Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lumivudin zidovudin và nevirapin trong chế phẩm viên nén bằng MEKC

DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin 2 Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin 3 Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng 4 Kết quả khảo sá

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG LAN HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN, ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI, 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG LAN HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN, ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Thùy Linh

Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI, 2013

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích - Độc chất trường Đại học dược Hà Nội

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thị Thùy

Linh, người đã tận tâm dìu dắt, chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu và

hoàn thành khóa luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích - Độc chất đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã hết lòng giúp đỡ và động viên em hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 02 năm 2013

Sinh viên Vương Lan Hương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin 3

1.1.1 Tổng quan chung 3

1.1.2 Dược động học 4

1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV 6

1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản 8

1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản 8

1.2.2 Các kiểu điện di mao quản 10

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di 12

1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC) 12

1.2.5 Ưu - nhược điểm của MEKC 17

1.3 Một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT & NVP 18

1.3.1 Phương pháp HPLC 18

1.3.2 Phương pháp CE 20

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Điều kiện nghiên cứu 21

2.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu 21

2.1.2 Hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 23

2.2 Đối tượng nghiên cứu 23

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.1 Lựa chọn điều kiện điện di tối ưu 27

3.1.1 Lựa chọn bước sóng 27

3.1.2 Điều kiện điện di 28

3.1.3 Lựa chọn phương pháp bơm mẫu 29

3.1.4 Lựa chọn kiểu điện di 30

3.1.5 Lựa chọn dung dịch điện ly nền 31

3.1.6 Khảo sát điều kiện pH của dung dịch điện ly nền 32

3.1.7 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền 35

3.1.8 Khảo sát nồng độ chất tạo micelle SDS 37

3.1.9 Khảo sát thế đặt vào hai đầu mao quản 39

3.1.10 Khảo sát áp suất tiêm mẫu 41

3.1.11 Định tính Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin trong điều kiện điện di đã được thiết lập 43

3.1.12 Kết luận 45

3.2 Thẩm định phương pháp 45

3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống 45

3.2.2 Tính đặc hiệu 46

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính 48

3.2.4 Độ lặp lại của phương pháp 52

3.2.5 Độ đúng của phương pháp 54

3.3 Ứng dụng định lượng trong chế phẩm 56

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề xuất 59

CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)

CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)

CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

C max Nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương

DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector)

EOF Dòng điện thẩm (Electro – osmotic Flow)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S pic Diện tích pic

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

STT Số thứ tự

T 1/2 Thời gian bán thải

T max Thời gian để đạt Cmax

T m Thời gian di chuyển

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

2 Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

3 Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng

4

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp (n=6)

5 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng

6 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng

7 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng

8 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp MEKC trong định

15 Kết quả định lượng viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin

300mg

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Sơ đồ nguyên tắc hoạt động của CE

2 Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản

3 Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

4 Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC

16 Điện di đồ mẫu thử thêm Lamivudin chuẩn

17 Điện di đồ mẫu thử thêm Zidovudin chuẩn

18 Điện di đồ mẫu thử thêm Nevirapin chuẩn

19 Điện di đồ hỗn hợp chuẩn ở diều kiện điện di tối ưu

20 Điện di đồ mẫu trắng

21 Điện di đồ hỗn hợp chuẩn Lamivudin, Zidovudin, Nevirapin

22 Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm làm việc

23 Điện di đồ hỗn hợp chế phẩm thêm chuẩn

24 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ 3TC

27 Điện di đồ chế phẩm viên nén Avocomb-N

28 Điện di đồ chế phẩm viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin

300mg

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vào tháng 6 năm 2011, tại Hội nghị cấp cao về HIV/AIDS ở New York, Mỹ, Việt Nam đã khẳng định lại quyết tâm của mình trong công cuộc phòng, chống HIV/AIDS và cam kết thực hiện những mục tiêu mới thông qua việc ký Tuyên bố Chính trị năm 2011 về HIV/AIDS: Tăng cường nỗ lực để loại trừ HIV/AIDS Để có thể thực hiện mục tiêu đó, ngoài những biện pháp

xã hội cần được thực hiện thì việc kiểm soát chất lượng thuốc dùng trong điều trị cũng góp phần quan trọng không kém [10]

