Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng immunoglobulin g trong sữa và sản phẩm sữa bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH CẢNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH CẢNH MÃ SINH VIÊN: 1301033 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiên: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, xin gửi lời cảm ơn đến TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan, người tận tình dìu dắt trình nghiên cứu khoa học, trực tiếp bảo, hướng dẫn tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị khoa Độc học dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt TS Trần Cao Sơn chị Nguyễn Thị Minh Hòa, giải đáp thắc mắc, nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình làm việc Viện Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, đặc biệt TS Đặng Thị Ngọc Lan giúp đỡ, quan tâm, tạo điều kiên thuận lợi cho tơi hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp Tôi gửi lời cảm ơn thầy Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo tồn thể thầy môn dạy giúp đỡ suốt thời gian học tập năm trường Đại học Dược Hà Nội Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình tơi ln bênh cạnh ủng hộ, động viên để tơi hồn thành khóa luận cách tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Lê Đình Cảnh i MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi ĐẶT VẤN ĐỀ - CHƯƠNG TỔNG QUAN - 1.1 Tổng quan Immunoglobulin G - 1.1.1 Giới thiệu tính chất chức Immunoglobulin G - 1.1.2 Cấu trúc immunoglobulin G - 1.1.4 Nguồn cung cấp IgG từ sữa thành phẩm từ sữa - 1.2 Các phương pháp định lượng IgG - 1.2.1 Kỹ thuật phân tích dựa vào tương tác miễn dịch - 1.2.2 Kỹ thuật định lượng dựa vào phương pháp tách - 1.3 Tổng quan sắc ký lực sắc ký lỏng hiệu cao - 1.3.1 Khái niệm - 1.3.2 Nguyên tắc - 1.3.3 Pha tĩnh sắc ký lực sắc ký lỏng hiệu cao - 10 1.3.4 Pha động sắc ký lực sắc ký lỏng hiệu cao - 13 1.3.5 Một số nghiên cứu định lượng immunoglobulin G - 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 15 2.1 Đối tượng - 15 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị - 15 2.2.1 Thiết bị - 15 2.2.2 Dụng cụ - 15 2.2.3 Hóa chất, chất chuẩn - 15 2.3 Nội dung nghiên cứu - 16 2.3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định IgG sữa sản phẩm sữa - 16 2.3.2 Thẩm định phương pháp xác định IgG sắc ký lỏng - 16 2.3.3 Sơ đánh giá hàm lượng IgG sữa thành phẩm từ sữa thị trường Việt Nam - 16 ii 2.4 Phương pháp nghiên cứu - 16 2.4.1 Pha dung dịch chuẩn - 17 2.4.2 Pha dung dịch đệm - 17 2.4.3 Quy trình xử lý mẫu - 18 2.4.4 Phương pháp phân tích máy sắc ký lỏng hiệu cao - 18 2.4.5 Thẩm định phương pháp [2] - 19 2.4.6 Phương pháp xử lý kết - 20 2.4.7 Phương pháp lấy mẫu - 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN - 21 3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định IgG sữa sản phẩm sữa - 21 3.1.1 Khảo sát điều kiện xác định IgG thiết bị HPLC - 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu - 25 3.2 Thẩm định phương pháp xác định IgG sắc ký lỏng - 28 3.2.1 Độ đặc hiệu - 28 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) - 29 3.2.3 Khoảng tuyến tính - 31 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi - 32 3.2.5 Độ lặp lại khác ngày - 33 3.3 Sơ đánh giá hàm lượng IgG sữa thành phẩm từ sữa thị trường Việt Nam - 34 3.4 Bàn luận - 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 39 PHỤ LỤC - 42 - iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AOAC Giải nghĩa Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội cộng đồng phân tích thức) IgG Immunoglobulin