Xây dựng phương pháp định lượng inulin trong một số thực phẩm chức năng bằng HPLC RI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THOA XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC-RI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THOA Mã sinh viên: 1401585 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC-RI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Khoa Hoá thực phẩm-Viện Dinh dưỡng Quốc gia HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức HPLC-RI” hồn thành Để có kết này, nỗ lực thân, em nhận nhiều động viên, giúp đỡ từ phía nhà trường, môn, nơi em thực đề tài- Viện Dinh dưỡng Quốc gia, gia đình bạn bè Trước tiên, em xin bày tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Lâm Hồng, cô tận tình định hướng, bảo, đóng góp ý kiến động viên em suốt trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Lê Hồng Dũng, người trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ tạo điều kiện cho em suốt q trình nghiên cứu, thực khóa luận Bên cạnh đó, em xin gửi lời cám ơn đến anh chị khoa Hóa thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện nhiều cho em thực khóa luận Trong q trình thực hiện, nỗ lực cố gắng khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến bảo, góp ý từ thầy để khóa luận em tiếp tục hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thoa i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vi ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ INULIN .2 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Chất nhồi cột 1.2.3 Detetor RI 1.2.4 Một số phương pháp phân tích Inulin .10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 13 2.2.1 Chất chuẩn 13 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 13 2.2.3 Chuẩn bị dung dịch placebo 14 2.2.4 Dung mơi, hố chất 14 2.2.5 Dụng cụ, thiết bị 14 2.2.6 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 ii 2.3.1 Khảo sát điều kiện HPLC 15 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 15 2.3.3 Thẩm định quy trình 16 2.3.4 Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng Inulin số thực phẩm chức lưu hành thị trường 17 2.4 XỬ LÝ KẾT QUẢ 18 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .18 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .18 3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 18 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 20 3.1.3 Kết 21 3.1.4 Quy trình phân tích Inulin thực phẩm chức 22 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 23 3.2.1 Độ ổn định hệ thống 23 3.2.2 Tính chọn lọc 24 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng .26 3.2.4 Khoảng tuyến tính 27 3.3.5 Độ lặp lại .28 3.2.6 Độ .29 3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THỰC PHẨM CHỨC NĂNG TRÊN THỊ TRƯỜNG 31 3.4 BÀN LUẬN .32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC .39 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hố phân tích communityes FODMAP Fermentable thức oligo-, di-, saccharides and polyols HPLC mono- Các loại saccharid lên men performance Sắc ký lỏng hiệu cao High Liquidchromatography HPTLC High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu cao chromatography HL Hàm lượng HLTN Hàm lượng nhãn LOD Limit of detection Giới hạn định tính LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng RI Refractive index (Detetor) số khúc xạ RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCFAs Short chain fatty acids Các acid béo chuỗi ngắn SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Đặc điểm cột số phân tích Inulin giới Bảng 1.2: Một số phương pháp phân tích Inulin 10 Bảng 2.1: Thành phần 3g mẫu placebo (nền mẫu rắn) .14 Bảng 2.2: Hệ pha động khảo sát 15 Bảng 3.1: Kết khảo sát thời gian chiết kỹ thuật chiết mẫu rắn 22 Bảng 3.2: Kết khảo sát độ lặp lại hệ thống 23 Bảng 3.3: Giá trị S/N pic nạp chuẩn kết LOQ, LOD 26 Bảng 3.4: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Inulin 27 Bảng 3.5: Kết xác định độ lặp lại Inulin 28 Bảng 3.6: Kết xác định độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ thấp .29 Bảng 3.7: Kết