Trong đề tài này nhằm nghiên cứu quy trình chiết tách carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng phương pháp HPLC với hệ thống knauer smarline 2500 system.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG Võ Xn Hồi*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đơng* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Trên thị trường có nhiều chế phẩm giàu carotenoid lưu hành như: carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo gần từ vi khuẩn, nhiên nước chưa có quy trình định lượng cụ thể cho chế phẩm Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài chúng tơi nghiên cứu quy trình chiết tách carotenoid từ vi khuẩn xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho chế phẩm lưu hành phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system Kết bàn luận: Kết nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào tán bể siêu âm chiết carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao (94,82%) Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn chế phẩm xác định phương pháp HPLC nhanh chóng có độ nhạy cao, cột RP C18 nhiệt độ phòng, hệ dung mơi pha động acetonitril- methanol - dichloromethal (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát 450 nm Phương pháp HPLC cho tương thích cao với thơng số sắc ký có RSD < 2% Phương pháp thẩm định cho độ xác độ thích hợp với tỷ lệ phục hồi carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83% Kết luận: Chúng xây dựng thành cơng trình định lượng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng carotenoid chế phẩm lưu hành thị trường Qui trình thẩm định áp dụng thành công số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid chế phẩm chứa carotenoid nước ngoại nhập Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng, ABSTRACT ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 182 - 187 Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market Carotenoids in these products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from bacteria Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products in Vietnam Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer Smarline 2500 system Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82% The content of carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity with RP C18, at room temperature The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v) * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Phan Thanh Dũng ĐT: 0983957158 182 Email: dungpharm@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450 nm The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2% The method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83% Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial products The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different bacterial biomasses and some domestic and imported products Keywords: HPLC, carotenoid Betacarotene, functional food DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis ĐẶT VẤN ĐỀ AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh Carotenoid nhóm sắc tố terpenoid phổ khối, cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi biến tự nhiên, sinh vật sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y sống ánh nắng mặt trời bao gồm thực Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1 vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm…(3) Kể từ Các chế phẩm chứa carotenoid thị phát nay, carotenoid trường: Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô thực phẩm, bổ sung chất dinh dưỡng, 4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử thủy sản (7) Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene Holland tễ học kết thực nghiệm chứng minh & Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015), carotenoid với vai trò chất chống oxi hóa Mỹ, Tảo Spiruline Teva S Switzerland (Số mang lại lợi ích cho sức khỏe người lô 4609, hạn sử dụng 9/2013) cách ngăn ngừa hay trì hỗn bệnh mạn tính Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh vi khuẩn thể số bệnh khác Do đó, carotenoid nghiên cứu ứng dụng nhiều Chúng tiến hành khảo sát phương lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1) pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn nghiền Trên thị trường có nhiều chế phẩm giàu carotenoid lưu hành như: carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn (3)…tuy nhiên hàm lượng carotenoid chế phẩm thường ghi chung chung, không xác định xác khơng thể xác định hoạt tính chế phẩm Do vấn đề đặt phải xây dựng quy trình chiết tách xác định hàm lượng carotenoid chế phẩm xác định loại carotenoid có chế phẩm để xác định hoạt tính chế phẩm Vì chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Bột sinh khối vi khuẩn Bacillus marisflavi Chuyên Đề Dược Học nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể siêu âm sử dụng lysozym với lượng sinh khối khảo sát 200 mg dung môi chiết cloroform methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5) Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn Bảng 1: Tỉ lệ dung môi chiết Dung môi Cloroform Methanol Tỉ lệ Thể tích (ml) 2,5 1,67 3,33 1,25 3,75 2,5 3,33 1,67 3,75 1,25 1:1 1:2 2:1 1:3 3:1 Chúng tiến hành khảo sát hệ dung môi chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa hai dung mơi methanol cloroform, nhằm tìm tỉ lệ dung môi chiết tối ưu Chiết tách carotenoid theo quy trình 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 khảo sát với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung thay đổi Bảng Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm Đối với chế phẩm có chứa carotenoid (carotenoid chiết dạng bột dầu) chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu (bột) viên chế phẩm vào ống Falcon 50 ml Thêm vào 10 ml NaOH N pha methanol, lắc rung mạnh phút Thêm 10 ml aceton, lắc rung cho Để nhiệt độ phòng 15 phút Thêm 10 ml n-hexan, lắc rung cho Thêm 10 ml nước khử khống, lắc rung cho Để nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm 9600 vòng /10 phút 4oC Thu lớp n-hexan Lớp n-hexan sau loại nước Na2SO4 Dịch chiết với n-hexan bay đến cắn Hòa lại cắn vào ml cloroform ml dung mơi pha động(2,1) Xây dựng quy trình định lượng carotenoid phương pháp HPLC thẩm định quy trình định lượng Chúng tơi tiến hành thăm dò hệ dung môi pha động để tách tốt loại carotenoid có dịch chiết Dựa vào tính chất carotenoid chất phân cực nên chọn hệ dung môi pha động phân cực Các hệ dung môi pha động khảo sát gồm có: acetonitril-methanol, acetonitril-methanol-dicloromethan hệ dung mơi thường sử dụng để phân tích carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát 450 nm, tốc độ dòng ml/phút hệ thống Knauer Smarline 2500 system Các mẫu chuẩn chọn gồm loại carotenoid thơng dụng thuộc nhóm xanthophyl carotenoid: astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen βcaroten để tiến hành trình thăm dò hệ dung mơi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5) chúng tơi tiến hành hẩm định quy trình định lượng ứng dụng qui trình thẩm định để định lượng số chế phẩm lưu hành thị trường(1-Error! Reference source not found.) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát phương pháp chiết, tách carotenoid Qua kết thực nghiệm nhận thấy, phương pháp phá vỡ màng tế bào bể siêu âm chiết hỗn hợp cloroform methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu cao với tỷ lệ hồi phục 94,82% Xây dựng quy trình định lượng carotenoid phương pháp HPLC Dựa vào tính chất phân cực carotenoid (nhóm caroten khơng phân cực nhóm xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung mơi phân tích phương pháp HPLC Tiến hành thăm dò hệ dung mơi pha động gồm acetonitril methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan với tỉ lệ khác để tách tốt hỗn hợp chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, lycopen β- caroten Kết khảo sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid tốt acetonitril – methanol - dicloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích 12 phút (Hình 1-G) Dung mơi pha động isocratic bổ sung amonium acetat 10 mM với A ACN -MeOH (50:50,tt/tt), B ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C ACN -MeOH (70:30,tt/tt), D ACN - MeOH (80:20,tt/tt), E ACN - MeOH (90:10,tt/tt), F ACN –MeOH DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G ACN –MeOH -DCM (70:20:10, tt/tt/tt), H ACN –MeOH -DCM (70:15:15, tt/tt/tt) Sau xây dựng quy trình định lượng 184 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học B β-caroten Lycopen β-caroten Lycopen Lycopen Β-caroten Canthaxanthin F H Β-caroten Zeaxanthin Canthaxanthin Astaxanthin Β-caroten Lycopen β-caroten Astaxanthin Lycopen Lycopen Zeaxanthin Canthaxanthin β-caroten Astaxanthin Lycopen Zeaxanthin Zeaxanthin Astaxanthin Canthaxanthin Zeaxanthin Canthaxanthin D E G Astaxanthin Zeaxanthin β-caroten C Canthaxanthin Astaxanthin Lycopen A Hình 1: Thăm dò hệ dung mơi Thẩm định quy trình phân tích Tính phù hợp hệ thống Bảng 2: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6) Loại carotenoid Astaxanthin Canthaxanthin Zeaxanthin Lycopen β-caroten n=6 RSD % Rt 0,193 0,196 0,318 0,230 0,193 Các số liệu thu cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa phù hợp cho việc phân tích định lượng carotenoid với RSD thời gian lưu, diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết cột sắc ký nằm giới hạn RSD ≤ 2% Các thông số Chuyên Đề Dược Học S 1,973 1,273 1,996 1,786 1,839 (N) 0,355 0,852 1,188 1,881 4,276 As 1,808 1,908 1,989 1,954 1,914 Rs 1,726 1,913 1,163 1,779 1,910 hệ số đối xứng nằm giới hạn từ 0,8≤ As ≤1,5 độ phân giải (Rs) lớn 1,5 Như phương pháp phân tích carotenoid đạt tính phù hợp hệ thống 185 Β-caroten Lycopen Zeaxanthin Astaxanthin Canthaxanthin Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Absorbance (mAU) Nghiên cứu Y học Time (min) Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, µm) phát Điều kiện HPLC: Pha động UV 450 nm Tốc độ dòng: ml/phút