Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu và hóa chất Nguồn gốc
1 Acid acetic Merck
2 Acid hydrocloric Trung Quốc
3 Acid sulfuric Trung Quốc
4 Dicloromethan Trung Quốc
5 Diethyl ether Trung Quốc
6 Ethanol 96% Trung Quốc
7 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc
8 Ethyl acetat Trung Quốc
9 n-Hexan Trung Quốc
10 Kẽm bột Trung Quốc
11 Methanol Trung Quốc
12 Natri carbonat Trung Quốc
13 Natri sulfat Trung Quốc
14 Nƣớc cất Việt Nam
15 Palladium -carbon 5% Sigma-Aldrich
16 Silicagel 60 GF254 Merck
19 2.1.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu
Bảng 2.2. Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu
STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Bản mỏng silicagel GF254 Đức
2 Bình chiết 250 mL Đức
3 Bình cầu 1 cổ, 2 cổ, 3 cổ 50mL, 100mL, 250mL Đức
4 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc
5 Bình sắc ký Trung Quốc
6 Cân kỹ thuật Sartorius P 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sĩ
7 Cốc có mỏ 100mL Đức
8 Cột sắc ký Đức
9 Giấy lọc Việt Nam
10 Đĩa petri Trung Quốc
11 Máy cấy quay chân không Buchi B480 Thụy Sĩ
12 Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt Mỹ
13 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer (Viện Hóa
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ
14
Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1
H-NMR) Bruker AV-500 (Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Mỹ
15 Máy đo phổ khối lƣợng Varian 320 Ms (Viện Hóa học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mỹ
16 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức
17 Máy sấy đèn hồng ngoại Đức
18 Máy sinh khí nitơ Đức
19 Máy sinh khí hydro Đức
20 ng đong 25mL, 50mL, 100mL Trung Quốc
21 ng nghiệm Trung Quốc
20
23 Quả bóp cao su Đức
24 Tủ sấy Memmert Đức
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid.
- Bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ curcuminoid theo sơ đồ sau:
Tiến hành phản ứng khử hóa curcuminoid với hai tác nhân khử khác nhau là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trƣờng acid.
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy.
- Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp đƣợc bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS) và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
- Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm bán tổng hợp đƣợc bằng phƣơng pháp DPPH.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid
- Dùng phương pháp kết tinh phân đoạn
- Dùng sắc ký cột với hệ dung môi thích hợp
2.3.2. Bán tổng hợp hóa học:
Bán tổng hợp tetrahydrocurcuminoid từ curcuminoid bằng phản ứng khử hóa sử dụng các tác nhân khử hóa khác nhau:
- Dùng khí hydro với xúc tác Pd/C 5 %. - Dùng kim loại trong môi trƣờng acid.
21 2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu đƣợc bằng phƣơng pháp SKLM và phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy.
SKLM: Tính giá trị hệ số lƣu giữ Rf
Dung môi hòa tan: ethanol
Hệ dung môi chạy sắc ký: Dicloromethan : Methanol = 20:1
2.3.4. ác định cấu trúc sản phẩm
Phổ hồng ngoại(IR) Phổ khối lƣợng (MS)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), Phổ cộng hƣởng từ carbon (13C- NMR)
2.3.5. Thử tác dụng chống oxy hóa của các chất bán tổng hợp đƣợc
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phƣơng pháp DPPH) đƣợc thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học – Viên hàn lâm khoa học & công nghệ Việt Nam.
22
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TÁCH CÁC CURCUMIN I, II, III TỪ HỖN HỢP CURCUMINOID
Dùng phƣơng pháp tách thích hợp thu đƣợc từng thành phần riêng biệt: Curcumin I, Curcumin II, Curcumin III. Sơ đồ tách đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ tách từng thành phần trong hỗn hợp curcuminoid
Cách tiến hành
Bột curcuminoid có thành phần curcumin I (62,1 %), curcumin II (24,6%), và curcumin III (8,3%) đầu tiên đƣợc kết tinh lại 3 lần trong dung môi thích hợp, các bƣớc thực hiện nhƣ sau:
- Hòa tan hoàn toàn 3,00 g curcuminoid trong 250 ml dung môi ở 60oC, sau đó để kết tinh.