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều thuốc dùng để điều trị HIV Tuy nhiên, theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO, để điều trị HIV nên dùng phối hợp hai thuốc NRTIs hoặc cùng phối hợp với một thuốc NNRTIs

mà không nên đơn trị liệu vì có thể dẫn đến kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị [3], [11], [13]

Xuất phát từ nhu cầu đó, trên thị trường bắt đầu xuất hiện những thuốc

ở dạng hỗn hợp đa thành phần Chế phẩm chúng tôi dùng nghiên cứu cũng là một trong số đó Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng cũng như xác định các thành phần trong chế phẩm hỗn hợp đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng thuốc, đem lại sự an toàn, hiệu quả cho người sử dụng

Hiện nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích được đa số các Dược điển quốc tế lựa chọn trong kiểm nghiệm thuốc điều trị HIV Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác cao, khả năng tách tốt, độ nhạy cao và giới hạn phát hiện nhỏ Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn dung môi tinh khiết, đắt tiền, nhiều loại dung môi có thể gây độc với người phân tích và ô nhiễm môi trường Đồng thời phương pháp này tương đối hạn chế trong việc phân tích

các chất có khả năng ion hóa, nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo RP – HPLC (Reversed – phase liquid chromatography) [16], [17]

Nhằm mục đích xây dựng một phương pháp nghiên cứu phân tích ít tốn kém và ít độc hại hơn, chúng tôi hướng đến phương pháp điện di mao quản

Đã có nhiều nghiên cứu phân tích 3TC, AZT & NVP bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên, chưa thấy một nghiên cứu nào phân tích định lượng đồng thời ba chất đó bằng phương pháp CE Mặt khác, CE tuy không còn mới lạ trên thế giới, nhưng ở Việt Nam, việc ứng dụng CE vào trong kiểm nghiệm dược phẩm vẫn còn rất hạn chế Với những mục đích trên, đồng thời nhằm nâng cao chất lượng việc xây dựng tiêu chuẩn và quản lý các thuốc điều trị HIV đang được sử dụng tại Việt Nam; giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện nơi làm

việc nhất, chúng tôi đã tiến hành khóa luận “Xây dựng phương pháp định

lượng đồng thời Lamivudin, Nevirapin & Zidovudin bằng MEKC” nhằm

hai mục tiêu

- Xây dựng phương pháp phù hợp và ổn định để tách và định lượng

đồng thời Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để kiểm tra một số chế

phẩm chứa Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin được dùng trong phác đồ điều trị HIV/AIDS

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1.1 Tổng quan chung [4], [5], [12]

Bảng 1: Tổng quan chung về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

pentofuranosyl)-5-2,4(1H,3H)-dione

methyl-5,11-

11-Cyclopropyl-4-dihydro-6H-dipyrido [3,2-b:2’,3’-

e][1,4]diazepin-6-one

Tính chất

Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng

Tinh thể trắng hoặc hơi nâu

Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng

T nc 160 – 162 0C 120 – 122 0C 242 – 246 0C

Độ tan

Dễ tan trong nước, tan trong cồn, khó tan trong các dung

Khó tan trong nước, EtOH

Thực tế không tan trong nước, ít tan trong CH3Cl

môi hữu cơ không phân cực

trong nước)

1.1.2 Dược động học [3], [6], [11]

Bảng 2: Dược động học của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin

Sinh khả

dụng

~ 80%, không bị ảnh hưởng bởi thức

ăn

60 – 70 %, bị ảnh hưởng khi ăn nhiều chất béo

>90%, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn hoặc thuốc kháng acid

5,74 µg/ml (liều 200mg)

Phân bố Vd = 1,3 ± 0,4

lit/kg Vd = 1,6 ± 0,6 lit/kg

Nevirapin đi qua được nhau thai và hàng rào não tủy, phân bố trong dịch não tủy và sữa mẹ

Vd = 1,21 0,09 lit/kg

Chuyển hóa tại gan thành dẫn xuất glucuronid không hoạt tính

Chuyển hóa tại gan thành dẫn xuất glucuronid không hoạt tính

Thuốc gây cảm ứng enzyme gan

Thời gian

bán thải 2,5h

1,1 ± 0,2h Người bệnh bị ure huyết cao: 1,4 – 2,1h Bệnh nhân xơ gan:

