XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ MINH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ MINH HẢI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG COIXOL TRONG CAM THẢO ĐẤT (SCOPARIA DULCIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phương Thiện Thương PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài Luận văn thạc sĩ cách hồn chỉnh, hướng dẫn nhiệt tình quý Thầy Cô, động viên ủng hộ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian học tập nghiên cứu nguồn động lực lớn lao quý giá Đầu tiên, xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phương Thiện Thương PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hoàn thành Luận văn Đặc biệt, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Nguyễn Thị Hà Ly động viên, nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể quý Thầy Cô Trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt q Thầy Cơ Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, tận tình truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo anh chị cán Viện Dược liệu không ngừng hỗ trợ thiết bị tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian nghiên cứu thực Luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn anh chị em động viên, hỗ trợ cho nhiều suốt trình học tập thực đề tài Mặc dù có nhiều cố gắng suốt q trình thực đề tài, song có mặt hạn chế, thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp dẫn thầy cô giáo anh chị đồng nghiệp Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2019 Phạm Thị Minh Hải MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cam thảo đất 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố, thu hái, chế biến 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng công dụng cam thảo đất 1.2 Tổng quan hoạt chất Coixol 1.2.1 Tính chất 1.2.2 Tác dụng sinh học coixol 1.3 Các nghiên cứu định lượng coixol công bố: .7 1.4 Tổng quan sắc kí lỏng hiệu cao 10 1.4.1 Khái niệm 10 1.4.2 Nguyên tắc 10 1.4.3 Cấu tạo máy HPLC 10 1.4.4 Một số đại lượng dùng sắc ký 11 1.4.5 Ứng dụng HPLC [2] 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 17 2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 17 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Thu thập mẫu 18 2.2.2 Xử lý mẫu 20 2.2.3 Phương pháp định tính, định lượng coixol HPLC 21 2.2.5 Thẩm định quy trình phân tích xây dựng 21 2.3 Ứng dụng 23 2.4 Phương pháp xử lý số liệu .23 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .25 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 25 3.1.1 Xây dựng phương pháp định tính coixol HPLC 25 3.1.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu: 29 3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 35 3.2 Ứng dụng 43 3.2.1 Định tính coixol số mẫu cam thảo đất 43 3.2.2 Định lượng coixol số mẫu cam thảo đất vùng khác 44 Chương BÀN LUẬN 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh tên khoa học Tiếng việt AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa phân tích thống HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao AR Analytical reagent Thuốc thử phân tích LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol ACN Acetonitril PA Pure analysis Tinh khiết phân tích RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối T Tailing Factor Hệ số đối xứng Rs Resolution Độ phân giải N Theoretical Plate Số đĩa lý thuyết DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng Coixol công bố Bảng 2.1 Lý lịch mẫu cam thảo đất thu vùng 18 Bảng 3.1 Kết khảo sát nhiệt độ cột 27 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết (n=3) 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát thể tích dung mơi chiết (n=3) 32 Bảng 3.4 Điều kiện chiết xuất theo thời gian 33 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống 36 Bảng 3.6 Kết phân tích độ lặp lại ngày độ lặp lại khác ngày 39 Bảng 3.7 Kết hàm lượng mẫu dược liệu 40 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ phương pháp 41 Bảng 3.9 Kết khảo sát định tính coixol 43 Bảng 3.10 Kết định lượng coixol mẫu cam thảo đất (toàn cây) vùng 44 Bảng 3.11 Kết định lượng coixol phận dùng khác cam thảo đất 47 Bảng 3.12 Bảng kết đánh giá thống kê hàm lượng coixol phận khác cam thảo đất 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cam thảo đất Scoparia dulcis L Hình 1.2: Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu cao 10 Hình 1.3 Sơ đồ phân tích định tính 13 Hình 1.4 Chuẩn hố điểm 15 Hình 1.5 Đường chuẩn nhiều điểm xác định chất phân tích 15 Hình 3.1 Phổ UV – VIS coixol 25 Hình 3.2 Kết khảo sát dung môi pha động 26 Hình 3.3 So sánh sắc ký đồ coixol nhiệt độ cột 27 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh dung môi chiết coixol cam thao đất 29 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết coixol cam thảo đất phương pháp chiết siêu âm 30 Hình 3.6 Kết khảo sát thời gian chiết coixol cam thảo đất phương pháp chiết hồi lưu 31 Hình 3.7 Kết khảo sát số lần chiết 