Bài viết Xây dựng qui trình định lượng hydroxychavicol trong cao Trầu không (piper betle L. piperaceae) bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao đã cung cấp các thông số nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Trầu không của Việt Nam. Nghiên cứu đã sử dụng quy trình trên để đánh giá hàm lượng hydroxycavicol trong cao chiết nước phân đoạn dicloromethan của Trầu không cho thấy hàm lượng hydroxychavicol khoảng 85 %. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết!
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 45 Xây dựng qui trình định lượng hydroxychavicol cao Trầu khơng (piper betle L piperaceae) sắc kí lỏng hiệu cao Phan Thị Thanh Thủy, Nguyễn Đinh Nga Khoa Dược – Đại học Nguyễn Tất Thành pttthuy@ntt.edu.vn Tóm tắt Dịch chiết Trầu khơng chứng minh có khả kháng nấm da kháng khuẩn tốt Thành phần có hoạt tính dịch chiết hydroxychvicol Hydroxychavicol cao trầu không (Piper betle L Piperaceae) định lượng sắc kí lỏng hiệu cao sử dụng cột C18 (5 µm x 2,1 mm x 250 mm) để chạy với pha động acetonitril: orthophosphoric acid 0,05 % (30 : 70), tốc độ dòng 0,5 mL/min, thể tích tiêm mẫu µL Kết thẩm định theo hướng dẫn ICH cho thấy quy trình có độ đặc hiệu cao, đạt độ tuyến tính, đạt độ lặp lại với RSD = 1,12 %, đạt độ với tỉ lệ hồi phục 96 % Quy trình cung cấp thơng số nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Trầu không Việt Nam Nghiên cứu sử dụng quy trình để đánh giá hàm lượng hydroxycavicol cao chiết nước phân đoạn dicloromethan Trầu không cho thấy hàm lượng hydroxychavicol khoảng 85 % ® 2022 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Trầu không (TrK) thuốc sử dụng từ lâu đời y học cổ truyền nước ta số nước châu Á dùng chữa cảm, giảm đau bong gân, làm lành vết thương, se niêm mạc, kích thích tiết men gan, làm lành vết thương, kích thích sinh dục, trị hắc lào, lang beng [1,2] Đặc biệt tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn TrK nhiều nghiên cứu giới kiểm chứng [3,6,7] Cao chiết từ TrK với ethanol có thành phần hydroxychavicol chứng minh có tác động kháng nấm da Malassezia furfur Candida spp Error! Reference source not found Ngoài cao chiết TrK tươi phương pháp đun hồi lưu với nước cho khả kháng C albican, M furfu, E.coli, S aureus Các nghiên cứu giới cho thấy thành phần có hoạt tính sinh học (kháng viêm, chống oxy hóa, kháng ung thư, chống kết tập tiểu cầu, kháng khuẩn, kháng nấm,…) TrK hydroxychavicol Nhận 01.10.2021 Được duyệt 09.11.2021 Công bố 06.04.2022 Từ khóa Trầu khơng, Piper betle, hydroxychavicol, HPLC [8,13,14] Phương pháp định lượng sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) cho thấy hàm lượng hydroxychavicol cao chiết nước TrK nhiều so với loại cao chiết n – hexan, ethyl acetat, ethanol [11] Hơn nữa, cao chiết nước TrK tươi cho khả kháng khuẩn kháng nấm mạnh cao chiết từ phương pháp khác [12] Hiện nay, TrK nước ta thường sử dụng dạng nước sắc cao Dược điển Việt Nam chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho cao dược liệu Nhằm khai thác nguồn dược liệu TrK làm thuốc kháng nấm kháng