2,4h

25 – 30h

Thải trừ

70% thải trừ dưới dạng còn nguyên vẹn qua nước tiểu

70% liều uống 60% liều tiêm truyền) được thải trừ dưới dạng chuyển hóa qua nước tiểu

(40-10 -20% liều uống (15 – 30% liều tiêm truyền) được thải trừ dưới dạng không đổi qua nước tiểu

>70% thải trừ qua nước tiểu dưới dạng chuyển hóa

Độ thanh

thải Cl

0,37 ± 0,05 lit/giờ/kg 0,2 – 0,3 lit/giờ/kg

0,017 – 0,032 lit/giờ/kg

1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV

1.1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị HIV

- Nhóm 1: Thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleoside (nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs)

VD: Zidovudin; Didanosin; Zalcitabin; Stavudine; Lamivudin; Abacavir; Tenofovir disoproxil fumarate

- Nhóm 2: Thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleoside (non-nucleoside reverse transcriptase ninhibitors =NNRTIs)

VD: Nevirapin; Delavirdin; Effavirenz

- Nhóm 3: Thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs)

VD: Indinavir; Ritonavir; Saquinavir; Nelfinavir; Amprenavir; Lopinavir

Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao và tránh kháng thuốc

1.1.3.2 Phác đồ phối hợp trong điều trị HIV [3], [11], [13], [20]

Trong liệu pháp kháng retrovirus, thuốc được chọn lọc là những thuốc tương tự nucleoside Hiện nay chưa biết rõ lúc nào là thời điểm tốt nhất để bắt đầu điều trị với thuốc kháng retrovirus Liệu pháp kháng retrovirus cũng làm tăng thời gian sống sót ở người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm3 Liệu pháp này cũng có thể dùng cho người bệnh có mật độ HIV trên 30.000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh Mật độ virus cao hơn dẫn đến giảm tế bào CD4 nhanh hơn Mục tiêu điều trị là đạt mật độ HIV ở mức không thể phát hiện được

Liệu pháp chuẩn hiện nay gồm 2 thuốc tương tự nucleoside kháng retrovirus, cùng với một thuốc ức chế protease

Người bệnh điều trị không có kết quả (tăng gấp 3 lần mật độ virus, hoặc giảm số lượng tế bào CD4, hoặc tiến triển thành bệnh AIDS) phải chuyển sang dùng kết hợp với một thuốc kháng retrovirus khác Lựa chọn thuốc sao cho nguy cơ kháng chéo với những thuốc đã dùng là tối thiểu Khi liệu pháp

cũ không có tác dụng cần thêm thuốc mới, nguyên tắc là cho thêm không chỉ một thuốc mà kết hợp 2 thuốc mới

Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleoside có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzyme phiên mã ngược của virus Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV

Nevirapin là chất ức chế enzyme phiên mã ngược non-nucleosid có hoạt tính kháng retrovirus HIV-1

Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin là ba thuốc phối hợp được tổ chức Y

tế thế giới WHO khuyến cáo dùng trong điều trị HIV

Liều dùng:

- Nevirapin 200mg/lần/ngày (trong hai tuần đầu), sau đó 200mg/2 lần/ngày

- Zidovudin 300mg/ 2 lần/ngày Bệnh nhân bị suy giảm chức năng thận hoặc phải điều chỉnh liều do bị nhiễm độc tố không được sử dụng viên phối hợp

Viên phối hợp Zidovudin/Lamivudin không phù hợp với những người bị suy thận hoặc những bệnh nhân sử dụng liều Zidovudin thấp hơn do tác dụng phụ

1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản [1], [2], [9], [14], [15]

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hóa từ thuật ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE

1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản

Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100 cm, đường kính trong 25 - 100 µm, đường kính ngoài 300 - 400 µm Sử dụng áp suất để đưa dung dịch mẫu và dung dịch đệm lên mao quản Điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra quá trình tách Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau

và tách ra khỏi nhau do điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau Các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di chuyển về một đầu mao quản

Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diod DAD Vị trí phát hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”

Hình 1: Sơ đồ hệ thống điện di

 Dòng điện thẩm (EOF)