G Igs Immunoglobulin Fab Fragment antigen binding (Phần nhận biết kháng nguyên) Fc Fragment crystalizable (Phần dễ kết tinh) HPLC RID ELISA High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Radial imminodifusion (Miễn dịch khuếch tán) Enzyme Linked Immunosorbent Assay- (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) SEC Size-exclusion chromatography (Sắc ký rây phân tử) SPR Surface plasmon resonance (Cổng hưởng plasmon bề mặt) AC Affinity chromatography (Sắc ký lực) Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE (Điện di polyacrylamide với SDS) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Qualification (Giới hạn định lượng) DAD Diode-array detectors ( Detector mảng diod) iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.Chức thứ lớp IgG - Bảng 1.2 Hàm lượng phân lớp IgG - Bảng 1.3 Khả liên kết protein với kháng thể - 12 Bảng 1.4: Một số nghiên cứu định lượng IgG - 13 Bảng 2.1 Khối lượng cân chất chuẩn gốc IgG (10mg/g) - 17 Bảng 3.1 Khảo sát khối lượng cân mẫu - 27 Bảng 3.2: Tỉ lệ S/N nồng độ LOD 0,01 mg/g - 30 Bảng 3.3 Độ chệch nồng độ chuẩn - 31 Bảng 3.4 Độ lặp lại độ thu hồi - 33 Bảng 3.5 Độ lặp lại khác ngày - 34 Bảng 3.6 Kết định lượng mẫu thực - 35 - v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo IgG - Hình 1.2 Phương pháp plasmon bề mặt - Hình 1.3 Quá trình sắc ký lực - 10 Hình 1.4 Protein G gắn Sepharose - 11 Hình 3.1 Khảo sát pH dung dịch nạp - 22 Hình 3.2 Thể tích nạp - 23 Hình 3.3 Khảo sát pH rửa - 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ rửa lại khảo sát pH =3 - 24 Hình 3.5 Khảo sát thể tích rửa - 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ thể tính đặc hiệu - 28 Hình 3.7 Phổ hấp thụ IgG nghiên cứu - 29 Hình 3.8 Phổ hấp thụ IgG - 29 Hình 3.9 Phổ hấp thụ nồng độ 0,5mg/g - 29 Hình 3.10 Phổ hấp thụ nồng độ 1mg/g - 29 Hình 3.11 Sắc ký đồ nồng độ LOD 0,01 mg/g - 30 Hình 3.12 Đồ thị khảo sát tuyến tính - 32 - vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong sống đại ngày nay, sữa sản phẩm sữa ngày trở nên thiết yếu giúp nâng cao bảo vệ sức khỏe Các sản phẩm gồm yếu tố tăng trưởng, immunoglobulin, lactoperoxidase, lactoferrin, cytokine, nucleotid, vitamin, … [21-28] Trong đó, immunoglobulin (Igs) mà chiếm đa số imunoglobulin G có nguồn chủ yếu từ sữa loài động vật nhai lại [16] có vai trò giúp thể tăng sức đề kháng Việc sử dụng sản phẩm sữa có hàm lượng IgG cao xu hướng người tiêu dùng Hiện nay, Việt Nam chưa có tiêu chuẩn hàm lượng IgG sữa sản phẩm sữa quan kiểm tra tiến tới xây dựng tiêu chuẩn chung Vấn đề đặt phương pháp định lượng IgG phù hợp để xây dựng tiêu chuẩn Các phương pháp định lượng IgG phát triển từ lâu, để phù hợp với hàm lượng IgG sữa vấn đề khó khăn IgG kháng thể nên cần phải sử dụng phương pháp đặc hiệu Chúng dễ bị biến tính điều kiện nhiệt độ, bảo quản q trình sản xuất, với bất cập mặt kinh tế, thời gian, hay quy mô tiến hành Việc sử dụng phương pháp sắc ký để định lượng IgG sữa sản phẩm sữa có tiềm giải khó khăn Xuất phát từ nhu cầu xây dựng đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG sữa sản phẩm sữa sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp thẩm định phương pháp định lượng IgG sữa sản phẩm sữa Áp dụng phương pháp định lượng hàm lượng số mẫu sữa thị trường -1- CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Immunoglobulin G 1.1.1 Giới thiệu tính chất chức Immunoglobulin G Immunoglobulin G (IgG) số kháng thể thể người động vật IgG chiếm khoảng 80% tổng lượng kháng thể IgG chủ yếu xuất huyết thanh, chiếm 75% tất Igs huyết IgG có chủ yếu khoang ngồi mạch