Phương pháp được chọn ở đây là phương pháp điện di mao quản với hai kiểu điện di CZE và MEKC. Tiến hành khảo sát các điều kiện để:
- Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT & NVP
- Ứng dụng trong định lượng chế phẩm viên nén. 2.3.2.1 Thẩm định phương pháp
Phương pháp phân tích đang xây dựng được thẩm định theo các tiêu chí Khoảng tuyến tính
Để đảm bảo sự chính xác của phép định lượng, chúng tôi tiến hành trên 6 mẫu hỗn hợp chuẩn cần phân tích ở các nồng độ khác nhau, lập mối tương quan giữa nồng độ của Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin với diện tích pic thu được trên điện di đồ bằng phương trình hồi quy cùng các hệ số tương quan tương ứng và đồ thị.
Yêu cầu đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r ≥ 0,99.
Tiến hành phân tích ở mức nồng độ đã xác định với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic của ba chất cần phân tích. Đánh giá độ phân tán các số liệu diện tích pic và thời gian lưu thu được dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%):
𝑅𝑆𝐷% = 𝑆𝐷𝑥̅ × 100 𝑆𝐷 = √∑(𝑥𝑖− 𝑥̅)2
𝑛−1
Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn
RSD: độ lệch chuẩn tương đối
xi : giá trị tính được của lần thí nghiệm thứ “i” 𝑥̅ : giá trị trung bình các lần thử nghiệm n: số lần thí nghiệm
Yêu cầu RSD(%) không được quá 5%. Độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã được cho thêm những lượng chuẩn nhất định. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành lặp lại năm lần, chuẩn thêm vào khoảng 20% so với lượng trong mẫu. Phương pháp thêm chuẩn vào mẫu được chuẩn bị như sau:
Mẫu thử: là dung dịch chế phẩm được pha với nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính.
Mẫu thêm chuẩn: được tiến hành song song cùng mẫu thử. Thêm 20% chuẩn so với hàm lượng có trong mẫu.
Tính độ thu hồi: Dựa vào phương trình chuẩn hồi quy tính toán được nồng độ của từng mẫu (C mẫu) và nồng độ của từng mẫu thêm chuẩn (C mẫu thêm chuẩn)
C thu hồi = C mẫu thêm chuẩn – C mẫu
Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%) = 𝐶𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖
Tính tương thích hệ thống
Tính tương thích hệ thống được xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu hỗn hợp ba chuẩn đã được xác định nồng độ. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) và giá trị độ phân giải Rs của hai pic liền kề.
Rs = 2 (𝑡(𝑊𝑅)𝐵− (𝑡𝑅)𝐴
𝐴 + 𝑊𝐵)
Trong đó: (tR)A : thời gian dịch chuyển của chất A (tR)B : thời gian dịch chuyển của chất B
WA ,WB : độ rộng chân pic trên điện di đồ của hai chất A và B Tính đặc hiệu của phương pháp
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt của các chất cần phân tích khi có các thành phần khác bằng cách điện di lần lượt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử trong cùng một điều kiện điện di đã lựa chọn. Trong đó mẫu trắng chính là dung môi (trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng MeOH 10%/ H2O làm dung môi) đã dùng để pha mẫu thử và mẫu chuẩn.
2.3.2.2 Áp dụng phương pháp MEKC vào định lượng viên nén
Avocomb-N và viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin 300mg
Trên cơ sở đã khảo sát, chọn nồng độ định lượng mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính.
Từ đường chuẩn đã xây dựng được khi xác định khoảng tuyến tính, tính ra được hàm lượng chất cần phân tích có trong mẫu định lượng. Tiếp đó tính ra hàm lượng hoạt chất có trong chế phẩm.
PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1Lựa chọn điều kiện điện di tối ưu