Trong CE, dòng điện thẩm (EOF: electro-osmotic flow) là một thành phần

cơ bản, tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao quản bắt nguồn

từ điện tích bề mặt trong của thành mao quản

 Nguồn gốc EOF

Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽ mang điện tích âm Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân bằng K, nhưng thực nghiệm chỉ rõ rằng dòng EOF có giá trị đáng kể khi

pH dung dịch trên 4

Do bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ yếu

là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo theo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catod Sự di chuyển của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện thẩm EOF

 Hai đặc điểm của EOF

- Đặc điểm đầu tiên của EOF là tạo nên một dòng chuyển khối phẳng trong mao quản Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sự sụt áp trong mao quản: dòng đồng nhất từ đầu đến cuối (mao quản)

Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di chỉ xuất hiện khi đường kính trong mao quản (di) dưới 200µm Nếu di ≫ 200µm, sức căng bề mặt không đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng

ở giữa và ở gần thành mao quản

- Đặc điểm thứ hai của EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung dịch điện di, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng hướng Với điều kiện điện di thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng này di chuyển về catod Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc

độ EOF thường lớn hơn rất nhiều lần so với tốc độ điện di

Hình 2: Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản

Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo sau là các chất không mang điện tích (trên hình vẽ là N) di chuyển theo EOF nhưng không tách khỏi nhau được Cuối cùng là anion Trên điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước nhất, anion có điện tích lớn kích thước nhỏ ra sau cùng

Hình 3: Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

1.2.2 Các kiểu điện di mao quản

Anion

Điện tích lớn kích thước nhỏ

Điện di mao quản khá đa dạng, có thể thực hiện theo nhiều kiểu khác nhau Mỗi kiểu có cơ chế tách riêng của nó Bảng dưới đây tóm tắt bốn kiểu điện di

Bảng 3: Các kiểu điện di, cơ chế tách và ứng dụng

tự do

-Sinh học: phân tích các peptid, protein, dặc biệt là glucoprotein

-Xác định dược chất và các chất chuyển hóa của chúng -Phân tích các chất ô nhiễm môi trường

Là kỹ thuật bổ sung cho CZE để tách các ion và phân tử trung hòa về điện

Dùng để phân tích các phân đoạn AND, tách protein

độ khác nhau của các chất

-Phân tích dược: dùng phân tích dược chất thuộc nhiều nhóm khác nhau

-Phân tích các phân tử sinh học, các đồng phân quang học

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di

1.2.3.1 Điện thế

Thời gian phân tích tỉ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao quản Tuy nhiên, nếu điện thế quá cao có thể gây ra hiệu ứng June, tạo ra nhiệt trong mao quản, làm thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản, khiến cho các phân tử chất tan di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuếch tán khác nhau

và làm mở rộng vùng mẫu

1.2.3.2 Nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của dung dịch điện ly nền Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ mao quản tăng là nguyên nhân thay đổi cấu trúc protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân tích

1.2.3.3 Dung dịch điện ly

- Loại dung dịch điện ly và nồng độ: dung dịch điện ly thích hợp cho CE khi

có tác dụng tốt nhất trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong dung dịch ấy

- pH: pH của dung dịch điện ly có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi EOF

1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC)

MEKC có khi còn được viết tắt là MECC (micellar electrokinetic capillary chromatography) là một kỹ thuật bổ sung cho CZE: tách được ion và cả phân

tử trung hòa điện bằng cách thêm các chất hoạt động bề mặt vào dung dịch

điện di ở nồng độ trên nồng độ micelle tới hạn (critical micelle concentration – CMC) Chất hoạt động bề mặt thường dùng là natri dodecylsulfat (SDS) có CMC = 9mM Và đây cũng là chất diện hoạt chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Phương pháp MEKC là một kiểu kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di

có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản và sắc ký lỏng

có pha tĩnh Nó là một trong các kiểu tách sắc ký của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học y học và dược MEKC là một phương pháp tách

có hiệu quả cao, chủ yếu phù hợp để phân tích các hợp chất trung hòa nhỏ Cơ chế tách của kỹ thuật này dựa trên sự khác biệt của cân bằng phân phối của các hợp chất mẫu giữa pha động là dung dịch nước và pha tĩnh giả là các micelle Ưu điểm của MEKC là khả năng dễ dàng thay đổi các thành phần của hệ thống,và đặc biệt có thể thay đổi pha tĩnh giả micelle Theo đó, có thể

dễ dàng và nhanh chóng kiểm soát được pha động và tối ưu hóa độ phân giải

Vì vậy nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Micell ( tiểu phân Micell – pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung dịch đệm và chất điện ly trong ống mao quản Sự tách sắc ký của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MEKC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện ly nền

Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và cả trung hòa Đối với các chất có điện tích, các micelle loại này chuyển động hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tùy thuộc vào điện tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của micelle Các chất hoạt động bề mặt anion hóa, ví dụ SDS, sẽ di chuyển về anod (cực dương), nghĩa là di chuyển ngược chiều với hướng của dòng EOF Trong dung dịch đệm điện di

có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của micelle, thì sự điện di thực (net movement) của micelle là theo hướng của dòng EOF Trong khi di chuyển như thế, các micelle có thể tương tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di

Hình 4 : Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC

Đối với các phân tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong micelle và ở ngoài micelle (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đã chọn Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký của các chất phân tích theo kiểu micelle Vì thế các micelle trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả Nhiều chất tương tác với micelle khá bền, nó tồn tại trong micelle dài hơn

sự di chuyển của nó, khi các micelle mang nó một phần di chuyển ngược chiều dòng EOF

Khi các chất tan không tương tác với các micelle, nó được rửa giải cùng với dòng EOF Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất mạnh với các micelle và

bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu giữ của chất tan

Cơ chế của sự tách các phân tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng - rắn (LC), nhưng lại được điều khiển bởi lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản tạo ra mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC Trong kỹ thuật phân tích MEKC, các tính toán về hệ số dung lượng

k’i, số đĩa lý thuyết N của cột mao quản, độ phân giải R, cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc ký cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng hơn cho hệ pha MEKC

tr : thời gian di chuyển của chất tan

t0: thời gian di chuyển của chất không lưu giữ, được xác định bằng cách tiêm một chất đánh dấu micelle như sudan III, khi di chuyển nó luôn nằm trong micelle

k: hệ số phân bố của chất tan trong và ngoài micelle

VS: thể tích của pha micelle

VM: thể tích của pha động

Người ta gọi kỹ thuật này là sắc kí điện động micelle bởi vì hạt micelle được coi như một pha tĩnh giả (pseudostationary phase) Việc tách các chất trung hòa dựa trên cơ sở sự phân bố của chúng giữa dung dịch và pha tĩnh giả

Có thể thay đổi sự phân bố trên bằng nhiều cách khác nhau, như:

- Thay đổi pH và nồng độ của dung dịch điện di

- Thay đổi bản chất vật lý của micelle (kích thước, điện tích hoặc hình dạng của nó) bằng cách dùng các chất hoạt động bề mặt khác nhau (tương tự thay đổi pha tĩnh trong LC)

- Thay đổi nồng độ của chất hoạt động bề mặt

- Thay đổi nhiệt độ điện di

- Thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch điện ly nền)

Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng gây ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản Hướng di chuyển của chất tan và của các micell cũng phụ thuộc vào điện tích của micell

và tốc độ dòng EOF Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các micell

1.2.4.1 Chất tạo micelle SDS

CTHH:

CTPT: CH3(CH2)11 OSO3Na

PTK: 288,372 g/mol

Tên KH: Sodium lauryl sulfate

Tên khác: Sodium monododecyl sulfate; Sodium lauryl sulfate; Sodium

monolauryl sulfate; Sodium dodecanesulfate; Sodium coco-sulfate; dodecyl alcohol, hydrogen sulfate, sodium salt; n-dodecyl sulfate sodium; Sulfuric acid monodedocyl ester sodium

Hệ số dầu/ nước HLB = 40

SDS là một chất hoạt động bề mặt ainon hóa Khi hòa tan vào nước, SDS phân ly thành ion âm R- và ion Na+ không có tính hoạt động bề mặt

 Cơ chế tạo micelle:

SDS có một phần kỵ nước và phần ưa nước Khi nồng độ SDS trong dung dịch vượt quá nồng độ micelle tới hạn (CMC = 9mM), các phân tử SDS tập hợp lại với nhau, đầu ưa nước sẽ hướng ra ngoài và đầu kỵ nước sẽ hướng vào bên trong hình thành các micelle hình cầu

