Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng axit béo trong dầu hạt mơ để ứng dụng vào đánh giá chất lượng sản phẩm trong quá trình sản xuất dầu hạt mơ cũng như các sản phẩm chứa dầu hạt mơ.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ AXÍT BÉO TRONG DẦU HẠT MƠ (PRUNUS ARMENIACA) BẰNG SẮC KÍ KHÍ Vũ Bình Dương* TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng axít béo dầu hạt mơ phương pháp sắc ký khí Đối tượng: dầu hạt mơ Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời axít béo dầu hạt mơ Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn Dược điển Việt Nam IV, ICH USP-34 Kết quả: xác định điều kiện sắc ký thích hợp định lượng đồng thời axít béo dầu hạt mơ gồm: cột ZB-Wax column (30 m ì 0,25 mm, film thickness 0,25 àm) vi khớ mang nitơ, tốc độ pha động 1,0 ml/phút sử dụng detector ion hóa lửa (FID) Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát (LOD), độ đúng, độ xác Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng axít béo dầu hạt mơ phương pháp sắc ký khí Phương pháp áp dụng để kiểm nghiệm chất lượng dầu hạt mơ * Từ khóa: Dầu hạt mơ; Sắc ký khí; Axít béo Simultaneous Quantification of some Fatty Acid in Prunus Armeniaca using Gas Chromatography Summary Purposes: Establishment and validation of quantification of fatty acid constituents in Prunus armeniaca kernels oil using gas chromatographic - Flame ionization detector (GC-FID) Objectives: Prunus armeniaca kernels oil Methods: Validation of quantitative method follows th Guideline of Vietnamese Pharmacopoeia edition , ICH (International Conferences of Harmonisation) and USP-34 Results: Chromatographic condition was identified including column as ZB-Wax column (30 m × 0.25 mm, film thickness 0.25 µm), carry gas as nitrogen with flow rate of 1.0 ml/min The signals picks was determinated on FID detector This method was validated releaving that it was ensured of suitability of system, accuracy, precision (inter and extra-day), selectibility, curve calibration, LOD and LOQ Conclusions: A quantitative method of fatty acids from Prunus armeniaca kernels oil was established and validated completely It can be applied to quality control of Prunus armeniaca kernels oil * Key words: Prunus armeniaca; Gas chromatography; Fatty acid * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 22/01/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 09/02/2015 Ngày báo đăng: 26/02/2015 123 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Hạt mơ (Prunus armeniaca) loại nguyên liệu có giá trị kinh tế cao cơng nghệ thực phẩm mỹ phẩm Những thập niên gần đây, hạt mơ sử dụng sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel) [3, 4] Với thành phần axít béo gồm oleic, linoleic, linolenic, palmitic, arachidonic behenic, dầu hạt mơ có tác dụng giữ ẩm, làm mềm da, chống viêm tốt cho da [3] Vùng Tây Bắc nước ta với khí hậu đặc thù có khả phát triển thành vùng chuyên canh trồng mơ có tiềm mang lại nguồn nguyên liệu dồi Tuy nhiên, nước chưa có nghiên cứu đánh giá thành phần axít béo dầu hạt mơ để đưa luận khoa học cho đánh giá chất lượng dầu mơ sản xuất nước Vì vậy, nghiên cứu nhằm: Xây dựng phương pháp định lượng axit béo dầu hạt mơ để ứng dụng vào đánh giá chất lượng sản phẩm trình sản xuất dầu hạt mơ sản phẩm chứa dầu hạt mơ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu - Hạt mơ sau thu hái tỉnh Sơn La sơ chế, loại tạp học, sấy khô chiết xuất dầu CO2 lỏng siêu tới hạn; chất chuẩn axít béo gồm palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic, arachidic behedic Sigma Aldrich cung cấp (hàm lượng > 99,0%) Dung môi gồm methanol (MeOH), axit acetic, acetonitril (ACN), nước