máu, lớp Igs có khả qua thai, việc miễn dịch đảm bảo truyền từ mẹ sang Chức quan trọng IgG giúp thể miễn dịch, thơng qua q trình hoạt hóa bổ thể Chức khác IgG khả gắn tế bào đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu đa nhân trung tính số tế bào lympho có thụ thể Fc cho vùng Fc IgG, giúp tế bào tiếp nhận kháng nguyên tốt Chức phân lớp IgG thể Bảng 1.1 Bảng 1.1.Chức thứ lớp IgG Các Khả phân Tỷ Khả năng qua TT lớp lệ hoạt hóa % bổ thể thai IgG Khả gắn thụ thể Fc tế bào thực bào Thời gian bán hủy [12] IgG1 66 Có Cao thứ nhì Ái lực cao 21 ngày IgG2 23 Không Cao thứ ba Ái lực thấp 21 ngày IgG3 Có Cao Ái lực cao ngày IgG4 Có Khơng Ái lực trung bình 21 ngày -2- Bảng 3.6 Kết định lượng mẫu thực STT Tên mã hóa Thời gian lưu (phút) Diện tích pick (µV.sec) Nồng độ dịch Hàm lượng (mg/100g) (mg/g) 1841 11,834 8523709 0,629 315 1836 11,838 2453922 0,185 92,5 1816 11,828 14359106 1,056 528 1818 11,822 1942024 0,147 73,5 1807 11,825 2541828 0,191 95,5 1856 11,817 4812110 0,357 179 1817 11,818 5965975 0,442 221 1839 11,824 2778931 0,208 104 1843 11,834 2584163 0,194 97,0 10 1813 11,835 496998 0,041 20,5 11 1815 11,849 492138 0,041 20,5 12 929 11,822 6940576 0,513 257 13 930 11,822 7013406 0,518 259 14 1851 11,839 472097 0,040 20,0 15 932 11,826 3228053 0,241 121 16 926 11,827 1521517 0,116 58,0 17 1003 11,832 1367894 0,105 52,5 - 35 - Nhận xét: Phương pháp định lượng phù hợp với hàm lượng IgG sản phẩm sữa lưu hành thị trường Cho thấy hàm lượng IgG sản phẩm có khác cao, thay đổi từ vài chục tới vài trăm mg/ 100 g Đây bước cải tiến trình kiểm nghiệm sản phẩm sữa Khả kiểm nghiệm nhanh chóng, quy trình mở rộng để thực đồng thời nhiều mẫu thực, tiết kiệm thời gian cho đơn vị kiểm nghiệm 3.4 Bàn luận Về đặc hiệu cho thấy ưu việt phương pháp cột sử dụng đặc hiệu IgG, pic xuất thời gian rửa giải có IgG, loại bỏ hoàn toàn nhiễu từ thành phần protein khác Sự ổn định phương pháp qua việc khảo sát thay đổi điều kiện sắc ký Về định lượng thẩm định phương pháp cho thấy phù hợp với tiêu chuẩn AOAC Khoảng làm việc 0,03 -5 mg/g dịch phù hợp với mẫu cần phân tích Về quy trình xử lý mẫu cho thấy tối ưu cho việc tiết kiệm hóa chất, thời gian đơn giản hóa q trình so với phương pháp khác Chỉ cần ly tâm tủa casein có dịch để phân tích Q trình phân tích sử dụng thiết bị HPLC, nên việc chạy hàng loạt mẫu có khả thi so với phương pháp miễn dich Elisa truyền thống Về mặt kinh tế, cột Hitrap Protein G sử dụng rộng thương mại hóa, nên giá thành khơng q cao Hơn cột có tuổi thọ lên tới vài chục lần tiêm mẫu nên tiết kiệm nhiều so với phương pháp miễn dịch Elisa ứng dụng rộng rãi Mặc dù kết định phù hợp với mẫu thực thu thập chưa so sánh với phương phổ biến Elisa, nên có tiêu chuẩn chung so sánh kết định lượng hai phương pháp - 36 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận ❖ Đã xây dựng phương pháp định lượng IgG sữa sản phẩm từ sữa, với điều kiện sau: Điều kiện xử lý mẫu: - Sử dung dịch NaCl 0,15M làm dung mơi hòa tan sữa - Sử dụng dung dịch CH3COONa có pH = 2,95 làm dung dịch tủa casein - Mẫu ly tâm 6000 vòng / phút, 00C phút - Khối lượng cân mẫu phù hợp khoảng g với tỉ lệ pha loãng lần Điều kiện phân tích HPLC: - Cột Hitrap protein G 1ml, nhiệt độ cột 30 0C - Lựa chon dung dịch đêm nạp Na2HPO4 50mM có pH = có thêm NaCl 0,3M để tránh kết tụ ảnh hưởng protein khác, thể tích dung dịch đệm nạp ml - Lựa chọn dung dịch đệm rửa Glycine 50mM có pH = 2,5 thể tích rửa mL - Thể tích tiêm mẫu 100µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút - Bước sóng phát λ = 277,4 nm Đã thẩm định phương pháp định lương IgG