- Tinh thể kết tinh đƣợc lọc hút chân không, rửa, kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết bằng SKLM.
- Dịch lọc kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, cất quay chân không đến kiệt thu sản phẩm thô. Tiếp tục đem kết tinh lại lần 2,3 tƣơng tự nhƣ lần 1.
H A TAN ĐỂ KẾT TINH - Curcuminoid - Dung môi LỌC S C K CỘT Dicloromethan : Methanol (20:1) CURCUMIN II
CURCUMIN I CURCUMIN III
23
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của dung môi dùng kết tinh đến quá trình kết tinh.
Tiến hành khảo sát với 2 dung môi là EtOH 96% và MeOH. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ và thời gian kết tinh đến quá trình kết tinh curcuminoid
STT Dung môi kết tinh Nhiệt độ kết tinh (oC) Thời gian kết tinh (h) KL curcumin I (g) Tonc (oC) 1 MeOH to phòng 24 1,08 182 – 184 2 EtOH 96% to phòng 24 1,02 182 – 184 Nhận xét:
- Với hai dung môi sử dụng là EtOH 96% và MeOH, khi để kết tinh để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24h, tinh thể thu đƣợc là curcumin I với nhiệt độ nóng chảy phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của curcumin I trong các tài liệu đã đƣợc công bố..
- Dung môi sử dụng là MeOH cho khối lƣợng tinh thể curcumin I nhiều hơn, nhƣng không đáng kể, mặt khác MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH 96%.
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH 96% có nhiều ƣu điểm hơn, do đó EtOH 96% đƣợc chọn làm dung môi kết tinh, kết tinh tại nhiệt độ phòng trong 24h.
Sau khi chọn đƣợc các điều kiện kết tinh thích hợp, tiến hành kết tinh 3 lần, lọc, rửa, sấy, cân định lƣợng thu đƣợc tinh thể curcumin I. Kết quả kết tinh đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
24
Bảng 3.2. Kết quả kết tinh curcuminoid 3 lần trong EtOH 96%
Lần kết tinh Vdung môi (ml) KL tinh thể (g) Hiệu suất (%)
1 250 1.02
2 150 0,26
3 50 0,08
Tổng: 1,36 73,12
Nƣớc cái cuối cùng là hỗn hợp curcuminoid ba thành phần, trong đó curcumin II và III đã đƣợc làm giàu, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1 để thu lấy từng curcuminoid từng thành phần.
Các bƣớc tiến hành sắc ký cột:
ƣớc 1: Chuẩn bị
- Cân 100,00 g silicagel, ngâm trong pha động trong khoảng 30 phút.
- Cột rửa sạch, sấy khô, lót đáy cột bằng bông, cố định cột sắc ký song song, th ng góc với trục của giá đỡ.
ƣớc 2: Nhồi cột
- Cho dung môi đến khoảng nửa chiều cao cột, mở van, từ từ nhồi liên tục silicagel vào cột cho đến hết lƣợng silicagel cần nhồi, đồng thời gõ nhẹ để nén các lớp silicagel. Chú ý không để mực dung môi xuống thấp hơn mực silicagel để tránh hiện tƣợng khô cột.
- Đặt một miếng giấy lọc lên trên bề mặt lớp silicagel.
ƣớc 3: Đƣa chất phân tích vào cột
- Hòa tan mẫu vào một lƣợng tối thiểu dung môi pha động.
- Hạ mực dung môi trong cột xuống ngang mực giấy lọc, rồi nạp hết dung dịch chất phân tích vào cột.
ƣớc 4: Triển khai sắc ký cột
- Cho dung môi rửa giải chạy qua cột, hứng các phân đoạn có thể tích khoảng 40 ml.
- Các phân đoạn đƣợc cất quay chân không để loại bớt dung môi, sau đó kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH = 20:1.
25
ƣớc 5: Thu hồi các phân đoạn
- Các phân đoạn có Rf giống nhau đƣợc gộp lại, cất quay chân không, sấy khô và cân định lƣợng.