xác định độ thu hồi mức nạp chuẩn nồng độ trung bình .30 Bảng 3.8: Kết xác định độ thu hồi với mức nạp chuẩn nồng độ cao 30 Bảng 3.9: Kết phân tích số mẫu thực tế thị trường 31 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc hoá học Inulin Hình 1.2: Một số tác dụng GLP-1 Hình 1.3: Một số thực phẩm chức bổ sung Inulin Hình 1.4: Mơ tượng khúc xạ Hình 1.5: Sơ đồ detector RI Hình 3.1: Sắc ký đồ cột Shodex OHpack SB-806M HQ 18 Hình 3.2: Sắc ký đồ cột Shodex OHpack SB-806M HQ nối với cột Supelcosil LC-NH2 .19 Hình 3.3: Sắc ký đồ hệ ghép nối tiếp cột Shodex OHpack SB-806M HQ 19 Hình 3.4: Sắc ký đồ hệ pha động NaNO3 0,1M .20 Hình 3.5: Sắc ký đồ hệ pha động nước khử ion 18mΩ 20 Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 21 Hình 3.7: Biểu đồ khảo sát thời gian chiết kỹ thuật chiết 21 Hình 3.8: Quy trình xử lý mẫu .23 Hình 3.9: Sắc ký đồ dung dich chuẩn Inulin 1000 ppm chồng lên 24 Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu trắng 25 Hình 3.11: Sắc ký đồ chuẩn Inulin 1000 ppm .25 Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu placebo 25 Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn Inulin 200 ppm 26 Hình 3.14: Giá trị S/N Inulin mẫu nạp chuẩn Inulin 125 ppm .27 Hình 3.15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ Inulin .28 Hình 3.16: Quy trình xử lý mẫu 34 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội phát triển nhu cầu bảo vệ nâng cao sức khoẻ ngày quan tâm Nhiều nhà sản xuất có xu hướng nghiên cứu, phát triển đưa thị trường thực phẩm chức có bổ sung chất xơ cân dinh dưỡng để góp phần cải thiện bệnh béo phì, tiểu đường, táo bón, …Một sản phẩm thực phẩm chức có bổ sung Inulin – loại chất xơ hồ tan có nguồn gốc từ thực vật Inulin loại polymer fructose, bổ sung hàng ngày đem lại nhiều lợi ích cho người sử dụng Tuy nhiên, nước ta,việc định lượng Inulin chưa có phương pháp cụ nhu cầu sử dụng thực phẩm chức bổ sung Inulin ngày tăng Trong hồn cảnh đó, u cầu đặt cho nhà quản lý cần có phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm chức bổ sung Inulin nhằm kiểm tra, giám sát chất lượng, đem lại tin tưởng cho người dùng đảm bảo chất lượng cho nhà sản xuất Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định lượng Inulin thực phẩm chức cần thiết Chúng tơi tiến hành nghiên cứu khố luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức HPLC-RI” nhằm góp phần kiểm tra, giám sát chất lượng chế phẩm có bổ sung Inulin với hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra số mẫu thực phẩm chức bổ sung Inulin lưu hành thị trường CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ INULIN Inulin nhóm polymer fructose, tan nước Các monomer liên kết với liên kết β (2-1) glycosid Vì vậy, Inulin khơng bị tiêu hố người động vật bậc cao khơng có emzym inulinase, nhiên lại tiêu hoá số vi sinh vật đường ruột L.acidophilus, tạo sản phẩm trao đổi chất có giá trị [7], [26] Inulin thực vật chứa – 60 đơn vị fructose Độ dài chuỗi phụ thuộc vào loài thực vật thời điểm vòng đời Inulin tìm thấy nhiều loài thực vật như: rễ rau diếp xoăn (36 – 48%), tỏi (9 – 16%), măng tây (2 – 3%)… Inulin số thực vật sử dụng cách dự trữ lượng Hầu hết loài thực vật tổng hợp dự trữ Inulin không dự trữ cacbonhydrat khác tinh bột [6] Hình 1.1: Cấu trúc hố học Inulin - Cơng thức phân tử: C6nH10n+2O5n+1, n từ – 61 - Tính chất: • Bột màu trắng, khơng mùi, dễ hút ấm • Tan tốt nước, độ tan 120 g/L (25℃) • Nhiệt độ nóng chảy: 165 – 180 ℃ • Nhiệt độ chuyển kính: 125 – 140 ℃ - Tác dụng dược lý: cầu dòng pha động phải ổn định, chất tan để loại bỏ yếu tố nhiễu Để có hiệu tốt, trước tiến hành chạy sắc ký nên có thời gian cân hợp lý để detector ổn định pha động Dung môi chạy sắc ký 100% nước khử ion Việc khử ion giúp loại bỏ ảnh hưởng ion lên đường nền, giảm bớt yếu tố nhiễu Nước khử ion dung mơi sạch, hầu hết phòng thí nghiệm tự cung cấp Vì vậy, việc sử dụng nước khử ion làm dung môi không giúp tiết kiệm chi phí mà góp phần bảo vệ mơi trường Điều kiện sắc ký xây dựng có ưu điểm đơn giản, sử dụng hố chất Kết thẩm định phương pháp cho thấy chương