33 Hình 3.8 Quy trình xử lý mẫu coixol cam thao đất cho phân tích 34 Hình 3.9 SKĐ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp 35 Hình 3.10 Đồ thi biểu mối quan hệ C A coixol 37 Hình 3.11 Sắc ký đồ xác định LOD 38 Hình 3.12 So sánh SKĐ mẫu thực với SKĐ chất chuẩn 43 Hình 3.13 So sánh hàm lượng coixol cam thảo đất theo thời gian 46 Hình 3.14 Biểu đồ so sánh hàm lượng coixol phận khác cam thảo đất 48 Hình 3.15 Sắc ký đồ định lượng coixol phận dùng khác mẫu CTD - 13 49 Hình 4.1 Hàm lượng coixol khu vực Hà Nội theo thời gian 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia nằm khu vực khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, có nhiều điều kiện thuận lợi cho phát triển đa dạng phong phú dược liệu có nguồn gốc từ thực vật Tuy nhiên, nhiều thuốc sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa nghiên cứu cách đầy đủ Vì việc nghiên cứu thuốc có vai trò quan trọng việc phòng điều trị bệnh Cam thảo đất (Scoparia dulcis L) thông dụng nước nhiệt đới Ở nước ta mọc khắp nơi từ Bắc vào Nam, thường gặp vùng đất hoang, ven đường, bờ sông… Cam thảo đất có tác dụng giải độc say sắn [7], rong kinh, ban chẩn, phế nhiệt gây ho, viêm họng, tiêu chảy, thấp cước khí, rơm sởi trẻ em, chàm (thấp chẩn) [5], làm thuốc giảm đau chống viêm [16] Trong cam thảo đất chứa nhiều hoạt chất amellin, coixol, mannitol, glucose…Một hoạt chất quan trọng coixol, có tác dụng thuốc giãn chống co giật [17], ức chế vân, ức chế tim ếch lập, làm biên độ co bóp giảm, nhịp đập chậm lại, thí nghiệm thỏ đường tiêm tĩnh mạch huyết áp hạ thời gian ngắn, mặt khác coixol có tác dụng làm hạ đường huyết nhẹ [3, 4, 6, 21, 22] Ngoài coixol ảnh hưởng đến việc sản xuất tiết chất nhầy, cách tác động trực tiếp lên tế bào biểu mơ đường dẫn khí [18] Cam thảo đất xây dựng thành chuyên luận DĐVN V, nhiên đề cập đến tiêu định tính mà chưa có đề cập đến phương pháp định lượng hoạt chất Để góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu cam thảo đất, tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định tính định lượng coixol cam thảo đất phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Với mục tiêu: Xây dựng phương pháp định tính định lượng coixol cam thảo đất phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng coixol mẫu cam thảo đất thu thập địa phương khác để bước đầu đưa giới hạn hàm lượng coixol dược liệu Hình PL 3.1: Mẫu cam thảo đất thu thập tươi Hình PL 3.2: Một số mẫu cam thảo đất thu thập phơi khơ Hình PL 3.3: Bột tồn cam thảo đất Hình PL 3.4: Bột rễ dược liệu cam thảo đất Phụ lục 4: Sắc ký đồ mẫu thực 29/03/2019 17:04:1 / === Shimadzu LCsolution Analysis Report==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-02-2-10ul.lcd : Admin : CTD-02-2 : CTD-02-2 :1 :10 : 10 uL : CTD-02-2-10ul.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : 20190314.lcb : Default.lcr : 15/03/2019 05:13:53 : 19/03/2019 13:04:24 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-02-2-10ul.lcd mV -10 -20 -30 10 Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.378 Area 106268 106268 15 20 25 30 PeakTable Height 4003 4003 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-02-2-10ul-Re.lcd 29/03/2019 16:38:51 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-04-1-10ul-CTD.lcd Acquired by : Admin Sample Name : CTD-04-1 Sample ID : CTD-04-1 Tray# Vail # 29 Injection Volume : 10 uL Data File Name : CTD-04-1-10ul.lcd Method File Name : Camthaodat-coixol.lcm Batch File Name : 20190315.lcb Report File Name : Default.lcr Data Acquired : 16/03/2019 02:39:34 Data Processed : 19/03/2019 13:05:51 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-04-1-10ul-CTD.lcd mV -10 161708 -20 -30 -40 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.301 Area 161708 161708 Height 9274 9274 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-04-1-10ul-CTD.lcd 29/03/2019 16:49:1 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-08-1-10ul-001.lcd : Admin : CTD-08-1 : CTD-08-1 : 10 uL : CTD-08-1-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : 20190311.lcb : Default.lcr : 12/03/2019 01:10:28 : 19/03/2019 13:33:33 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-08-1-10ul-001.lcd mV -140 -150 -160 8.403 -170 -180 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Ret Time Area 8.403 144243 Total 144243 Height 5260 5260 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-08-1-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:39:25 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Na me Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD -13 -2-10ul- RE.lcd : Admin : CTD -13-2- RE : CTD -13-2- RE :1 : 26 : 10 uL : CTD -13 -2-10ul- RE.