khuẩn, góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho cao TrK, mục tiêu nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng hydroxychavicol cao TrK phương pháp HPLC Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 46 Lá TrK tươi chọn loại bánh tẻ (không non hay già), có khả kháng khuẩn kháng nấm tốt [4], không bị sâu bệnh hay dập úng thu hái Bà Điểm - Hóc Mơn, Thành phố Hồ Chí Minh Lá trầu rửa với nước, cắt nhỏ (2-4) mm2 2.2 Thiết bị- hóa chất: máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC) phân tích Waters 2695 Separation Modules, LC – 20 A (Shimadzu, Japan), cột GL C18 µm (2,1 mm x 250 mm); dicloromethan (Trung Quốc); Acid orthophosphoric 0,1 % (Merck); acetonitril (Merck); Hydroxychavicol (Merck) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Quy trình chiết xuất [1,2] Dựa vào điều kiện chiết xuất tối ưu khảo sát với hỗ trợ phần mềm BCPharsoft [4] chúng tơi đưa quy trình chiết cao TrK sau: - Chia lô gồm 200 g dược liệu TrK tươi; đun sôi hồi lưu (100 0C) với lít nước giờ, thu dịch chiết, lọc qua giấy lọc - Dịch lọc cô bay dung môi (100 0C) đến thể tích 64 mL thu dịch chiết nước đặc, lắc phân bố với dichloromethan - Phân đoạn dichloromethan quay thu hồi dung mơi để có cao TrK, hút ẩm đến khối lượng không đổi trước xác định khối lượng cao 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng - Khảo sát điều kiện sắc kí Dựa vào nghiên cứu KY Pin [13] điều kiện sắc kí đề xuất sau: Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng; Bước sóng phát hiện: 210 nm, bước sóng hấp thu cực đại hydroxychavicol; Khảo sát tỉ lệ pha động acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 %: triển khai mẫu chuẩn qua cột GL C18 (5 µm x 2,1 mm x 250 mm) với tỉ lệ pha động khác nhau; Khảo sát tốc độ dịng: 0,3; 0,5 (mL/min); Khảo sát thể tích tiêm mẫu: (20; 10; 2) µL - Thẩm định qui trình định lượng Dung dịch chuẩn: cân xác lượng chất chuẩn hydroxychavicol Hòa tan pha động để thu dung dịch có nồng độ 25 µg/mL Dung dịch thử: cân xác khoảng 15 mg cao, pha bình định mức 20 mL, pha lỗng 20 lần với dung môi acetonitril Lọc dịch chiết qua màng lọc milipore 0,45 µm Hàm lượng hydroxychavicol (mg/g) cao Đại học Nguyễn Tất Thành tính theo cơng thức: Ct = S t × k × Cc × P Sc × m ∗ (100 % − h) Trong đó: - Ct: nồng độ chất khảo sát có cao (mg/1g cao) - St: diện tích đỉnh thu mẫu đo - Sc: diện tích đỉnh thu mẫu chuẩn - Cc: nồng độ chất chuẩn (µg/mL) - P: độ tinh khiết chất chuẩn (P = 99,8 %) - h: độ ẩm cao (h = 7,6 %) - m: khối lượng cân cao để định lượng (mg) - k: thể tích dung dịch pha lỗng mẫu thử (k = 400 mL) Thẩm định quy trình định lượng hydroxychavicol theo hướng dẫn Hội nghị Quốc tế Hài hòa yêu cầu kĩ thuật dược phẩm dùng cho người (International Conference on Harmonization – ICH) tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác, độ tính chọn lọc [12] - Khảo sát tính tương thích hệ thống Tiến hành kiểm tra tính tương thích hệ thống cách bơm lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ xác định vào máy HPLC Điều kiện HPLC tối ưu xác định Xác định tính tương thích hệ thống dựa