Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ fallopia multiflora (thunberg) haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội - 2021 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt TS Nguyễn Hải Đăng Hà Nội - 2021 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt TS Nguyễn Hải Đăng Các số liệu, kết luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Thoa iv LỜI CẢM ƠN Luận án hồn thành Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, với hỗ trợ kinh phí đề tài VAST.ƯDCN.05/1416 Trong trình nghiên cứu, tác giả nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, nhà khoa học, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bảy tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc, cảm phục kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt TS Nguyễn Hải Đăng - người thầy tận tâm hướng dẫn, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển tập thể cán Viện quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Hoạt chất sinh học, Trung tâm tiên tiến Hóa sinh hữu - Viện Hóa sinh biển tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị tốt để thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ hóa đồng nghiệp giúp đỡ, ln tạo điều kiện thuận lợi để học tập thực luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè người thân ln ln quan tâm, khích lệ, động viên tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận án Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Thoa v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu chi Fallopia .4 1.2 Giới thiệu chung hà thủ ô đỏ .5 1.3 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ giới 1.3.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học 1.3.1.1 Hợp chất stilbene 1.3.1.2 Hợp chất quinone .10 1.3.1.3 Hợp chất flavonoid 12 1.3.1.4 Hợp chất lipid 15 1.3.1.5 Một số hợp chất khác .16 1.3.2 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học .19 1.3.3 Các nghiên cứu khả gây độc gan hà thủ ô đỏ .20 1.3.4 Các nghiên cứu phân tích định tính, định lượng hoạt chất hà thủ ô đỏ .21 1.4 Tình hình nghiên cứu hà thủ đỏ Việt Nam 26 1.5 Tổng quan thẩm định phương pháp phân tích 28 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất 31 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 31 2.2.3 Phương pháp xử lí mẫu 32 2.2.4 Phương pháp phân tích định tính, định lượng hợp chất 32 2.3 Phân lập hợp chất .33 2.4 Hằng số vật lí kiện phổ hợp chất 37 2.4.1 Hợp chất FM3 37 vi 2.4.2 Hợp chất FM4 37 2.4.3 Hợp chất FM1 37 2.4.4 Hợp chất FM2 37 2.4.5 Hợp chất FM5 38 2.4.6 Hợp chất FM6 38 2.4.7 Hợp chất FM7 38 2.4.8 Hợp chất FM8 38 2.4.9 Hợp chất FM9 39 2.4.10 Hợp chất FM10 .39 2.4.11 Hợp chất FM11 .39 2.5 Kết thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC .39 2.5.1 Kết khảo sát thể tích bơm mẫu 39 2.5.2 Kết lựa chọn cột sắc ký 40 2.5.3 Kết khảo sát bước sóng phân tích 40 2.5.4 Kết khảo sát pha động 42 2.5.5 Kết khảo sát thời gian lưu độ tinh khiết chất tham chiếu 43 2.5.6 Kết khảo sát hệ thống LC/MS 45 2.6 Kết xây dựng đường chuẩn định lượng 46 2.7 Quy trình xử lí mẫu phân tích 49 2.8 Kết thẩm định phương pháp định tính, định lượng 50 2.8.1 Kết xác định tính chọn lọc phương pháp 50 2.8.2 Kết xác định LOD, LOQ 50 2.8.3 Kết xác định độ chụm .51 2.8.3.1 Kết xác định độ lặp 51 2.8.3.2 Kết xác định độ tái lặp .57 2.8.4 Kết xác định độ .60 2.9 Kết phân tích mẫu 65 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 71 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ 71 3.1.1 Hợp chất FM3 71 3.1.2 Hợp chất FM4 78 3.1.3 Hợp chất FM1 85 3.1.4 Hợp chất FM2 86 vii 3.1.5 Hợp chất FM5 89 3.1.6 Hợp chất FM6 91 3.1.7 Hợp chất FM7 93 3.1.8 Hợp chất FM8 95 3.1.9 Hợp chất FM9 97 3.1.10 Hợp chất FM10 .99 3.1.11 Hợp chất FM11 101 3.2 Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất hà thủ ô đỏ 104 3.4 Hàm lượng hoạt chất mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ .109 3.4.1 Sắc ký đồ DAD 280 nm mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ 109 3.4.2 Sắc ký đồ DAD 320 nm mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ 111 3.4.3 Sắc ký đồ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang 113 3.4.4 Kết phân tích mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ 114 KIẾN NGHỊ 120 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ proton H-NMR resonance spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ carbon-13 resonance spectroscopy Association of Official Hiệp hội nhà hóa phân Analytical Chemists tích thức American Society for Testing Hiệp hội xét nghiệm nguyên of Materials vật liệu Mỹ CC Column chromatography