Hình 5: Micell hình cầu

1.2.4.2 Ứng dụng của MEKC

MEKC là một kiểu điện di có nhiều ứng dụng bởi vì có thể tách định lượng các chất trung hòa và mang điện tích, có đặc tính sơ nước và thân nước như acid amin, nucleotide, vitamin, hydrocarbon thơm Với chế phẩm dược

có thể dùng MEKC để xác định hoạt chất trong các loại viên, dung dịch tiêm

1.2.5 Ưu - nhược điểm của MEKC

Phương pháp MEKC là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy

và hiệu quả tách cao Phương pháp có thể tiến hành trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả chất mang điện và chất trung tính Phương pháp có một số đặc điểm cơ bản:

- Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn so với kỹ thuật HPLC

- Dung dịch pha động cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước

đã loại trừ ion và sử dụng ít, ít tốn kém, ít độc hại

- Có hiệu lực tách các chất rất cao

- Điện thế sử dụng rất cao (10 – 100kV), có thể thay đổi được để thời gian di chuyển hợp lý

- Có khả năng tự động hóa nên dễ dàng tiến hành với một số lượng mẫu lớn

- Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, dễ tái sinh hơn so với HPLC

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm:

- Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn nhiều so với các phương pháp khác Giới hạn của nó cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD Trong khi đó các phương pháp khác như HPLC có giới hạn nhỏ hơn nhiều

- Máy làm việc dưới điện thế cao nên phải cẩn thận khi làm việc

- Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng

là nhược điểm của nó Lượng mẫu nhỏ có thể dẫn đến sai số lớn khi phân tích mẫu có hàm lượng cao do hệ số pha loãng cao Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian phân tích thì gây ra hiện tượng doãng pic, hiệu suất không cao

- Thời gian lưu của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm, dung dịch điện ly Vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ

1.3 Một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT & NVP

1.3.1 Phương pháp HPLC

Dưới đây chúng tôi trình bày một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin bằng phương pháp HPLC

- Bin Fan, James T Stewart đã nghiên cứu định lượng đồng thời AZT, 3TC

& NVP trong huyết tương người bằng HPLC với pha động là đệm phosphate – acetonitril (86:14 V/V) được điều chỉnh đến pH 3,2 bằng acid phosphoric Tiến hành chạy sắc ký trên cột C – 8 (150 3,9mm) với bước sóng phát hiện ở 265nm Aprobarbital được chọn làm chất chuẩn nội Kết quả thu được cho thấy thời gian lưu của ba chất AZT, 3TC & NVP tương ứng lần lượt là: 3,1; 6,1 và 15,0 phút [16]

- Theo [17], Geetha Ramachandran cùng các cộng sự đã dùng HPLC để phân tích AZT và NVP Các điều kiện chạy sắc ký: pha động: KH2PO4

(15mM, pH = 7,5) : actetonitril = 80 : 20 (V/V); pha tĩnh: Cột C – 18, 150mm x 4,6 mm; chuẩn nội: 3 – xanthine – 1- methyl isobutyl Bước sóng phát hiện: 260nm Thời gian lưu của AZT là 2,4 phút; của NVP là 6,0 phút

- Phân tích đồng thời 3TC, AZT& NVP trong chế phẩm, Anantha Kurma và các cộng sự đã sử dụng phương pháp RP-HPLC [18] Các điều kiện chạy sắc ký được xác định bao gồm: Pha động: orthophosphate kali dihydrogen 0,015 M(pH 5,0) : acetonitril = 45:55 (v/v); pha tĩnh: cột hiQ Sil C18V; tốc độ dòng chảy: 1,0ml/phút Bước sóng phát hiện tại 270 nm Chất chuẩn nội: Carbamazipine Thời gian lưu giữ đối với 3TC, AZT và NVP lần lượt

là 2,45; 2,93 và 3,72 phút

- Tác giả Bin Fan [21] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời Zidovudin, Zalcitabin & Nevirapin trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC Điều kiện chạy sắc ký như sau: Pha động: 20 mM sodium phosphate đệm (chứa 8 mM 1-octanesulfonic axit, muối natri) - acetonitril (86:14, v / v),

pH được điều chỉnh đến 3,2 bằng acid phosphoric; pha tĩnh: Cột C – 8, 150

x 3,9mm, ∅ = 5µm Tốc độ dòng: 1,0ml/phút Chuẩn nội: Aprobarbital Tiêm mẫu 20µl ba lần vào cột HPLC Bước sóng phát hiện: 265nm Thời

gian lưu của AZT là 3,1 phút, của ddC là 5,2 phút và của NVP là 15,0 phút

1.3.2 Phương pháp CE

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu tiêm tốn ít Phương pháp này đã được ứng dụng trong nghiên cứu tách và định lượng Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong nhiều hỗn hợp khác nhau