giá trị độ lặp lại thơng số kĩ thuật : S: diện tích peak, tR: thời gian lưu, T: hệ số kéo đuôi, N: số đĩa lí thuyết, H: độ phân giải, W1/2: độ rộng ½ chiều cao peak Xử lí thống kê số liệu: n X Giá trị trung bình: X = i 1 i n n Độ lệch chuẩn: (X i 1 i X) (n 1) Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = SD × 100 X Yêu cầu: quy trình đạt tính tương thích hệ thống thơng số sắc kí thực mẫu chuẩn có RSD ≤ % - Khảo sát tính tuyến tính Pha mẫu chuẩn có nồng độ chất chuẩn tăng dần để xây dựng đường tuyến tính Mỗi dung dịch sau lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm bơm lần vào hệ thống Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 47 HPLC Điều kiện chạy HPLC định Dùng phần mềm Excel để lập đường tuyến tính biểu diễn tương quan nồng độ diện tích đỉnh Mối tương quan tuyến tính thiết lập cách xác định phương trình hồi quy y = ax + b; tính R2 Tính tương thích phương trình hồi quy kiểm tra nghiệm F; ý nghĩa hệ số phương trình kiểm tra nghiệm t Yêu cầu: R2 ≥ 0,995 - Khảo sát độ lặp lại Chuẩn bị riêng rẽ mẫu thử (chiết theo qui trình khảo sát) nồng độ xác định Thực ngày điều kiện Tiến hành định lượng HPLC với điều kiện sắc kí chọn sau khảo sát, mẫu bơm lần Tính nồng độ trung bình X , SD, RSD (%) kết nồng độ từ lần đo Yêu cầu theo Bảng Bảng Sự thay đổi độ xác theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất Tỉ số Đơn vị RSD phân tích (%) nồng độ tương ứng % 100 100 % 1,3 -1 ≥ 10 10 10 % 2,8 ≥1 10-2 1% 2,7 -3 ≥ 0,1 10 0,1 % 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 -5 0,001 10 10 ppm 7,3 -6 0,0 001 10 ppm 11 - Khảo sát tính Thêm lượng chất chuẩn vào mẫu thử xác định hàm lượng Lượng chất chuẩn thêm vào tương đương với (80, 100 120) %, hàm lượng hoạt chất tương ứng mẫu thử Tiến hành chiết xuất định lượng lại chất theo quy trình xây dựng Ở nồng độ thực mẫu Xác định diện tích đỉnh trung bình, tính hàm lượng tính % tỉ lệ phục hồi nồng độ thêm vào Yêu cầu theo Bảng Bảng Mối liên quan tỉ lệ phục hồi nồng độ chất phân tích Nồng độ chất phân tích (%) 100 ≥ 10 ≥1 ≥ 0,1 Tỉ lệ nồng độ Đơn vị tương ứng 10-1 10-2 10-3 100 % 10 % 1% 0,1 % Tỉ lệ phục hồi TB (%) 98 – 102 98 – 102 97 – 103 95 – 105 0,01 0,001 0,0 001 10-4 10-5 10-6 100 ppm 10 ppm ppm 90 –107 80–110 80–110 - Khảo sát tính chọn lọc Tính chọn lọc kiểm tra sắc kí đồ của: - Mẫu thử - Mẫu chuẩn - Mẫu thử thêm chuẩn - Dung mơi hịa tan mẫu Quan sát so sánh thời gian lưu peak khảo sát dung dịch Yêu cầu: Thời gian lưu peak khảo sát mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu peak chất khảo sát mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng khơng có peak trùng với peak chất khảo sát Peak chất khảo sát tách hồn tồn peak khác sắc kí đồ mẫu thử Khi thêm lượng chất chuẩn chất khảo sát vào mẫu thử, chiều cao diện tích peak chất khảo sát tăng lên so với trước thêm chất chuẩn Dung mơi hịa tan mẫu khơng cho peak chất khảo sát Kết bàn luận 3.1 Chiết xuất 200 g dược liệu thu khối lượng cao trung bình qua lần chiết 0,71 g Bảng Kết chiết cao Khối lượng cao (g) Hiệu suất (%) 0,74 0,72 0,71 0,37 0,36 0,355 TB 0,723 0,362 