Sắc ký cột CL Chemiluminescence Phổ phát quang hóa COSY Phổ COSY AOAC ASTM H-1H Correlation spectroscopy DAD Diod array detector Detector mảng diode DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT by polarisation transfer DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO EC50 Half maximal effective Nồng độ hiệu trung bình concentration ESI-MS GI50 HPLC Electron spray ionization Phổ khối lượng phun mù điện mass spectrum tử The average growth inhibition Ức chế tăng trưởng trung bình of 50% 50% High performance liquid Sắc kí lỏng hiệu cao chromatography ix HR-MS High resolution - mass Phổ khối lượng phân giải cao spectrum HMBC Heteronuclear multiple bond Phổ HMBC connectivity HSQC Heteronuclear single-quantum Phổ HSQC coherence IC50 ICH Inhibitory concentration at Nồng độ ức chế 50% đối 50% tượng thử nghiệm International Conference on Hội đồng hòa hợp quốc tế Harmonization ISO International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế Organization LC/MS Liquid chromatography Sắc ký lỏng khối phổ mass spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú người MS Mass spectrum Phổ khối lượng NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy NOESY Nuclear overhauser Phổ NOESY enhancement spectroscopy PAD Photodiode array detection Detector mảng diode RP Reverse phase Pha đảo RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối x S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu nhiễu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn Ung thư ruột kết SW620 TCVN - Tiêu chuẩn Việt Nam THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene- - 2-O-β-D-glucoside TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethyl silan (CH3)4Si UPLC Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography UHPLC-MS/MS Ultra high performance liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu chromatography-mass cao kết nối hai lần khối phổ spectrum/mass spectrum United States Food and Cục dược phẩm thực phẩm Drug Administration Mỹ USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại YMC-RP YMC-reversed phase Pha đảo YMC USFDA 195 Kết mẫu CE (FM4) 196 Kết mẫu TT1 (FM2) 197 198 Kết mẫu TT2 (FM2) 199 Kết mẫu TT2 (FM4) 200 Kết mẫu TT3 (FM2) 201 Kết mẫu TT3 (FM4) 202 Kết mẫu TT4 (FM2) 203 Kết mẫu TT4 (FM4) 204 Kết mẫu TT4 (FM1) 205 Kết mẫu TT5 (FM2) 206 Kết mẫu TT5 (FM4) 207 MỘT SỐ BẢNG TRA CỨU Bảng Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC)[78] TT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 100 100% 1,3 10 10-1 10% 1,8 10-2 1% 2,7 0,1 10-3 0,1 % 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10 ppb 21 10 0,0000001 10-9 ppb 30 Bảng Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC)[78] TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%) 100 100% 98-102 10 10-1 10% 98-102 10-2 1% 97-103 0,1 10-3 0,1 % 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 208 Bảng Bảng phân phối chuẩn Student [78] α Bậc tự 0,10 0,05 0,01 0,005 0,001 6,314 12,71 31,82 63,66 318,3 2,920 4,303 6,965 9,925 22,33 2,353 3,182 4,541 5,841 10,21 2,132 2,776 3,747 4,604 7,173 2,015 2,571 3,365 4,032 5,893 1,943 2,447 3,143 3,707 5,208 1,895 2,365 2,998 3,499 4,785 1,860 2,306 2,896 3,355 4,501 1,833 2,262 2,821 3,250 4,297 10 1,812 2,228 2,764 3,169 4,144 11 1,796 2,201 2,718 3,106 4,025 12 1,782 2,179 2,681 3,055 3,930 13 1,771 2,160 2,650 3,012 3,852 14 1,761 2,145 2,624 2,977 3,787 15 1,753 2,131 2,602 2,947 3,733 16 1,746 2,120 2,583 2,921 3,686 17 1,740 2,110 2,567 2,898 3,646 18 1,734 2,101 2,552 2,878 3,610 19 1,729 2,093 2,539 2,861 3,579 20 1,725 2,086 2,528 2,845 3,552 21 1,721 2,080 2,518 2,831 3,527 209 α Bậc tự 0,10 0,05 0,01 0,005 0,001 22 1,717 2,074 2,508 2,819 3,505 23 1,714 2,069 2,500 2,807 3,485 24 1,711 2,064 2,492 2,797 3,467 25 1,708 2,060 2,485 2,787 3,450 26 1,706 2,056 2,479 2,779 3,435 27 1,703 2,052 2,473 2,771 3,421 28 1,701 2,048 2,467 2,763 3,408 29 1,699 2,045 2,462 2,756 3,396 30 1,697 2,042 2,457 2,750 3,385 ... ? ?Nghiên cứu xây dựng liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson sắc ký lỏng hiệu cao? ?? Mục tiêu luận án: Nghiên cứu làm rõ thành... hoạt chất dược liệu Vì vậy, HPLC-DAD-MS lựa chọn nhằm xây dựng liệu định tính, định lượng hoạt chất dược liệu hà thủ ô đỏ 1.4 Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ Việt Nam Hà thủ ô đỏ loại dược liệu. .. ô đỏ khiêm tốn Một số nghiên cứu tiến hành thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao, song kết nghiên cứu dừng lại phân tích định tính định lượng số hoạt chất hà thủ đỏ đỏ Để đánh giá chất lượng hà thủ ô