- Bin Fan và J.T Stewart sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng CZE với thành phần dung dịch điện ly nền gồm có đệm phosphate 80mM, pH = 2,5 thêm 100nM N,N-dimethyloctylamine Tiến hành phân tích tại thế 20kV, nhiệt độ mao quản 300C Cột mao quản silica trần dài 52cm, chiều dài hiệu dụng 30cm, đường kính 50µm Phương pháp cho phép tách 3TC, ddI & NVP và chúng được phát hiện bởi detector DAD ở bước sóng 210nm Thời gian lưu thu được của ba chất lần lượt là: 3TC là 4,3 phút; NVP là 6,2 phút và ddI là 9,8 phút.[19]

- Nghiên cứu tách và định lượng đồng thời AZT, ddI & NVP trong huyết tương người bằng MEKC, Bin Fan và cộng sự sử dụng dung dịch điện ly nền là đệm phosphat 15mM và đệm borat, pH = 9,0 với chất tạo micell là SDS 18mM Quá trình điện di diễn ra trong cột mao quản silica trần dài 52cm, chiều dài hiệu dụng 30cm, đường kính 50µm Nhiệt độ 30 0C Bước sóng phát hiện ở 210nm Điện thế áp vào hai đầu mao quản là15kV Cường

độ dòng điện duy trì trong mao quản 30 µA Chất chuẩn nội: Aprobarbital Kết quả thu được với thời gian lưu của các chất như sau: thời gian lưu của AZT là 3,7 phút; của ddI là 4,0 phút; của NVP là 6,0 phút.[20]

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG & PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Điều kiện nghiên cứu

2.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu

- Chuẩn quốc gia Lamivudin (200mg/lọ) hàm lượng 99,45% C8H11N3O3S tính theo nguyên trạng, SKS 0312146.03, bảo quản ở nhiệt độ 5 0C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm thuốc TW- Bộ Y Tế

- Chuẩn quốc gia Zidovudin (200mg/lọ) hàm lượng 99,64% C10H13N5O4

(HPLC) tính theo nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản ở nhiệt độ 5 0C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm thuốc TW - Bộ Y tế

- Chuẩn quốc gia Nevirapin khan (200mg/lọ) hàm lượng 99,49% C15H14N4O tính theo nguyên trạng, SKS WS 0109263, bảo quản ở nhiệt độ 2 -8 0C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm thuốc TW - Bộ Y tế

2.1.2 Hóa chất

- Nước loại ion: là nước cất hai lần mới, được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết

có cột trao đổi ainon và cation, sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm

- NaOH, Na2B4O7, MeOH, SDS

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch gốc chuẩn: cân chính xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin và 59,6 mg Zidovudin vào cốc có mỏ Thêm vào 10ml MeOH hòa tan, sau đó thêm nước loại ion hòa tan Chuyển hết vào bình định mức 100ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước loại ion đến thể tích vừa đủ

và lắc đều

- Pha các dung dịch chuẩn (1), (2), (3), (4), (5), (6) có nồng độ Lamivudin lần lượt là 77,25µg/ml; 123,6µg/ml; 154,5µg/ml; 169,95µg/ml; 185,4µg/ml; 231,7µg/ml; nồng độ Zidovudin: 149,0µg/ml;238,4µg/ml;

298,0µg/ml; 327,8µg/ml; 357,6µg/ml; 447,0µg/ml; nồng độ Nevirapin: 99,25µg/ml; 158,8µg/ml; 198,5µg/ml; 218,3µg/ml; 238,2µg/ml; 297,7µg/ml

- Dung dịch mẫu trắng: chuẩn bị tương tự mẫu chuẩn nhưng không có chất cần khảo sát