trình chạy sắc ký xây dựng đáng tin cậy 3.4.3 Phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức HPLC-RI HPLC kỹ thuật định lượng có độ xác ổn định cao Ngày nay, hầu hết phòng thí nghiệm trang bị thiết bị Do vậy, việc sử dụng HPLC làm kỹ thuật phân tích đem lại tính khả thi cao, dễ áp dụng vào thực tế Phương pháp xây dựng có giới hạn định lượng 25mg/g mẫu, 125 ppm nồng độ tiêm sắc ký Đây kết đáng tin cậy tốt so với nghiên cứu Petkova N cộng với giới hạn định lượng 230 ppm nồng độ tiêm sắc ký [29] Mỗi sản phẩm thực phẩm chức có thành phần hàm lượng khác Do vậy, với mẫu, định lượng cần tiến hành thẩm định lại phương pháp để có kết tin cậy 3.4.4 Khảo sát số mẫu thực phẩm chức bổ sung Inulin lưu hành thị trường Trong mẫu khảo sát, có mẫu có chứa Inulin với hàm lượng so với hàm lượng ghi nhãn đạt 97,4% 72,2%, có mẫu khơng phát Inulin Cần tiếp tục khảo sát mẫu thực phẩm chức khác thị trường để có đánh giá khách quan hàm lượng Inulin sản phẩm thực phẩm chức có bổ sung Inulin KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 33 Từ kết nghiên cứu, đề tài có kết luận sau: 1.1 Đã khảo sát quy trình định lượng Inulin thực phẩm chức - Quy trình xử lý mẫu thể qua hình sau: Mẫu thực phẩm chức đồng Cân xác khoảng 0,25g mẫu vào bình nón Thêm 40 ml H2O, điều chỉnh pH - Siêu âm 30 phút, trì nhiệt độ phòng Chuyển dich chiết vào bình định mức 50ml Lọc, pha lỗng đến nồng độ khoảng tuyến tính Lọc qua màng lọc 0,45µm, tiêm vào hệ thống sắc ký Hình 3.16: Quy trình xử lý mẫu - Điều kiện HPLC • Pha tĩnh: Cột Shodex OHpak SB-806M HQ • Pha động: Nước kh ion 18m Th tớch tiờm mu: 10àL Tốc độ: ml/phút • Nhiệt độ cột: 40oC • Nhiệt độ detector: 40oC 1.2 Đã thẩm định quy tình định lượng theo yêu cầu AOAC 2016 Kết thẩm định: - Phương pháp có tính chọn lọc tốt Inulin - Có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic sắc ký nồng độ Inulin: khoảng nồng độ từ 125 ppm tới 5000 ppm, r=0,999 - Phương pháp có độ nhạy tốt để phát Inulin, LOQ = 25 mg/g, LOD= 8,3 mg/g 34 - Phương pháp có độ lặp lại mức nồng độ thấp, trung bình cao đáp ứng yêu cầu AOAC 2016 - Phương pháp có độ thu hồi tốt (95% – 99 %), đáp ứng yêu cầu AOAC 2016 1.3 Đã định lượng Inulin mẫu thực phẩm chức bổ sung Inulin thị trường Kết phân tích thực tế cho thấy, xuất số mẫu hàm lượng Inulin không tương ứng với hàm lượng công bố bao bì, chí có mẫu khơng phát Inulin thành phần Kiến nghị Dựa vào kết từ khố luận, chúng tơi xin đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục thẩm định phương pháp nhiều mẫu khác Tiếp tục khảo sát hàm lượng Inulin mẫu thực phẩm chức bổ sung Inulin thị trường 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 10 11 12 13 14 15 Bộ Y tế (2012), Hố phân tích, Tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 123-200 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 10-59 Abrams S A., Griffin I J., et al (2005), "A combination of prebiotic short- and long-chain inulin-type fructans enhances calcium absorption and bone mineralization in young adolescents", Am J Clin Nutr, 82(2), pp 471-6 Analysis AOAC Official method of (2016), "Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements" Arora T., Loo R L., et al (2012), "Differential effects of two fermentable carbohydrates on central appetite regulation and body composition", PLoS One, 7(8), pp e43263 Barclay Thomas, Ginic-Markovic Milena, et al (2016), "Inulin-a versatile polysaccharide with multiple pharmaceutical and food chemical uses", Journal of Excipients and Food Chemicals, 1(3), pp 1132 Barclay Thomas, Ginic-Markovic Milena, et al (2012), "Analysis of the hydrolysis of inulin using real time 1H NMR spectroscopy", Carbohydrate research, 352, pp 117-125 Bonnema A L., Kolberg L W., et al (2010), "Gastrointestinal tolerance of chicory inulin products", J Am Diet Assoc, 110(6), pp 865-8 Butler Alexandra E, Janson Juliette, et al (2003), "β-cell deficit and increased βcell apoptosis in humans with type diabetes", Diabetes, 52(1), pp 102-110 Chambers E S., Viardot A., et al (2015), "Effects of targeted delivery of propionate