3.2 Khảo sát điều kiện sắc kí HPLC - Khảo sát tỉ lệ pha động acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 %: Kết khảo sát tỉ lệ pha động với điều kiện thể tích tiêm 20 µL, tốc độ dịng 0,3 mL/min thể Bảng Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 48 Bảng Kết khảo sát tỉ lệ pha động acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 % Tỉ lệ pha động A: B (100: 0) A: B (80: 20) A : B (60: 40) A : B (40 : 60) A : B (30 : 70) A : B (20 : 80) tR (phút) 2,606 2,694 3,397 5,970 10,112 21,344 T 2,064 1,793 1,539 1,203 0,969 0,822 N 396 291 412 789 180 770 W1/2 0,159 0,172 0,210 0,339 0,527 0,962 *A: acetonitril, B: acid orthophosphoric 0,05 %, tR: thời gian lưu, T: hệ số kéo đi, N: số đĩa lí thuyết, W1/2: độ rộng ½ chiều cao peak Hình Sắc kí đồ mẫu phân lập với pha động 30 % acetonitril Nhận xét: từ kết khảo sát tỉ lệ pha động acetonitril: acid orthophosphoric 0,05 % nhận thấy với pha động 30 % acetonitril cho kết peak có hệ số kéo thấp (0,969), số đĩa lí thuyết lớn (2 180), peak cân đối có thời gian lưu (tR) 10,112 phút không dài nên tỉ lệ pha động acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 % (30 : 70) chọn để tiếp tục nghiên cứu - Khảo sát tốc độ dòng Kết khảo sát tốc độ dòng với tỉ lệ pha động A: B (30 : 70), thể tích tiêm mẫu 20 µL thể Bảng Bảng Kết khảo sát tốc độ dòng Tốc độ dòng (mL/min) 0,3 0,5 tR (phút) 10,112 6,739 T 0,969 0,996 N 180 960 W1/2 0,527 0,358 * tR: thời gian lưu, T: hệ số kéo đuôi, N: số đĩa lí thuyết, W1/2: độ rộng ½ chiều cao peak Hình Sắc kí đồ củachuẩn phân lập với tốc độ dòng 0,5 mL/min Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 49 Nhận xét: kết khảo sát so sánh tốc độ dòng (0,3 0,5) mL/min cho hệ số kéo đuôi nhau, chệnh lệch số đĩa lí thuyết khơng đáng kể, thời gian lưu tốc độ dịng 0,5 mL/min nhanh Do đó, tốc độ dòng 0,5 mL/min chọn để thực sắc kí - Khảo sát thể tích tiêm mẫu Kết khảo sát thể tích tiêm mẫu với tỉ lệ pha động acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 % (30 : 70), tốc độ dòng 0,5 mL/min thể Bảng Bảng Kết khảo sát thể tích tiêm mẫu Thể tích tiêm mẫu (µL) 20 tR (phút) 6,645 T N W1/2 1,084 528 0,333 10 6,670 1,086 295 0,213 6,699 1,025 474 0,178 6,720 1,014 455 0,167 * tR: thời gian lưu, T: hệ số kéo đi, N: số đĩa lí thuyết, W1/2: độ rộng ½ chiều cao peak Nhận xét: từ kết khảo sát thể tích tiêm mẫu nhận thấy với thể tích tiêm mẫu (20, 10, 2) µL có thời gian lưu thể tích tiêm mẫu µL hệ số kéo thấp, số đĩa lí thuyết cao nên chọn thể tích µL để thực sắc kí Hình Sắc kí đồ chuẩn phân lập với thể tích tiêm mẫu µL Từ khảo sát, điều kiện sắc kí lỏng hiệu cao lựa chọn sau: chế độ rửa giải isocratic, hệ dung môi acetonitril – acid orthophosphoric 0,05 % (30 : 70), tốc độ dịng 0,5 mL/min, thể tích tiêm mẫu µl, bước sóng phát 210 nm 3.3 Thẩm định quy trình định lượng - Khảo sát tính tương thích hệ thống Kết khảo sát tính tương thích hệ thống trình bày Bảng Bảng Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Lần bơm Trung bình S 582 435 584 111 585 023 584 952 584 985 584 811 584 386 tR (phút) 6,666 6,675 6,671 6,656 