 Chuẩn bị dung dịch thử

Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình một viên là 1,2441g và nghiền thành bột mịn Cân một lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg Nevirapin, 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10ml MeOH, 20ml nước loại ion siêu âm cho tan hết, thêm nước loại ion đến vừa đủ thể tích, lắc đều Lọc qua giấy lọc đường kính 11cm Bỏ 20ml dịch lọc đầu Dịch lọc tiếp tục được lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc cellulose kích thước lỗ lọc 0,45µm Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu Dịch lọc được lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm vào lọ đựng mẫu

 Pha dung dịch điện ly nền:

Các dung dịch điện ly nền được pha từ hóa chất đạt tiêu chuẩn bằng nước loại ion

- Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 (Natritetraborat) 10mM

Cân chính xác khoảng 0,0953 g Natritetraborat vào bình định mức 25ml, thêm nước và siêu âm để hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh nước vừa đủ đến vạch, lắc đều

nước tới vạch và lắc đều Dung dịch điện ly nền này điều chỉnh pH đến pH 8,5 ; pH 9,3 và pH 10,0

Pha các dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM/ SDS 25mM; Na2B4O7

10mM/ SDS 75mM; Na2B4O7 5mM/ SDS 50mM; Na2B4O7 20mM/ SDS 50mM: tiến hành cân và pha tương tự như trên vào bình định mức 25ml

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 được điều khiển bằng phần mềm Chemstation 100001 (sản xuất tại hãng Hewlett Packard, Đức) của bộ môn Hóa phân tích - Độc chất, trường đại học Dược Hà Nội

- Máy lọc nước loại ion Satorius arium 611: model SATORIUS AG GOTYINGEN, áp suất tối đa 100psi/ 6,9bar

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (sản xuất tại hãng Elma, Đức)

- Máy đo pH EUTECH Instrument

- Cân phân tích Satorius TE214S

- Giấy lọc đường kính 11cm – Trung Quốc

- Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm

- Bộ lọc hút chân không màng lọc cellulose với kích thước lỗ lọc 0,45 m

- Các dụng cụ chính xác: bình định mức, pipet chính xác với các thể tích khác nhau

- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày và cối

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm làm việc Viên nén Avocomb-N có hàm lượng Lamivudin 150mg,

Zidovudin 300mg & Nevirapin 200mg do công ty Ranbaxy laboratories Limited, Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 9/ 2013

Viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin 300mg do công ty Matrix Laboratories Limited Ấn, Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 10/2013

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE, MEKC, các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Niverapin trong chế phẩm viên nén Thẩm định phương pháp xây dựng được Từ phương pháp đó, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc

có cùng hoạt chất đang được sử dụng trong phác đồ điều trị HIV/AIDS ở Việt Nam

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp được chọn ở đây là phương pháp điện di mao quản với hai kiểu điện di CZE và MEKC Tiến hành khảo sát các điều kiện để:

- Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT & NVP

- Ứng dụng trong định lượng chế phẩm viên nén

Yêu cầu đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r ≥ 0,99

 Độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành phân tích ở mức nồng độ đã xác định với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic của ba chất cần phân tích Đánh giá độ phân tán các số liệu diện tích pic và thời gian lưu thu được dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%):

xi : giá trị tính được của lần thí nghiệm thứ “i”

𝑥̅ : giá trị trung bình các lần thử nghiệm n: số lần thí nghiệm

Yêu cầu RSD(%) không được quá 5%

 Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã được cho thêm những lượng chuẩn nhất định Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành lặp lại năm lần, chuẩn thêm vào khoảng 20% so với lượng trong mẫu Phương pháp thêm chuẩn vào mẫu được chuẩn bị như sau:

Mẫu thử: là dung dịch chế phẩm được pha với nồng độ nằm trong khoảng

tuyến tính

Mẫu thêm chuẩn: được tiến hành song song cùng mẫu thử Thêm 20%

chuẩn so với hàm lượng có trong mẫu

Tính độ thu hồi: Dựa vào phương trình chuẩn hồi quy tính toán được nồng

độ của từng mẫu (C mẫu) và nồng độ của từng mẫu thêm chuẩn (C mẫu thêm chuẩn)

C thu hồi = C mẫu thêm chuẩn – C mẫu

Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%) = 𝐶𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖

𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