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : 20190315.lcb : Default.lcr : 15/03/2019 23:08:08 : 19/03/2019 13:05:05 mV C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD -13 -2-10ul- RE.lcd Detector A Channel -10 -20 -30 -40 10 15 20 25 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Ret Time Area 8.302 99650 Total 99650 Height 2901 2901 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 30 29/03/2019 17:01:1 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-13-10ul-001.lcd : Admin : CTD-13 : CTD-13 :1 : 51 : 10 uL : CTD-13-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : Batc.lcb : Default.lcr : 11/01/2019 20:24:32 : 29/03/2019 17:00:50 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-13-10ul-001.lcd 8.260 mV 30 25 20 15 10 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.260 Area 218612 218612 Tailing Factor 1.365 Resolution Theoretical Plate# 0.000 6894.278 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-13-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:59:281 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD17-1-10ul-001.lcd : Admin : CTD-17-1 : CTD-17-1 46 : 10 uL : CTD-17-1-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : Batc.lcb : Default.lcr : 11/01/2019 15:22:17 : 19/03/2019 13:48:28 Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-17-1-10ul-001.lcd mV Detector A Channel 125 100 75 50 25 0 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.371 Area 187749 187749 Height 13481 13481 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-17-1-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:40:1 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-20-1-10ul-Re.lcd : Admin : CTD-20-1- Re : CTD-20-1- Re 10 : 10 uL : CTD-20-10ul-Re.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : 20190314.lcb : Default.lcr : 15/03/2019 05:13:53 : 19/03/2019 13:04:24 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-20-1-10ul-Re.lcd mV -10 83224 -20 -30 10 15 20 25 30 Min PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.378 Area 83224 83224 Height 4003 4003 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-20-1-10ul-Re.lcd 29/03/2019 16:59:281 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-20-1-10ul-001.lcd : Admin : CTD-20-1 : CTD-20-1 47 : 10 uL : CTD-20-1-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : Batc.lcb : Default.lcr : 11/01/2019 15:23:19 : 19/03/2019 13:48:28 Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-20-1-10ul-001.lcd mV Detector A Channel 125 100 75 50 25 0 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.351 Area 182026 182026 Height 13521 13521 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-20-1-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:53:501 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-30-1-10ul-001.lcd : Admin : CTD-30-1 : CTD-30-1 55 : 10 uL : CTD-30-1-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : Batc.lcb : Default.lcr : 12/01/2019 00:26:21 : 19/03/2019 13:45:27 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-30-1-10ul-001.lcd mV Detector A Channel 125 100 75 50 25 0 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Ret Time Area 8.182 168164 Total 168164 Height 19763 19763 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-30-1-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:48:1 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-38-2-10ul-001.lcd : Admin : CTD-38-2 : CTD-38-2 10 : 10 uL : CTD-38-2-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : 20190311.lcb : Default.lcr : 12/03/2019 02:20:56 : 19/03/2019 13:36:11 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-38-2-10ul-001.lcd mV -140 -150 -160 8.403 -170 -180 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Ret Time Area 8.403 143416 Total 143416 Height 5556 5556 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-38-2-10ul-001.lcd 29/03/2019 16:52:491 / ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-39-10ul-001.lcd : Admin : CTD-39 : CTD-39 47 : 10 uL : CTD-39-10ul-001.lcd : Camthaodat-coixol.lcm : Batc.lcb : Default.lcr : 11/01/2019 16:22:44 : 19/03/2019 13:54:23 Acquired by Sample Name Sample ID Tray# Vail # Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\ CTD-39-10ul-001.lcd mV Detector A Channel 125 100 75 50 25 0 10 15 20 25 30 PeakTable Detector A Channel 278nm Peak# Total Ret Time 8.348 Area 205115 205115 Height 13308 13308 Area % 100.000 100.000 Height % 100.000 100.000 Resolution 0.000 C:\Users\Vien Duoc Lieu\Desktop\New folder\CTD-39-10ul-001.lcd ... phân giải (RS) hai pic hai chất tính theo cơng thức: RS  1,18t R2  t R1  w h1  w h2 Trong đó: tR1 thời gian lưu, hay khoảng cách đường từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic... đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau; wh1 wh2 chiều rộng hai pic nửa chiều cao pic tương ứng Độ phân giải lớn 1,5 hai pic tách đến đường Công thức cho khơng pic khơng... trình thực đề tài, song có mặt hạn chế, thi u sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp dẫn thầy cô giáo anh chị đồng nghiệp Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2019 Phạm Thị Minh Hải MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