Kết quả tách đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả tách các curcuminoid thành phần từ hỗn hợp curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1
Phân đoạn Tổng thể tích
(ml) Thành phần Khối lƣợng (g)
1 - 18 720 Curcumin I 0,46
19 - 22 160 Curcumin I, Curcumin II 0,13
23 - 45 880 Curcumin II 0,61
46 - 52 280 Curcumin II, Curcumin III 0,29
53 - 55 120 Curcumin III 0,04
Nhận xét:
- Nƣớc cái thu đƣợc sau khi kết tinh hỗn hợp curcuminoid, đem chạy sắc ký cột, thu đƣợc các curcumin thành phần, trong đó chủ yếu là curcumin I (0,46 g), curcumin II (0,61 g), còn curcumin III thu đƣợc một lƣợng rất nhỏ (0,04 g).
Kiểm tra độ tinh khiết của các curcuminoid thành phần:
Các curcuminoid thành phần sau khi tách, tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254, hệ dung môi khai triển dicloromethan : methanol (20:1). Kết quả cho thấy các chất thử đều cho một vết gọn, rõ, không có vết phụ (Hình 3.1). Trong đó Rf curcumin I = 0,8 ; Rf curcumin II = 0,46 và Rf curcumin III = 0,34.
26
Hình 3.2. SKLM của các curcuminoid thành phần
3.2. KHỬ HÓA TỪNG CURCUMINOID THÀNH PHẦN
Chúng tôi đã thực hiện phản ứng khử hóa với hai tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% và kẽm trong môi trƣờng acid.
3.2.1. Khử hóa curcumin I (curcumin)
3.2.1.1. Phản ứng khử hóa với tác nhân khử là khí hydro có xúc tác Pd/C 5%
Sơ đồ phản ứng: đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân H2/Pd/C
Tiến hành phản ứng:
Hoạt hóa xúc tác: Cho xúc tác Pd/C 5% vào bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml, thêm 20 ml dung môi, khuấy từ ở nhiệt độ khoảng 0-5oC trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng. Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) trong 100 ml dung môi, cho dung dịch thu đƣợc vào bình phản ứng trên. Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, đồng thời sục khí hydro liên tục trong quá
27
trình phản ứng ở áp suất khí quyển. Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp.
Xử lý hỗn hợp phản ứng:
Hỗn hợp phản ứng đem lọc hút chân không để loại bỏ xúc tác. Dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 50oC. Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 20:1. Các bƣớc tiến hành sắc ký cột tƣơng tự nhƣ phần 3.1.
Khảo sát phản ứng:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng, bao gồm dung môi phản ứng và tỷ lệ khối lƣợng xúc tác so với curcumin.
a.Khảo sát dung môi phản ứng
Tiến hành khảo sát với 3 dung môi là MeOH, EtOH tuyệt đối và EtOH 96%. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng bán tổng hơp tetrahydrocurcumin từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C
TT Dung môi phản ứng Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) KL sp (g) Hpƣ (%) T o nc (oC) 1 MeOH 10 0,65 64,33 95.0 – 98,0
2 EtOH tuyệt đối 10 0,62 61,36 95,0 – 98,0
3 EtOH 96% 10 0,59 58,39 95,0 – 98,5
Nhận xét:
- Với cả ba dung môi sử dụng, nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thu đƣợc đều phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm dự kiến (Tonc,THC = 95,0 – 97,0oC [18]).
- Dung môi là EtOH 96% cho hiệu suất phản ứng thấp nhất (58,39%). Khi sử dụng dung môi là EtOH tuyệt đối cho hiệu suất phản ứng cao hơn (61,36%).
- Dung môi là MeOH cho hiệu suất phản ứng cao nhất (64,33%). Tuy nhiên, MeOH lại độc hơn nhiều so với EtOH.
