉ lệ xúc tác và thời gian phản ứng đƣợc kiểm soát, thì phản ứng khử hóa xảy ra chọn lọc hơn, không tạo sản phẩm phụ không mong muốn. Sản phẩm thu đƣợc là hỗn hợp 3 thành phần không màu. Tƣơng tự phản ứng có nhƣợc điểm là khí hydro tạo hỗn hợp nổ với không khí ở khoảng nồng độ rất rộng (4,1-74,2%), cần chú ý vấn đề an toàn khi thực hiện phản ứng. Ƣu điểm của phản ứng khử hóa với H2/Pd/C là sản
59
phẩm tƣơng đối sạch, điều kiện khử hóa khá ổn định tuy nhiên phƣơng pháp này khó ứng dụng ở quy mô lớn trong điều kiện của Việt Nam.
Phản ứng khử hóa với Zn/acid:
Tƣơng tự nhƣ phản ứng khử hóa với H2/Pd/C, phản ứng khử hóa curcuminoid hỗn hợp với Zn/acid đƣợc kiểm soát chặt chẽ tỷ lệ kẽm so với curcuminoid, cũng nhƣ lƣợng kẽm cho vào phản ứng từng đợt và thời gian phản ứng, phản ứng xảy ra chọn lọc hơn trên nhóm alken. Sản phẩm thu đƣợc là hỗn hợp 3 thành phần không màu. Phƣơng pháp khử hóa curcuminoid với tác nhân là kẽm trong môi trƣờng acid hiện nay chƣa có tài liệu nào công bố. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là đơn giản, rẻ tiền, hiệu suất tốt, có thể ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp.
4.4. Về xác định cấu trúc
4.4.1. Về cấu trúc của nguyên liệu curcumin I
Trên phổ khối lƣợng (ESI-MS, MeOH) xuất hiện pic phân tử [M+H]+ (m/z = 369,06) và [M+Na]+ (m/z = 391,04), phù hợp với số khối của phân tử chất dự kiến, ứng với khối lƣợng phân tử curcumin (M = 368,38 ; CTPT C21H20O6).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của curcumin có các tín hiệu cho phép nhận biết dạng proton và số lƣợng proton, cụ thể nhƣ sau:
- Tín hiệu singlet tại δ = 3,83 ppm đặc trƣng cho 6 proton của 2 nhóm methoxy (H-8’, H-8’’).
- Hai nhân thơm cho các tín hiệu tại vùng 7,14-7,56 ppm, trong đó quan sát thấy tƣơng tác spin-spin meta và ortho của các proton trên mỗi nhân thơm. Ch ng hạn, H- 5’ tƣơng tác ortho với H-6’ nên cho tín hiệu doublet (d) với hằng số J = 8,0 Hz. Trong khi đó, H-6’ có thêm tƣơng tác meta với H-2’ ngoài tƣơng tác ortho với H-5’ nên có tín hiệu dd với J1=1,5 Hz, J2= 8,0 Hz. H-2’ cho tín hiệu doublet tại 7,31 ppm với hằng số tƣơng tác meta J = 1,5 Hz.
- Các hydro-anken trong phân tử curcumin tồn tại ở dạng trans. Điều này thể
hiện ở hằng số tƣơng tác spin-spin giữa các cặp: H-1 và H-2; H-6 và H-7 là 15,5-16,0 Hz.
60
- Tín hiệu singlet duy nhất tại δ = 9,64 ppm đặc trƣng cho 2 proton của 2 nhóm – OH phenol.
- Tín hiệu singlet tại δ = 6,05 ppm ứng với 1 proton cho thấy: phân tử curcumin