cất đạt tiêu chuẩn 124 HPLC Các hóa chất dung mơi khác n-hexan, dichloromethan (DCM) aceton, NaCl, H2SO4… đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) Khí nitơ đạt tiêu chuẩn sắc ký khí với độ tinh khiết > 99,9% Các hóa chất, dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phân tích - Hệ thống chiết siêu tới hạn SFX System 2120 (Isco Inc., Lincoln - Mỹ); hệ thống sắc ký khí (HP 5890 series II, detector FID) gồm cột ZB-Wax (30 m x 0,25 mm, film thickness 0,25 µm) Phƣơng pháp nghiên cứu * Định lượng đồng thời axít béo dầu hạt mơ: - Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân xác 10,0 mg chất chuẩn axít béo hòa tan dung dịch 14% BF3/MeOH Dung dịch gia nhiệt 1000C phút Sau đó, làm lạnh thêm ml nước cất ml n-hexan, trộn máy lắc xoáy phút Ly tâm hỗn hợp 3.000 rpm x 15 phút Bỏ pha nước, thu lấy pha n-hexan thu hỗn hợp chuẩn Stock có nồng độ 5.000 ppm Bảo quản hỗn hợp chuẩn -200C Chuẩn nghiên cứu pha loãng n-hexan từ chuẩn stock - Chuẩn bị mẫu thử: khoảng 100,0 mg dầu hạt mơ thêm ml n-hexan Sau đó, thêm 0,1 ml dung dịch KOH 2N pha MeOH Trộn máy lắc vortex phút, ly tâm 3.000 rpm x 15 phút Pha n-hexan giữ lại pha loãng lần Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước phân tích GC - Mẫu trắng: tiến hành mẫu thử, khác khơng có dầu hạt mơ TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 - Điều kiện sắc ký: hệ thống sắc ký khí (HP 5890 series II, detector FID) gồm cột ZB-Wax (30 m x 0,25 mm, film thickness 0,25 µm) Khí mang nitơ với tốc độ 1,0 ml/phút Tỷ lệ chia dòng 1:20 Nhiệt độ injector detector đặt 2500C Buồng gia nhiệt ban đầu đặt 1600C tăng lên tới 2000C với tốc độ 100C/phút Sau nhiệt độ tăng lên 2400C với tốc độ 50C/phút Duy trì nhiệt độ 10 phút * Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời axít béo hạt mơ: Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời axít béo dầu hạt mơ thực theo Hướng dẫn Cục Quản lý Dược Việt Nam, ICH Dược điển Mỹ USP-34 [1, 2, 5, 6] - Tính tương thích hệ thống: phân tích lần liên tiếp mẫu hỗn hợp chuẩn có nồng độ 10 µg/ml axít béo theo điều kiện RSD thời gian lưu diện tích pic - Tính chọn lọc - đặc hiệu: phân tích đồng thời mẫu trắng, hỗn hợp chuẩn axít béo, mẫu thử dầu hạt mơ điều kiện để đánh giá tính chọn lọc đặc hiệu phương pháp - Khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD): chuẩn bị dãy hỗn hợp chuẩn axít béo có nồng độ từ 0,1; 1,0; 10,0; 100,0; 1.000,0 µg/ml Phân tích sắc ký theo điều kiện xác định Xác định mối quan hệ tuyến tính nồng độ chuẩn axít béo diện tích đáp ứng pic tương ứng LOD LOQ ngoại suy từ độ lệch chuẩn mẫu trắng so với độ dốc đường tuyến tính LOD = 3,3 × SD/δ; LOQ = 10 × SD/δ Trong đó, δ độ dốc đường tuyến tính, SD độ lệch chuẩn giao trục tung đường tuyến tính - Độ độ xác: xác định độ độ xác dựa vào phân tích mẫu kiểm soát nồng độ khác đường chuẩn: LQC (1,0 µg/ml), MQC (10,0 µg/ml), HQC (1.000 µg/ml) Chuẩn bị dãy mẫu kiểm soát - Xử lý số liệu: phân tích thống kê phần mềm Microsoft Excel Office 2010 Origin Pro 8.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời axít béo dầu hạt mơ Bảng 1: Kết đánh giá tính tương thích hệ thống sắc ký (n = 5) 125 AXÍT BÉO DIỆN TÍCH PIC (X ± SD) RSD DIỆN TÍCH PIC (%) THỜI GIAN LƯU (X ± SD) RSD THỜI GIAN LƯU (%) Axít palmitic 3.460,59 ± 5,7 0,16 6,029 ± 0,074 1,23 Axít stearic 2.820,79 ± 4,7 0,17 7,976 ± 0,087 1,09 Axít oleic 2.882,71 ± 6,4 0,22 8,194 ± 0,099 1,21 Axít linoleic 3.382,13 ± 5,2 0,15 8,700 ± 0,089 1,02 Axít linolenic 2.352,18 ± 4,1 0,17 9,433 ± 0,102 1,08 Axít arachidonic 2.598,47 ± 6,9 0,26 10,212 ± 0,088 0,86 Axít behenic 2.274,7 ± 7,4 0,33 12,645 ± 0,092 0,72 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 - Tính tương thích hệ thống: Kết phân tích lần liên tiếp hỗn hợp chuẩn axít béo nồng độ 10 µg/ml cho thấy: thời gian lưu diện tích pic axít béo phân tích có RSD < 2% Như vậy, phương pháp phân tích hồn tồn tương thích với hệ thống sắc ký sử dụng - Tính chọn lọc đặc hiệu: a b c Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), hỗn hợp chuẩn axít béo (b), dầu hạt mơ (c) Kết phân tích mẫu trắng, mẫu hỗn hợp chuẩn axít béo, mẫu thử dầu hạt mơ cho thấy: vị trí xuất pic axít béo mẫu chuẩn, mẫu trắng khơng xuất pic tương ứng Đồng thời, sắc ký đồ mẫu thử dầu hạt mơ cho thấy xuất pic có thời gian lưu tương ứng với pic chuẩn axít béo; pic cân đối, sắc nét, tách hoàn toàn khỏi Phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu tính chọn lọc đặc hiệu - Khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng: 126 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Bảng 2: Kết xây dựng đường tuyến tính xác định LOD LOQ axít béo dầu chiết siêu tới hạn hạnh nhân hạt mơ AXÍT BÉO ĐƯỜNG CHUẨN R Axít palmitic Y = 234,20X + 1118,26 Axít stearic LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) 0,9999 6,23 20,77 Y = 230,70X + 514,98 0,9999 11,15 36,60 Axít oleic Y = 221,79X + 669,04 0,9998 3,77 11,90 Axít linoleic Y = 216,47X + 1217,77 0,9998 7,05 21,71 Axít linolenic Y = 204,41X + 310,87 0,9999 5,58 16,21 Axít arachidonic Y = 220,02X + 397,45 0,9999 4,99 15,62 Axít behenic Y = 209,89X + 175,75 0,9998 9,84 29,34 Phân tích liên tiếp dãy đường chuẩn hỗn hợp axít béo có nồng độ từ 0,1 µg/ml đến 1.000,0 µg/ml Đánh giá mối tương quan nồng độ diện tích pic axít béo cho thấy: đường hồi quy đường thẳng với hệ số tương quan R ≈ (> 0,98), đáp ứng yêu cầu đường chuẩn phân tích định lượng Căn vào độ lệch chuẩn giao trục tung (intercept) độ dốc đường tuyến tính, chúng tơi xác định LOD LOQ axít béo theo điều kiện sắc ký Diện tích pic (AU) 2.5x10 2.0x10 1.5x10 1.0x10 5.0x10 acid palmitic acid stearic acid oleic acid linoleic acid linolenic acid arachidonic acid behenic 5 5 0.0 200 400 600 800 1000 Nồng độ (µg/ml) Hình 2: Đường chuẩn thể mối liên hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic axít béo Độ độ xác thực dựa vào phân tích mẫu kiểm sốt chuẩn axít béo với nồng độ khác nhau: LQC (1,0 µg/ml), MQC (10,0 µg/ml); HQC (100,0 µg/ml) Xác định độ tỷ lệ % nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn so với nồng độ thực tế Độ xác xác định độ lệch chuẩn nồng độ axít béo ngoại suy từ đường tuyến tính 127 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 Bảng 3: Kết đánh giá độ độ lặp lại ngày khác ngày TRONG NGÀY (n = 5) AXÍT BÉO NỒNG ĐỘ BIỂU KIẾN Nộng độ ngoại suy Độ (%) KHÁC NGÀY (n = 5) RSD (%) (X ± SD) 1,0 Axít palmitic Axít stearic Axít oleic Axít linoleic Axít linolenic Axít arachidonic Axít behenic Nộng độ ngoại suy Độ (%) RSD (%) 0,97 ± 0,02 97,41 2,06 (X ± SD) 0,99 ± 0,02 99,34 2,02 10,0 10,11 ± 0,11 101,12 1,09 9,92 ± 0,13 99,24 1,31 100,0 101,98 ± 1,67 101,98 1,63 99,88 ± 1,39 99,88 1,39 1,0 0,95 ± 0,03 95,34 3,15 0,95 ± 0,03 95,43 3,16 10,0 9,79 ± 0,19 97,91 1,94 9,75 ± 0,11 97,53 1,12 100,0 97,83 ± 1,35 97,83 1,38 97,81 ± 1,58 97,81 1,61 1,0 0,95 ± 0,02 95,29 2,10 0,94 ± 0,03 94,46 3,19 10,0 10,21 ± 0,18 102,11 1,76 10,00 ± 0,17 100,00 1,70 100,0 98,24 ± 1,47 98,24 1,49 97,51± 1,42 97,51 1,45 1,0 1,04 ± 0,04 104,12 3,85 0,98 ± 0,02 98,38 2,04 10,0 10,27 ± 0,19 102,71 1,85 9,95 ± 0,10 99,55 1,00 100,0 100,04 ± 1,49 100,04 1,49 99,94 ± 1,43 99,94 1,43 1,0 0,97 ± 0,04 97,24 4,12 0,97 ± 0,02 97,44 2,06 10,0 9,87 ± 0,18 98,73 1,82 9,75 ± 0,11 97,51 1,12 100,0 99,14 ± 1,52 99,14 1,53 98,21 ± 1,44 98,21 1,46 1,0 0,97 ± 0,01 97,29 1,03 0,94 ± 