28
Từ các dữ liệu trên cho thấy dung môi EtOH có nhiều ƣu điểm hơn, do đó EtOH tuyệt đối đƣợc chọn làm dung môi cho các phản ứng khảo sát tiếp theo.
b. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng
Sau khi chọn đƣợc dung môi thích hợp cho phản ứng là EtOH tuyệt đối, tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng. Tiến hành khảo sát với các tỷ lệ khối lƣợng xúc tác là 2%, 5%, 8% và 10% so với curcumin .
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ xúc tác đến thời gian và hiệu suất phản ứng bán tổng hợp THC từ curcumin với tác nhân khử là H2/Pd/C
TT KL curcumin (g) KL xt (g) Tỷ lệ KL xt/curcumin (%) tpƣ (h) KL sp(g) Hpƣ (%) T o nc (oC) 1 1,00 0,02 2 24 0,57 56,41 95,0–98,0 2 1,00 0,05 5 18 0,66 65,32 95,0–98,0 3 1,00 0,08 8 15 0,63 62,35 96,0–98,5 4 1,00 0,10 10 12 0,62 61,36 96,0–98,0 Nhận xét:
- Nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm thu đƣợc từ các thí nghiệm khảo sát các tỷ lệ xúc tác khác nhau không có sự chênh lệch đáng kể.
- Khi tăng tỷ lệ xúc tác thì thời gian phản ứng giảm, hiệu suất phản ứng cũng thay đổi. Với tỷ lệ xúc tác là 2%, thời gian phản ứng là 24h, hiệu suất phản ứng là thấp nhất (56,41%). Hiệu suất phản ứng đạt đƣợc cao nhất là 65,32% khi tỷ lệ xúc tác là 5%, thời gian phản ứng là 18h. Tiếp tục tăng tỷ lệ xúc tác thì hiệu suất phản ứng giảm.
Từ các dữ liệu trên, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ xúc tác là 5%, với thời gian phản ứng là 18h.
Từ các kết quả khảo sát trên đã thấy rằng, điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân là khí hydro có xúc tác Pd/C 5% là:
- Dung môi: Ethanol tuyệt đối - Tỷ lệ khối lƣợng xt/curcumin: 5%
29
- Thời gian phản ứng: 18h.
3.2.1.2. Phản ứng khử hóa với tác nhân kẽm trong môi trường acid
Sơ đổ phản ứng: đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ phản ứng khử hóa curcumin với tác nhân Zn/H+
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 1,00 g curcumin (2,71 mmol) vào 100 ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu ba cổ đáy tròn dung tích 250 ml. Sục nitơ để đuổi hết không khí trong bình phản ứng, thêm acid vào bình phản ứng.
Cân bột kẽm, thêm từ từ vào hỗn hợp phản ứng thành nhiều đợt trong thời gian khoảng 30 phút. Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, duy trì pH acid trong suốt quá trình phản ứng. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat: n- hexan = 7:3 để xác định thời gian phản ứng thích hợp, so sánh với THC tinh khiết thu đƣợc ở phản ứng khử hóa với tác nhân H2/Pd/C.
Xử lý hỗn hợp phản ứng - Lọc loại chất rắn, thu dịch lọc.
- Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH trung tính, lọc loại tủa.
- Dịch lọc đem cất loại bớt một phần dung môi, sau đó đem chiết với dicloromethan: Lần 1 chiết với 30ml dicloromethan, thêm 20ml nƣớc cất. Lần 2 và 3, mỗi lần 30ml dicloromethan.
- Lớp dung môi hữu cơ đƣợc gộp lại, thêm 5,00g Na2SO4 khan, lắc đều, để yên khoảng 1h để loại nƣớc. Sau đó lọc, dịch lọc đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40oC.
30
- Tinh chế sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexan: ethyl acetat thay đổi từ 50:0 đến 1:1. Cách tiến hành sắc ký cột tƣơng tự nhƣ đã trình bày ở mục 3.1.
Khảo sát phản ứng
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng, bao gồm acid phản ứng, nồng độ acid và tỷ lệ mol Zn/curcumin.
a. Khảo sát acid
Tiến hành khảo sát với 3 acid là: acid acetic băng, acid hydrocloric 20% và acid sulfuric 10%.
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trong bảng 3.6.