6,645 6,623 6,656 H 54 962 54 830 55 089 55 153 55 384 55 508 55 154 N 680 651 659 638 671 682 664 W1/2 0,163 0,164 0,163 0,163 0,163 0,162 0,163 T 1,048 1,05 1,05 1,05 1,051 1,051 1,050 SD 014,65 0,01 947 254,669 17,3 061 0,00 063 0,0 011 RSD (%) 0,17 0,29 0,46 0,20 0,39 0,10 * S: diện tích peak, tR: thời gian lưu, T: hệ số kéo đi, N: số đĩa lí thuyết, H: độ phân giải, W1/2: độ rộng ½ chiều cao peak Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 50 Nhận xét: thông số thời gian lưu (tR), diện tích peak (S), hệ số bất đối (T), độ phân giải (H), số đĩa lí thuyết (N) có RSD ≤ % nên quy trình có tính tương thích hệ thống - Khảo sát tính chọn lọc Kết khảo sát tính chọn lọc trình bày Bảng Hình Hình Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng Kết khảo sát tính chọn lọc Tên mẫu Lần S Lần tR S Lần tR S Lần tR S Lần tR S Lần tR S tR Dung 0 0 0 0 0 0 môi Mẫu 586 070 6,585 chuẩn Mẫu thử 685 371 6,697 Mẫu thêm 252 180 6,606 271 197 6,693 254 650 6,692 223 056 6,676 236 904 6,625 235 500 6,606 chuẩn S: diện tích peak, tR: thời gian lưu - Xây dựng đường tuyến tính Kết xử lí thống kê cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích peak (S) nồng độ hydroxychavicol khoảng nồng độ (0,5-115,5) ppm (R2 = 0,999) Bảng Diện tích peak ứng với nồng độ mẫu Hình Kết khảo sát tính chọn lọc (1) dung môi; (2) mẫu chuẩn; (3) mẫu thử Mẫu chuẩn có peak tR = 6,585 phút, thêm lượng mẫu chuẩn phân lập vào mẫu thử, kết chiều cao diện tích peak hydroxychavicol tăng lên so với trước thêm chất chuẩn Như vậy, quy trình có tính chọn lọc Đại học Nguyễn Tất Thành C, ppm 0,58 1,16 2,31 3,465 5,775 11,55 23,1 34,65 57,75 S 14 700 30 074 58 101 87 488 151 997 304 207 578 227 878 313 481 026 Độ lệch (%) 0,38 2,68 0,82 0,44 3,79 3,86 1,29 0,04 1,13 Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 115,5 979 296 51 1,72 C: nồng độ mẫu; S: diện tích peak; Nồng độ mẫu (ppm) 140 y = 3,88 277.10-5 x R² = 0.999 120 100 80 60 40 20 0 1000000 2000000 3000000 4000000 Diện tích peak (mAU.s) Hình Đường tuyến tính biểu diễn tương quan nồng độ mẫu diện tích peak Nhận xét: dựa vào phần mềm Excel, lập đường tuyến tính biểu diễn tương quan nồng độ diện tích đỉnh: Phương trình hồi qui tương quan: y = 3,88 277 × 10-5 x + 0,09 065 Với t-test cho hệ số 3,88 277 × 10-5 có ý nghĩa thống kê (p = 3,6 × 10-20 < 0,05) 0,09 065 khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,431 > 0,05) Phương trình có tính tương thích qua phép kiểm F với p = 3,57 × 10-20 < 0,05 Hệ số tương quan: R2 = 0,999 Qua kết phân tích thống kê ta thấy, tỉ lệ diện tích peak sắc kí nồng độ phụ thuộc tuyến tính với cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao đạt yêu cầu Khoảng nồng độ tuyến tính (0,58-115,5) ppm Do đó, ta sử dụng phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng hudroxychavicol mẫu thử khoảng tuyến tính khảo sát Bảng 10 Kết khảo sát độ lặp lại Mã mẫu Khối lượng mẫu m (g) tR (min ) 0,0 160 6,716 0,0 125 6,728 0,0 178 6,713 0,0 161 6,697 0,0 176 6,721 0,0 122 6,710 - Khảo sát độ lặp lại Kết khảo sát độ lặp lại thể Bảng 10 % RSD tR S % RSD S/m 682 639 531 884 778 571 0,156 1,13 681 803 753 577 521 297 Nhận xét: tiêu chuẩn chấp nhận cho độ lặp lại với nồng độ chất phân tích 100 ppm RSD ≤ 5,3 % Như vậy, quy trình có độ lặp lại chấp nhận có % RSD S/m 1,13 - Khảo sát độ Kết khảo sát độ quy trình định lượng thể Bảng 11 Hình Kết khảo sát độ lặp lại Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 52 Bảng 11 Kết khảo sát độ quy trình định lượng Mẫu thêm chuẩn (%) 80 100 120 KL mẫu (g) 0,0 159 0,0 162 0,0 158 0,0 153 0,0 159 0,0 155 0,0 159 0,0 152 0,0 158 0,0 146 0,0 159 0,0 156 0,0 142 0,0 148 0,0 147 0,0 131 0,0 135 0,0 144 a Mẫu thêm 80 % chuẩn Nồng độ hydroxychavicol mg/g 565 588 580 585 554 592 655 701 689 702 674 649 940 889 926 935 925 927 b Mẫu thêm 100 % chuẩn Hình Kết khảo sát độ Nhận xét: tiêu chuẩn chấp thuận cho độ với nồng độ chất phân tích 10 ppm tỉ lệ hồi phục (80110) % Như vậy, quy trình phân tích có độ chấp nhận Kết luận Trong nghiên cứu thẩm định quy trình định lượng hydroxychavicol cao chiết TrK phương pháp HPLC với đầu dị UV-Vis Quy trình Đại học Nguyễn Tất Thành Tỉ lệ hồi phục (%) 95,0 99,2 98,5 98,8 92,2 99,3 95,0 99,2 98,5 98,8 92,2 99,3 96,9 91,5 95,0 96,1 94,5 95,3 Giá trị trung bình RSD (H) 97,2 3,0 96,1 2,6 94,9 1,9 c Mẫu thêm 120 % chuẩn định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát tính tuyến tính phương pháp Điều chứng tỏ quy trình phù hợp để định lượng hydroxychavicol cao TrK Trên sở đó, thực định lượng mẫu cao TrK theo qui trình chiết tối ưu hóa [4] Khối lượng mẫu cao thu (1) 0,0 160 g; (2) 0,0 125 g; (3) 0,0 178 g; (4) 0,0 161 g; (5) 0,0 176 g (6) 0,122 g Kết hàm lượng hydroxychavicol Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 16 mẫu cao theo thứ tự (1) 849 mg/g; (2) 847 mg/g; (3) 870 mg/g; (4) 842 mg/g; (5) 850 mg/g (6) 850 mg/g Như vậy, trung bình hàm 53 lượng hydroxychavicol cao chiết nước phân đoạn dicloromethan 85 % Do việc định lượng hydroxychavicol HPLC tương đối dễ dàng Tài liệu tham khảo Đỗ Tất Lợi, (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, tr 151 – 161 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), “Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt nam”, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, tập I Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh, (2010), “Thành phần tác động kháng Candida spp tinh dầu cao chiết từ Trầu khơng Việt Nam”, Tạp chí Dược học,(410), tr.27 Phan Thị Thanh Thủy, Nguyễn Mai Hương, Nguyễn Nhật Anh, Nguyễn Đinh Nga, (2014), “Khảo sát điều kiện chiết xuất cao trầu không (piper betle L.Piperacea)”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, 18(2), tr 251-255 Ali et al, (2010), “In vitro antifungal activity of hydroxychavicol isolated from Piper betle”, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 9(7) Chakraborty, (2011), “Antimicrobial, anti-oxydative and anti-hemolytic activity of Piper betle leaf extracts”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(3), p.192 – 199 Sugumaran, (2011), “Chemical composition and antimicrobial activity of velaiikody variety of Piper betle Linn