to the human colon on appetite regulation, body weight maintenance and adiposity in overweight adults", Gut, 64(11), pp 1744-54 Collado Yurrita L., San Mauro Martin I., et al (2014), "Effectiveness of inulin intake on indicators of chronic constipation; a meta-analysis of controlled randomized clinical trials", Nutr Hosp, 30(2), pp 244-52 Dehghan P., Pourghassem Gargari B., et al (2013), "Effects of high performance inulin supplementation on glycemic status and lipid profile in women with type diabetes: a randomized, placebo-controlled clinical trial", Health Promot Perspect, 3(1), pp 55-63 Delzenne Nathalie M, Cani Patrice D, et al (2005), "Impact of inulin and oligofructose on gastrointestinal peptides", British Journal of Nutrition, 93(S1), pp S157-S161 Dewulf E M., Cani P D., et al (2013), "Insight into the prebiotic concept: lessons from an exploratory, double blind intervention study with inulin-type fructans in obese women", Gut, 62(8), pp 1112-21 Gibson G R., Probert H M., et al (2004), "Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics", Nutr Res Rev, 17(2), pp 259-75 36 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Goncalves P., Martel F (2013), "Butyrate and colorectal cancer: the role of butyrate transport", Curr Drug Metab, 14(9), pp 994-1008 Griffin I J., Davila P M., et al (2002), "Non-digestible oligosaccharides and calcium absorption in girls with adequate calcium intakes", Br J Nutr, 87 Suppl 2, pp S187-91 Guess N D., Dornhorst A., et al (2015), "A randomized controlled trial: the effect of inulin on weight management and ectopic fat in subjects with prediabetes", Nutr Metab (Lond), 12, pp 36 Guess N D., Dornhorst A., et al (2016), "A Randomised Crossover Trial: The Effect of Inulin on Glucose Homeostasis in Subtypes of Prediabetes", Ann Nutr Metab, 68(1), pp 26-34 Kristo E, Foo A, et al (2011), "Determination of inulin in milk using highperformance liquid chromatography with evaporative light scattering detection", Journal of dairy science, 94(7), pp 3316-3321 Legette L L., Lee W., et al (2012), "Prebiotics enhance magnesium absorption and inulin-based fibers exert chronic effects on calcium utilization in a postmenopausal rodent model", J Food Sci, 77(4), pp H88-94 Li Wancong, Zhang Jun, et al (2015), "Extraction, degree of polymerization determination and prebiotic effect evaluation of inulin from Jerusalem artichoke", Carbohydrate polymers, 121, pp 315-319 Linetzky Waitzberg D., Alves Pereira C C., et al (2012), "Microbiota benefits after inulin and partially hydrolized guar gum supplementation: a randomized clinical trial in constipated women", Nutr Hosp, 27(1), pp 123-9 Manrique Vergara D., Gonzalez Sanchez M E (2017), "Short chain fatty acids (butyric acid) and intestinal diseases", Nutr Hosp, 34(Suppl 4), pp 58-61 Marteau P., Jacobs H., et al (2011), "Effects of chicory inulin in constipated elderly people: a double-blind controlled trial", Int J Food Sci Nutr, 62(2), pp 164-70 Meyer D., Stasse-Wolthuis M (2009), "The bifidogenic effect of inulin and oligofructose and its consequences for gut health", Eur J Clin Nutr, 63(11), pp 1277-89 Nolin Thomas D, Colaizzi Ivan V, et al (2002), "Rapid microtiter plate assay for determination of inulin in human plasma and dialysate", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 28(2), pp 209-215 Parnell J A., Reimer R A (2009), "Weight loss during oligofructose supplementation is associated with decreased ghrelin and increased peptide YY in overweight and obese adults", Am J Clin Nutr, 89(6), pp 1751-9 Petkova N, Vrancheva R, et al (2014), "HPLC-RID method for determination of inulin and fructooligosacharides", Acta Scientifica Naturalis, 1(99), pp 107 Pourghassem Gargari B., Dehghan P., et al (2013), "Effects of high performance inulin supplementation on glycemic control and antioxidant status in women with type diabetes", Diabetes Metab J, 37(2), pp 140-8 Prošek Mirko, Simonovska Breda, et al (2003), "Use of HPTLC for quantitative evaluation of inulin in food products", JPC-Journal