0,02 99,43 1,20 10,0 10,18 ± 0,11 101,82 1,08 10,00 ± 0,16 100,01 2,12 100,0 96,82 ± 0,95 96,82 0,98 99,59 ± 1,63 99,59 1,64 1,0 1,01 ± 0,04 101,28 3,96 0,98 ± 0,03 98,33 3,06 10,0 9,64 ± 0,09 96,40 0,93 9,61 ± 0,15 96,12 1,56 100,0 100,75 ± 1,12 100,75 1,11 99,84 ± 0,51 99,84 0,51 Kết cho thấy: điều kiện ngày khác ngày, độ phương pháp đạt > 95% axít béo đơn lẻ Độ lặp lại ngày khác ngày phương pháp xác định với hệ số RSD nhỏ Kết phù hợp với nghiên cứu trước (RSD < 5%) [8] Như vậy, phương pháp đáp ứng yêu cầu độ độ xác phép phân tích định lượng BÀN LUẬN Phân tích axít béo dầu thực vật thực phương pháp HPLC GC Cả phương pháp phải tạo dẫn xuất trung gian Tuy nhiên, với phương pháp HPLC, axít 128 béo hấp thụ ánh sáng UV/VIS huỳnh quang, ảnh hưởng đến giới hạn phát phương pháp Vì vậy, người ta thường tạo dẫn xuất có khả hấp thụ (chromatophore) phát quang (luminiphore) để tăng độ nhạy phương pháp Ngoài ra, pic thường bị TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 kéo q trình xử lý mẫu phức tạp trải qua nhiều giai đoạn làm mẫu [7] Nghiên cứu sử dụng detector ion hóa lửa (FID) khắc phục nhược điểm phương pháp thường quy, áp dụng rộng rãi để phân tích đồng thời axít béo dầu mỡ [7] Phương pháp định lượng đồng thời axít béo nghiên cứu thẩm định đầy đủ theo yêu cầu Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích ICH, USP-34 Bộ Y tế Việt Nam [1, 2, 6] Kết thực nghiệm chứng minh quy trình phân tích có độ độ xác cao, đảm bảo yêu cầu tính chọn lọc, đặc hiệu hồn tồn có đủ lực để phân tích axít béo có dầu hạt mơ Bộ Y tế Việt Nam với độ (> 95%) độ xác (RSD < 5%) đạt yêu cầu KẾT LUẬN ICH Validation of analytical procedures: text and methodology Q2R1 2005 Đã xây dựng thẩm định phương pháp định lượng axít béo dầu hạt mơ (Prunus armeniaca) sắc ký khí Kết khảo sát lựa chọn điều kiện cho sắc ký gồm: cột ZBWax column (30 m × 0,25 mm, film thickness 0,25 µm) với khí mang nitơ đạt tốc độ pha động ml/phút sử dụng detector ion hóa lửa (FID) Phương pháp định lượng thẩm định theo hướng dẫn ICH, USP-34 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Hà Nội 2009 Cục Quản lý Dược - Bộ Y tế Sổ tay Hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc Ban hành kèm theo định số 229/QĐ-QLD ngày 12 tháng 08 năm 2010 2010 I Vermaak et al African seed oils of commercial importance Cosmetic applications South African Journal of Botany 2011, 77, pp.920-993 Dilip Kumar Bora et al Assessment of tree seed oil biodiesel: A comparative review based on biodiesel of a locally available tree seed Renewable and sustainable energy reviews 2012, 16, pp.1616-1629 USP 34- NF29 The United States Pharmacopeial Convention 2011 IUPAC Standard methods for analysis of oils, fats and derivatives Blackwell Scientific Publications, seventh ed., IUPAC Method 2.301 Report of IUPAC Working Group WG 2/87 1987 T Seppänen-Laakso et al Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition Analytica Chimica Acta 2002, 465, pp.39-62 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015 126 ... 50C/phút Duy trì nhiệt độ 10 phút * Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời axít béo hạt mơ: Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời axít béo dầu hạt mơ thực theo Hướng dẫn Cục Quản lý Dược... cứu nhằm: Xây dựng phương pháp định lượng axit béo dầu hạt mơ để ứng dụng vào đánh giá chất lượng sản phẩm trình sản xuất dầu hạt mơ sản phẩm chứa dầu hạt mơ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN... điểm phương pháp thường quy, áp dụng rộng rãi để phân tích đồng thời axít béo dầu mỡ [7] Phương pháp định lượng đồng thời axít béo nghiên cứu thẩm định đầy đủ theo yêu cầu Hướng dẫn thẩm định