leaf oil against dental pathogents”, International Journal of PharmTech Research, 3(4), p.2135 – 2139 Intzar Ali1 and al, (2010), In vitro antifungal activity of hydroxychavicol isolated from Piper betle L, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 9:7 N Zamakshshari et al, (2021), Effect of extraction procedure on the yield and biological activities of hydroxychavicol from Piper betle L Leaves Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants (24), 100320 10 KY Pin, (2010), “Antioxidant and Anti-inflammatory activities of extracts of betel leaves from solvents with different polarities” Journal of Tropeakal Forest Sciences, 22(4), pp 448 – 455 11 T Nalia, T and Rahim, Z.H.A, (2006), “Effect of Piper betle L leaf extract on the virulence activity of Streptococcus mutans – an in vitro study” Pak J Biol Sci., (9), pp 1470 – 1475 12 Guideline ICH “Q2A text on validation of Analytical procedures”, Fed Regist., 60 13 Tripathi S, Verma NK, Singh DP, Chaudhary SK., (2011), Piper betle: Phytochemistry Traditional Use & Pharmacological Activity – A Review IJPRD; 4(4):216-223 14 Pradhan D, Biswasroy P, Suri KA (2014), Various factors influencing the percentage content of hydroxychavicol in different extracts of Piper betle L by altering the extraction parameters IJATR; 4(2) Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 16 54 The HPLC method developement for determination of hydroxychavicol in betel (Piper Betle L piperaceae) extract Phan Thi Thanh Thuy, Nguyen Dinh Nga Faculty of Pharmacy, Nguyen Tat Thanh University pttthuy@ntt.edu.vn Abstract The betel extract contains hydroxychavicol which was evaluated for antidermatophyte and antibacterial activity An HPLC procedure was developed for determination of hydroxychavicol in the extracts of betel: column C18 µm (2,1 mm x 250 mm), mobile phase – acetonitril : orthophosphoric acid 0.05 % (30 : 70), flow rate of 0.5 mL/min, injection volumn of µL By validation, the proposed method proved quite adequate compatibility, satisfactory specificity and desirable linearity (R2 = 0,999) The RSD value was 1.12 %, the recovery percentage was 96 %, the detection limit was 0.130 ppm and the quantitation limit was 0.394 ppm The validated method was used for quantitative analysis hydroxychavicol content in the dichloromethane betel extract (85 %) Keywords Hydroxychavicol, betel extract, high performance liquid chromatography (HPLC) Đại học Nguyễn Tất Thành ... để có cao TrK, hút ẩm đến khối lượng không đổi trước xác định khối lượng cao 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng - Khảo sát điều kiện sắc kí Dựa vào nghiên cứu KY Pin [13] điều kiện sắc kí đề... (P = 99,8 %) - h: độ ẩm cao (h = 7,6 %) - m: khối lượng cân cao để định lượng (mg) - k: thể tích dung dịch pha lỗng mẫu thử (k = 400 mL) Thẩm định quy trình định lượng hydroxychavicol theo hướng... Thẩm định qui trình định lượng Dung dịch chuẩn: cân xác lượng chất chuẩn hydroxychavicol Hòa tan pha động để thu dung dịch có nồng độ 25 µg/mL Dung dịch thử: cân xác khoảng 15 mg cao, pha bình định