of Planar ChromatographyModern TLC, 16(1), pp 58-62 37 32 33 34 35 36 37 38 Quemener Bernard, Thibault Jean-Franỗois, et al (1997), "Integration of inulin determination in the AOAC method for measurement of total dietary fibre", International journal of biological macromolecules, 21(1-2), pp 175-178 Reiffová Katarína, Nemcová Radomíra (2006), "Thin-layer chromatography analysis of fructooligosaccharides in biological samples", Journal of Chromatography A, 1110(1-2), pp 214-221 Retnaningtyas Yuni (2012), "Determination of inulin from multivitamin syrup product by high performance liquid chromatography with RI detector", Indonesian Journal of Chemistry, 12(2), pp 201-205 Ripoll C., Flourie B., et al (2010), "Gastrointestinal tolerance to an inulin-rich soluble roasted chicory extract after consumption in healthy subjects", Nutrition, 26(7-8), pp 799-803 Vlaseva Radka, Ivanova Mihaela, et al (2014), "Analysis of fermented lactic acid dairy products enriched with inulin-type fructans", Scientific Bulletin Series F Biotechnologies, 18, pp 145-149 Wang Quanzhen, Liu Yuyan, et al (2011), "Optimization of ultrasonic-assisted extraction for herbicidal activity of chicory root extracts", Industrial Crops and Products, 34(3), pp 1429-1438 Zuleta Angela, Sambucetti María E (2001), "Inulin determination for food labeling", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(10), pp 4570-4572 38 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT Chiết siêu âm 15 phút Chiết siêu âm 30 phút Chiết siêu âm 45 phút 39 Chiết siêu âm 60 phút Chiết cách thuỷ 15 phút Chiết cách thuỷ 30 phút Chiết cách thuỷ 45 phút 40 Chiết cách thuỷ 60 phút PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ KHOẢNG TUYẾN TÍNH Chuẩn Inulin 125 ppm Chuẩn Inulin 250 ppm 41 Chuẩn Inulin 500 ppm Chuẩn Inulin 1000 ppm Chuẩn Inulin 2500 ppm Chuẩn Inulin 5000 ppm 42 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU TRÊN NỀN MẪU LỎNG Mẫu thực phẩm chức đồng Hút xác khoảng 10 ml mẫu vào bình nón Thêm 40 ml H2O, điều chỉnh pH - Siêu âm 30 phút, trì nhiệt độ phòng Chuyển dich chiết vào bình định mức 50ml Lọc, pha loãng đến nồng độ khoảng tuyến tính Lọc qua màng lọc 0,45µm, tiêm vào hệ thống sắc ký PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỊ TRƯỜNG Mẫu MR01 43 Mẫu MR02 Mẫu ML01 Mẫu ML02 PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC BÀO CHẾ CÁC MẪU THỊ TRƯỜNG Công thức bào chế mẫu MR01 Thành phần Hàm lượng Inulin 1000 mg Lactobacillus acidophilus 105 – 106 CFU Glucose, saccarose, hương liệu Vừa đủ 3g Công thức bào chế mẫu MR02 Thành phần Hàm lượng Inulin 2500 mg Vitamin B1 0,6 mg Vitamin B2 0,9 mg Vitamin B6 0,3 mg Saccarose, kem sữa non, flavor Vừa đủ 4g 44 Công thức bào chế mẫu ML01 Thành phần Hàm lượng Calci lactat 50 mg Inulin 50 mg Lysin 40 mg Thymomodulin 10 mg Vitamin D3 200 UI Vitamin B1 mg Vitamin B6 mg Vitamin B12 µg Đường, nước cất vừa đủ Vừa đủ 10 ml Công thức bào chế mẫu ML02 Thành phần Hàm lượng Inulin 100 mg Cao phan tả diệp 50 mg Cao diếp cá 50 mg Saccarose, nước cất, hương liệu vừa đủ 10 ml Dạng bào chế mẫu STT Mã mẫu Dạng bào chế MR01 Bột hoà tan MR02 Bột hoà tan ML01 Dung dịch uống ML02 Dung dịch uống 45 PHỤ LỤC 6: Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) phân tích 100 100% 1,3 ≥ 10 10-1 10% 1,9 ≥1 10-2 1% 2,7 ≥ 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10ppb 21 10 0,0000001 10-9 ppb 30 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%) phân tích 100 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 46 47 ... phẩm có bổ sung Inulin với hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra số mẫu thực phẩm chức bổ sung Inulin lưu hành... viên: 1401585 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG INULIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC- RI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện:... thực phẩm chức cần thiết Chúng tiến hành nghiên cứu khoá luận tốt nghiệp Xây dựng phương pháp định lượng Inulin số thực phẩm chức HPLC- RI nhằm góp phần kiểm tra, giám sát chất lượng chế phẩm