nhiệt acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10, độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột RP- C18 (250 mm, µm), phát UV 450 nm, nhiệt độ phòng Ứng dụng quy trình định lượng chế phẩm Bảng 3: Kết thẩm định phương pháp định lượng Carotenoid Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid sinh khối vi khuẩn Canthaxanthin β-caroten Độ xác (n=6) RSD% = 4,26 RSD% = 1,93 Độ (Tỉ lệ hồi 98,53% 99,83% phục, n=9) Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953 Ŷ = 240,5 x + 37,616 R = 0,9953 R = 0,9981 Giới hạn định lượng 0,026 µg/ml 0,049 µg/ml Qui trình định lượng carotenoid thẩm định Hàm lượng Nhóm carotenoid trung RSD carotenoid bình (µg/g) 4,133 Chưa xác định 48,32 ± 0,14 2,92 4,833 Chưa xác định 3,833 Astaxanthin 78,23 ± 0,18 1,34 Chủng vi RT khuẩn (phút) Bacillus indicus Bacillus infantis Bacillus marisflavi 2,631 Chưa xác định 4,582 Canthaxanthin 40,36 ± 0,21 Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid dầu gấc Phá vỡ màng tế bào tán bể siêu Hàm lượng βHàm lượng βâm Chiết carotenoid với hệ dung môi Sản phẩm caroten Trên nhãn caroten định (mg %) lượng (mg%) chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1 Tiến hành Gac Việt Nam 100 42,08 ± 0,52 phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo Dầu gấc PV Không ghi nhãn 10,16 ± 0,13 điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril – Vinaga 150 126,34 ± 2,46 methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM Cột sắc ký: Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid chế phẩm ngoại nhập Sản phẩm Betacarotene Super Antioxidant Beta- carotene Lycopene Tảo Spiruline 186 Nhóm carotenoid β-caroten β-caroten β-caroten Lycopen Zeaxanthin β-caroten Tổng carotenoid 4,14 Hàm lượng Hàm lượng định lượng (mg/viên) nhãn (mg/viên) 15 14,58 ± 0,22 15 14,70 ± 0,31 15 14,52 ± 0,25 10 9,53 ± 0,18 1,89 ± 0,04 2,4 2,29 ± 0,4 7,63 ± 0,09 RSD 1,48 2,13 1,89 1,75 1,98 1,44 1,12 RSD 1,24 1,30 1,94 % hàm lượng 97,23 98,01 95,30 96,79 94,63 95,42 95,33 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KẾT LUẬN Carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn chiết tách phương pháp tán siêu âm đầu dò có hiệu tốt việc phá vỡ màng tế bào với hệ dung mơi thích hợp chloroform-methanol (2:1, tt/tt), hiệu suất chiết đạt khoảng 95% Carotenoid định lượng phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với hệ dung mơi phân tích acetonitril- methanoldichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích 12 phút Qui trình thẩm định đáp ứng yêu cầu tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ lập lại phương pháp phân tích dựa HPLC Áp dụng qui trình thẩm định xác định hàm lượng carotenoid số nguyên liệu vi khuẩn phòng thí nghiệm chế phẩm chứa carotenoid lưu hành: sản phẩm carotenoid nước chưa đạt hàm lượng carotenoid ghi nhãn, chế phẩm ngoại nhập có hàm lượng carotenoid đạt thơng số ghi nhãn Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học TÀI LIỆU THAM KHẢO Asean guideline for for validation of analytical procedures 2008 p 1-17 Barua AB (2001) Improved normal-phase and reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography procedures for the analysis of retinoids and carotenoids in human serum, plant and animal tissues J Chromatogr A, 936(1-2):71-82 Bùi Minh Giao Long, Vũ Thanh Thảo and Trần Cát Đông (2010) Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ biển hô tôm Việt Nam Y học TP Hồ Chí Minh, 2010,14 (1):1-5 Duc Le H, Fraser PD, Tam NK, et al (2006) Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers FEMS Microbiol Lett, 255(2):215-24 Johnson EA and Schroeder WA (1996) Microbial carotenoids Adv Biochem Eng Biotechnol, 1996 53:119-78 Khaneja R., Perez-Fons L, Fakhry S, et al (2010) Carotenoids found in Bacillus Journal of Applied Microbiology, 2010 108(6):1889-1902.(9) Lowe, G M., R F Bilton, I G Davies, et al (1999) Carotenoid composition and antioxidant potential in subfractions of human low-density lipoprotein Ann Clin Biochem, 1999 36:323-32 Trần Hùng (2006) Chuyên đề: Các chất chống oxi hóa tự nhiên Nxb Đại học Y Dược Tp HCM Võ Thị Ngọc Mỹ (2010) Nghiên cứu quy trình thu nhận định lượng carotenoid từ số chủng Bacillus sp 2010, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 20.03.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 187 ... tiến hành q trình thăm dò hệ dung môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5) chúng tơi tiến hành hẩm định quy trình định lượng ứng dụng qui trình thẩm định để định lượng số chế phẩm lưu hành thị trường( 1-Error!... không xác định xác khơng thể xác định hoạt tính chế phẩm Do vấn đề đặt phải xây dựng quy trình chiết tách xác định hàm lượng carotenoid chế phẩm xác định loại carotenoid có chế phẩm để xác định hoạt... khuẩn phòng thí nghiệm chế phẩm chứa carotenoid lưu hành: sản phẩm carotenoid nước chưa đạt hàm lượng carotenoid ghi nhãn, chế phẩm ngoại nhập có hàm lượng carotenoid đạt thơng số ghi nhãn Chuyên