sữa sản phẩm sữa HPLC với kết sau - Phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu đáp ứng yêu cầu - Giới hạn phát 0,01mg/g Giới hạn định lượng 0,03mg/g - Khoảng tuyến tính phương pháp 0,03 mg/g - 5mg/g - Độ lặp lại phương pháp tốt với độ lệch chuẩn tương đối < 3,7% - Độ thu hồi đạt từ 95% đến 107% đáp ứng yêu cầu theo AOAC - Độ tái lặp khác ngày 2,39% đáp ứng với yêu cầu AOAC ≤ 5,6% ❖ Đã áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng 17 mẫu sữa thị trường Từ kết cho thấy phương pháp phù hợp để xác định hàm lượng IgG sữa sản phẩm sữa - 37 - Kiến nghị Áp dụng phương pháp để mở rộng định lượng cho mẫu thực với số lượng lớn không mẫu từ sữa bò, mà sản phẩm từ sữa khác sữa dê, sữa cừu - 38 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất y học, Hà Nội.tr 123-300 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.tr 10 - 59 Tiếng anh Abernethy G, Otter D, Arnold K, Austad J, Christiansen S, Ferreira I, Irvine F, Marsh C, Massom LR, Otter D, Pearce K, Stevens J, Szpylka J, Vyas P, Woollard D, Wu C (2010), “Determination of Immunoglobulin G in Bovine Colostrum and Milk Powders, and in Dietary Supplements of Bovine Origin by Protein G Affinity Liquid Chromatography: Collaborative Study”, Journal of AOAC International 93, pp.622627 Akita EM, Li-Chan ECY (1998), “Isolation of Bovine Immunoglobulin G Subclasses from Milk, Colostrum, and Whey Using Immobilized Egg Yolk Antibodies”, Journal of Dairy Science 81, pp.54-63 Alastair Aitken, Michèle P Learmonth (1996), The Protein Protocols Handbook, Humana Press, New Jersey.pp.753-755 Andrews AT, Taylor MD, Owen AJ (1985), “Rapid analysis of bovine milk proteins by fast protein liquid chromatography”, Journal of Chromatography A 348, pp.177-185 Blakeslee.D, Rapacz.J, Butler.J.E.(1971), “Bovine immunoglobulin allotypes”, Journal of Dairy Science 54, pp.1319-1320 Butler J.E., Winter A.J., Wagner.G.G (1971), “Symposium: Bovine Immune System”, Journal of Dairy Science 54, pp.1309-1340 David E.J Copestake, Harvey E Indyk, Don E Otter (2006), “Affinity Liquid Chromatography Method for the Quantification of Immunoglobulin G in Bovine Colostrum Powders”, Journal of AOAC International 86, pp.1249-1256 - 39 - 10 Didier Levieux1, Annie Levieux, Halima El-Hatmi, Jean-Paul Rigaudie`re (2006), “Immunochemical quantification of heat denaturation of camel (Camelus dromedarius) whey proteins”, Journal of Dairy Research 73, pp.1-9 11 Dominguez E, Perez MD, Puyol P, Sanchez L, Calvo M (2001), “Effect of pH on antigen-binding activity of IgG from bovine colostrum upon heating”, Journal of Dairy Research 68, pp.511-518 12 Francisco A Bonilla (2008), “Pharmacokinetics of Immunoglobulin Administered via Intravenous or Subcutaneous Routes”, Immunology and Allergy Clinics of North America 28, pp.803–819 13 Falk Nimmerjahn, Jeffrey V Ravetch (2007), “FC-receptors are regulators of Immunity”, Advances in Immunology 96, pp.179-204 14 S L Gelsinger, A M Smith, C M Jones, A J Heinrichs (2015), “Technical note: Comparison of radial immunodiffusion and ELISA for quantification of bovine immunoglobulin G in colostrum and plasma”, Journal of Dairy Science 98, pp 1-6 15 GE Healthcare (2007), Affinity Chromatography Principles and Methods pp.1-154 16 Hannu Korhonen1, P Marnila and H S Gill (2000), “Milk immunoglobulins and complement factors”, British Journal of Nutrition 84, pp.75-80 17 Indyk HE, Filonzi EL, Gapper LW (2006), “Determination of minor proteins of bovine milk and colostrum by optical biosensor analysis’, Journal of AOAC International 89, pp.898 -902 18 Leyton W Gapper, David E J Copestake, Don E Otter, Harvey E Indyk, (2007), “Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements: A review”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 389, pp.93-109 19 Louise E Bennett, William N Charman, Desmond B Williams, Susan A Charman (1994), “Analysis of bovine immuglobulin G by capillary gel electrophoreis”, Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis 12, pp 1103-1108 20 Marjeta Urh, Dan Simpson, Kate Zhao (2009), “Affinity Chromatography: General Methods”, Methods in Enzymology 463, pp.417-438 - 40 - 21 Michaelidou A, Steijns J (2006), “Nutritional and technological aspects of minor bioactive components in milk and whey: Growth factors, vitamins and nucleotides”, International Dairy Journal 16, pp.1421–1426 22 Merin U, Bernstein S, van Creveld C, Yagil R, Gollop N (2001), “Camel (Camelus dromedarius) colostrum and milk composition during the lactation”, Milchwissenschaft 56, pp.70-74 23 Mian bin Wul, Yin-jun Xu (2009), “Isolation and Purification of Lactoferrin and Immunoglobulin G from Bovine Colostrum with Serial Cation-Anion Exchange Chromatography”, Biotechnology and Bioprocess Engineering 14, pp.155-160 24 Normansell DE (1987), “Human immunoglobulin subclasses”, Diagnostic and Clinical Immunology 5, pp.115-128 25 Sameh Magdeldin, Annette Moser (2012), “Affinity Chromatography: Principles and Applications”, In Tech, USA.pp.3-28 26 G C Schild, Michele Henry-Aymard, H G Pereira (1972), “A Quantitative, SingleRadial-Diffusion Test for Immunological Studies with Influenza Virus”, Journal of General Virology 16, pp.231-236 27 Shimadzu, Introduction to HPLC, LC World Talk Special Issue Volume 1, Japan, pp.128 28 Sindayikengera Séverin, Xia Wenshui (2005), “Milk Biologically Active Components as Nutraceuticals: Review”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition 45, pp.645– 656 29 Robert Karlsson, Lars Fägerstam, Helena Nilshans, Björn Persson (1993), “Analysis of active antibody concentration Separation of affinity and concentration parameters”, Journal of Immunological Methods 166, pp.75-84 30 Zafar Rasheed (2008), “Hydroxyl radical damaged Immunoglobulin G in patients with rheumatoid arthritis: Biochemical and immunological studies”, Clinical biochemistry 41, pp.663-669 - 41 - PHỤ LỤC 1.Khảo sát pH dung dịch đệm nạp pH dung dịch nạp=6 pH dung dịch nạp=7 pH dung dịch nạp=8 pH dung dịch nạp=9 - 42 - Khảo sát thể tích dung dịch nạp Thể tích nạp = 2ml Thể tích nạp = 3ml Thể tích nạp = 4ml Thể tích nạp = 5ml - 43 - 3.Khảo sát pH dung dịch đệm rửa pH dung dịch rửa = 2.5 pH dung dịch rửa = pH dung dịch rửa = - 44 - 4.Khảo sát thể tích dung dịch đệm nạp Thể thích rửa =5 ml Thể thích rửa =6 ml - 45 - Thể thích rửa =7 ml Thể thích rửa =8 ml Mẫu thực 1841 1836 - 46 - 1816 1818 1807 1856 1817 1839 1843 1813 - 47 - 1815 930 929 1851 932 926 1003 - 48 - 6.Thông số chất chuẩn - 49 - ... tài: Nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng IgG sữa sản phẩm sữa sắc ký lỏng hiệu cao với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp thẩm định phương pháp định lượng IgG sữa sản phẩm sữa Áp dụng phương. .. tổng quan sắc ký lực cột Protein G, nên nghiên cứu lựa chọn làm phương pháp định lượng IgG sữa sản phẩm sữa - 14 - CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu phương. .. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐÌNH CẢNH MÃ SINH VIÊN: 1301033 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IMMUNOGLOBULIN G TRONG SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP