Xây dựng phương pháp định lường đồng thời 4 hydroxyderricin và xanthoangelol trong thực phẩm chức năng chalcone bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ TRUNG KIÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4-HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ TRUNG KIÊN 1401338 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4-HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực Khoa Hóa Thực phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện, khóa luận “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 4-Hydroxyderricin Xanthoangelol thực phẩm chức chứa chalcon sắc ký lỏng hiệu cao” hoàn thành Để có kết này, em nhận nhiều động viên, giúp đỡ từ phía nhà trường, mơn Hóa phân tích Độc chất nơi em thực đề tài - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia Trước tiên, em xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Lâm Hồng - giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất, người tận tình hướng dẫn theo sát em suốt q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Lê Hồng Dũng, người trực tiếp hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện tối đa cho em suốt trình thực nghiên cứu Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị khoa Hóa thực phẩm - Viện Dinh Dưỡng Quốc gia giúp đỡ em suốt thời gian thực nghiên cứu Trong trình thực hồn thành khóa luận, việc xuất thiếu sót báo cáo khơng tránh khỏi Em mong nhận đóng góp, dẫn thầy để khóa luận em tiếp tục hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2019 Sinh viên Lý Trung Kiên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Chalcone 1.1.2 Xanthoangelol 1.1.3 4-Hydroxyderricin 1.1.4 Sản phẩm chứa Xanhoangelol 4-Hydroxyderricin 1.1.5 Một số tính chất sinh hóa Xanhoangelol 4-Hydroxyderricin 1.1.6 Một số phương pháp phân tích 4-Hydroxyderrcin Xanthoangelol CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Nguyên vật liệu 2.2.1 Chất chuẩn 2.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 2.2.3 Chuẫn bị dung dịch mẫu placebo 2.2.4 Dung mơi, hóa chất 2.2.5 Thiết bị, dụng cụ 2.2.6 Nội dung nghiên cứu 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Kháo sát điều kiện phân tích xanthoangelol 4-hydroxyderricin HPLC 10 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 11 2.3.3 Thẩm định quy trình 12 2.4 Xử lý kết 14 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 ii 3.1 Xây dựng quy trình phân tích 15 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký 15 3.1.2 Điều kiện sắc ký tối ưu 20 3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 20 3.1.4 Quy trình chiết tối ưu 23 3.2 Thẩm định phương pháp 24 3.2.1 Độ ổn định hệ thống HPLC 24 3.2.2 Tính đặc hiệu hệ thống 24 3.2.3 Khoảng tuyến tính 26 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng (LOD LOQ) 28 3.2.5 Độ lặp lại 29 3.2.6 Độ thu hồi 30 3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích thực phẩm chức chalcone 31 3.4 Bàn luận 32 3.4.1 Đối tượng nghiên cứu 32 3.4.2 Điều kiện sắc ký HPLC 32 3.4.3 Quy trình xử lý mẫu 32 3.4.4 Thẩm định phương pháp 33 3.4.5 Ứng dụng định lượng thực phẩm chức chứa chalcon 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt 4-HD 4-Hydroxyderricin ACN Acetonitrile CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử GSH Glutathion Hàm lượng so với nhãn HLSVN HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế LC Liquid Chromatography Sắc ký lòng LOD Limit of Detection Giới hạn phát LogD Octanol/water Distribution Coefficient Hệ số phân bố octanol/nước LogP (o/w) Octanol/water Partition Coefficient Hệ số phân tán octanol/nước LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Mass Spectrometry Khối phổ PDA Photodiode Array Detector Detector mảng diod RS Resolution Độ phân giải RSD % Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn Tiêu chuẩn sở TCCS UV Untraviolet XA Xanthoangelol Tử ngoại iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích 4-HD XA Bảng 1.2: Phương pháp định lượng dựa TCCS Bảng 3.1: Kết độ ổn định hệ thống HPLC 24 Bảng 3.2: Thông số peak purity mẫu thử 26 Bảng 3.3: Nồng độ diện tích peak 4-HD 27 Bảng 3.4: Nồng độ diện tích peak xanthoangelol 27 Bảng 3.5: Giá trị S/N pic thêm chuẩn kết LOQ, LOD 28 Bảng 3.6: Kết độ lặp lại 29 Bảng 3.7: Kết độ thu hồi ba mức nồng độ thấp, trung bình cao 30 Bảng 3.8: Kết định lượng thực phẩm chức Chalcone 31 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol Hình 1.3: Cấu trúc 4-Hydroxyderricin Hình 1.4: Một số thực phẩm chức chứa 4-HD XA Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất dự kiến 11 Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Inertsil C8 15 Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Phenomenex Luna C18(2) 16 Hình 3.3: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp sử dụng cột Agilent 5-HC C18(2) 16 Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (7/3) 17 Hình 3.5: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (8/2) 18 Hình 3.6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH/H2O (9/1) 18 Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dùng pha động MeOH 19 Hình 3.8: Phổ hấp thụ 4-HD XA 19 Hình 3.9: So sánh siêu âm lắc ngang 20 Hình 3.10: So sánh tỷ lệ dung môi chiết 21 Hình 3.11: So sánh khoảng thời gian chiết 21 Hình 3.12: So sánh nhiệt độ chiết 22 Hình 3.13: So sánh số lần chiết 23 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình chiết xuất tối ưu 23 Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu placebo 25 Hình 3.16: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn 25 Hình 3.17: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 25 Hình 3.18: Kết peak purity mẫu thử 26 Hình 3.19: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak 4-HD 27 Hình 3.20: Biểu đồ mối tương quan nồng độ - diện tích peak xanthoangelol 27 Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn LOQ 29 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với phát triển không ngừng xã hội, nhu cầu chăm sóc sức khỏe người ngày cao Chính vậy, ngày có nhiều người quan tâm tìm đến sản phẩm bảo vệ nâng cao sức khỏe, số thực phẩm chức với thành phần cơng bố có nguồn gốc tự nhiên ngày ưa chuộng Những năm trở lại đây, dịch chiết từ phận Angelica keiskei, loài phân bố chủ yếu Nhật Bản, ngày quan tâm Dịch chiết giống chức minh khả ức chế phát triển khối u, cải thiển tình trạng viêm, béo phì, tiểu đường, tăng huyết áp Mặt khác, chúng cho thấy hoạt tính chống huyết khối, chống oxy hóa, chống tăng lipid, chống virus ức chế vi khuẩn [6] Trong đó, hai chalcon thành phần chính, 4-hydroxyderricin xanthoangelol, tồn chủ yếu dạng aglycon, với hàm lượng tương ứng chất dịch chiết thô A keiskei 1,5% 2,6%, đóng vai trò quan trọng với tác dụng sinh học [13] Bởi vậy, sản phẩm thương mại hóa phát triển giới, đặc biệt thực phẩm phẩm Nhật Bản: Chalcone Ashitaba Powder, Percent 36 Energy Booster Tuy nhiên, sản phẩm tương tự chưa phổ biến Việt Nam Chính vậy, Viện Dinh Dưỡng Quốc gia, với nhu cầu phát triển sản phẩm chứa hai loại chalcon này, tiến hành “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 4-Hydroxiderrcin Xanthoangelol thực phẩm chức chứa chalcone sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hàm lượng 4-Hydroxyderrcin Xanthoangelol thực phẩm chức chứa chalcon - Ứng dụng quy trình xây dựng để định lượng sản phẩm chức Chalcone lưu hành thị trường CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Chalcone O Hình 1.1: Cấu trúc Chalcone - Công thức: C15H12O - CAS number: 94-41-7 - Tên khoa học: (E)-1,3-diphenylpropenon - Phân tử lượng: 208,3g/mol - LogP (o/w): 3,12 [21] 1.1.2 Xanthoangelol HO H3C OH OH CH3 O CH3 Hình 1.2: Cấu trúc Xanthoangelol - Công thức: C25H28O4 - CAS number: 62949-76-2 - Tên khoa học: (E)-1- [3-[(2E)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-2,4- dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on - Phân tử lượng: 392,5 g/mol - Độ tan nước: 0,0039 mg/L 25oC, tan tốt dung môi hữu không phân cực methanol, acetonitrile,… - LogP (o/w): 6,16 - LogD (pH = 7,4): 5,84 - pKa = 7,57 [22] nghiên cứu so với 15 phút theo TCCS) Điều khác thiết bị máy siêu âm thành phần mẫu áp dụng phòng thí nghiệm cơng ty Mặt khác, nghiên cứu này, sau khảo sát yếu tố, cắn mẫu sau chiết lại tiếp tục chiết lần với quy trình mục 3.1.4 Kết tổng hàm lượng sau lần chiết thu không khác đáng kể so với chiết lần theo quy trình 3.1.4 Chính vậy, quy trình cho thấy khả chiết với hiệu suất tốt Quy trình xử lý mẫu có ưu điểm dễ thực hiện, trang thiết bị đơn giản, dung mơi hóa chất rẻ tiền cho thấy khả áp dụng nhiều sở phòng thí nghiệm Việt Nam 3.4.4 Thẩm định phương pháp Sau xây dựng quy trình phân tích, chúng tơi tiến hành thẩm định phương pháp theo quy định AOAC 2016 Với việc quy trình xử lý mẫu chạy sắc ký gần tương đồng với TCCS [4] nhà sản xuất, kết cho thấy việc áp dụng phương pháp đối tượng nguyên liệu thực phẩm chức chứa chalcon Nhật Bản vào chế phẩm Việt Nam đảm bảo kết độ lặp lại độ theo tiêu chuẩn AOAC Tuy nhiên, số lượng chất chuẩn hạn chế, nghiên cứu chưa thể tiến hành thẩm định độ mẫu placebo thêm chuẩn theo quy định AOAC 2016 3.4.5 Ứng dụng định lượng thực phẩm chức chứa chalcon Phương pháp tiến hành định lượng hàm lượng hai chất 4-HD XA chế phẩm Chalcone Viện Dinh Dưỡng Trong bối cảnh sản phẩm thương mại hóa chứa hai chất chưa phổ biến Việt Nam, việc xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4-HD XA thực phẩm chức chứa chalcon trở thành nguồn tài liệu tham khảo tiền đề cho định lượng tiêu chuẩn hóa hai chất tương lai 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trên sở kết thực nghiệm báo nghiên cứu tham khảo, tiến hành khảo sát trình định lượng 4-hydroxyderricin xanthoangelol sử dụng HPLC detector PDA với kết thu sau: Tối ưu hóa điều kiện sắc ký HPLC  Cột Agilent 5-HC C18(2) (150mm x 4,6mm x 5µm) với cột bảo vệ Agilent 5-HC C18(2) (12.5mm x 4,6mm x 5µm)  Dectector PDA: 370 nm  Pha động gồm kênh: MeOH - H2O tỷ lệ tương ứng -  Tốc độ dòng: 1mL/ phút  Nhiệt độ cột: 35oC  Thể tích tiêm mẫu: 10 µL Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu Qua trình khảo sát điều kiện xử lý mẫu, chúng tơi lựa chọn quy trình xử lý sau: Mẫu thực phẩm chức đồng Cân xác khoảng 0,2g mẫu Thêm khoảng 20 mL MeOH/H2O (8/2) Chiết siêu âm 30 phút nhiệt độ phòng Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 25 mL Rửa cắn dung môi đến vừa đủ 25 mL Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm Tiêm vào hệ thống sắc ký Thẩm định quy trình định lượng theo yêu cầu AOAC 2016 Kết thẩm định: - Phương pháp có tính chọn lọc tốt với 4-hydroxyderricin xanthoangelol 34 - Phương pháp cho thấy có tương quan tuyến tính rõ rệt diện tích peak sắc ký nồng độ chất:  4-HD: khoảng nồng độ từ 4,7 ppm đến 235 ppm với r2 = 0,9994  XA: khoảng nồng độ từ 5,35 ppm đến 267,5 ppm với r2 = 0,9997 - Phương pháp cho độ nhạy tốt để sàng lọc hai chất với giá trị LOD LOQ tương ứng sau:  4-HD: LOD = 37,6 ng/g, LOQ = 12,5 ng/g  XA: LOD = 53,5 ng/g, LOQ = 17,8 ng/g - Phương pháp có độ lặp lại mức nồng thấp, trung bình cao đáp ứng yêu cầu AOAC 2016 - Phương pháp cho kết độ thu hồi tốt đáp ứng yêu cầu AOAC 2016 Định lượng thực phẩm chức Nghiên cứu xác định hàm lượng 4-hydroxyderricin xanthoangelol mẫu thực phầm chức Chalcone với hàm lượng tương ứng 88,14% 78,91% so với hàm lượng nhãn Kiến nghị Phương pháp ứng dụng mẫu rắn với thực phẩm chức Chalcone, cần ứng dụng nhiều mẫu 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia, pp 32-39 TIẾNG ANH Batttenberg O.A., Yang Y., et al (2013), "Target profiling of 4-hydroxyderricin in S aureus reveals seryl-tRNA synthetase binding and inhibition by covalent modification", Mol BioSyst, 9, pp 343-351 Ho K.J., Kyung S.Y., et al (2013), "Xanthoangelol and 4-hydroxyderricin are the major active principles of the inhibitory activities against monoamine oxidases on Angelica keiskei", K Biomol Ther, 21, pp 231-240 Janpan Bio Science Laboratory Co L (2009), "Assay method of chalcone", HPLC method, the first edition, pp Kawabata K., Sawada K., et al (2011), "Prenylated chalcones 4hydroxyderricin and xanthoangelol stimulate glucose uptake in skeletal muscle cells by inducing GLUT4 translocation", Mol Nutr Food Res, 55, pp 467-475 Kil Y.-S., T.Pham S., et al (2017), "Angelica keiskei, an emerging medicinal herb with various bioactive constituents and biological activities", Archives of Pharmacal Research, 40(6), pp 655-675 Kimura Y., Baba K (2003), "Antitumor and Antimetastatic activities of Angelica keiskei roots, part 1: isolation of an active substance, xanthoangelol", Int J Cancer, 106, pp 429-437 Konieczka P., Namiesnik J (2016), "Method Validation", Quality Assuarance and Quality Control in the Analytical Chemical Laboratory: A pratical Approach, CRC Press, pp 136-143 Kozawa M., Morita N., et al (1977), "The Structure of Xanthoangelol, a New Chalcone from the Roots of Angelica keiskei Koidzumi (Umbellifera)", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 25(3), pp 515-516 10 Luo L., Wang R., et al (2012), "Compounds from Angelica keiskei with NQO1 induction, DPPH scavenging and a-glucosidase inhibitory activities", Food Chemistry, 131, pp 992-998 11 Maronpot R.R (2015), "Toxicological assessment of ashitaba chalcone", Food and Chemical Toxicology, 77, pp 111-119 12 Murakami S., Kijima h., et al (1990), "Inhibition of gastric H+, K+, ATPase by chalcone derivatives, xanthoangelol and 4-hydroxyderricin, from Angelica keiskei Koidzumi ", J Pharm Pharmacol, 42, pp 723-726 13 Nakamura T., Tokushima T., et al (2012), "Absorption and metabolism of 4hydroxyderricin and xanthoangelol after oral administration of Angelica keiskei (Ashitaba) extract in mice", Archives of biochemistry and biophysics, 521(1-2), pp 71-76 14 Official Methods of Analysis AOAC, Appendix F: Guidelines for standard method performance requirement 2016 15 Ogawa H., Ohno M., et al (2005), "Hypotensive and lipid regulatory actions of 4-hydroxyderricin, a chalcone from angelica keiskei in stroke-prone spontaneously hypertensive rats", Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 32, pp 19-23 16 Ohnishi K., Hackel V (2017), "A Two Part Randomized, Placebo Controlled Double Blind Pilot Study to Determine the Effect of Ashitaba (Angelica keiskei) Chalcone Powder (ChalCurbR) on Body Weight and Visceral Fat in Slightly Obese Adults", Adv Obes Weight Manag Control, 7(2), pp 00189 17 Wook K.D., Marcus C.-L.J., et al (2014), "Quantitative analysis of phenolic metabolites from different parts of Angelica keiskei by HPLC–ESI MS/MS and their xanthine oxidase inhibition", Food chemistry, 153, pp 20-27 18 Yali L., Yulan L., et al (2016), "Determination of 4-Hydroxyderricin and Xanthoangelol in Different Parts of Angelica keiskei by HPLC-PDA", Food Science, 37(6), pp 142-145 19 Yasuda M., Kawabata K., et al (2014), "Inhibitory effects of 4-hydroxyderricin and xanthoangelol on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW264 macrophages", Journal of agricultural and food chemistry, 62(2), pp 462-467 WEBSITE 20 Institute E.M.B.L.-E.B (2018), "Compound Report Card: 4-Hydroxyderricin", Retrieved 20-05, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL458094/ 21 Institute E.M.B.L.-E.B (2018), "Compound Report Card: Chalcone", Retrieved 10-06, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL7976/ 22 Institute E.M.B.L.-E.B (2018), "Compound Report Card: Xanthoangelol", Retrieved 20-05, 2019, from https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL494083/ PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE Xanthoangelol mg 4-Hydroxyderricin 2,2 mg Vitamin E mg Vitamin C 35 mg Vitamin D 200 IU β - caroten mg PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ DUNG DỊCH CHUẨN Sắc ký đồ chuẩn đơn 4-hydroxyderricin 188 ppm Sắc ký đồ chuẩn đơn xanthoangelol 214 ppm Sắc ký đồ chuẩn đơn hỗn hợp 4-HD 235,5 ppm XA 262,5 ppm PHỤ LỤC 3: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ QUÁ TRÌNH THẨM ĐỊNH Sắc ký đồ độ ổn định hệ thống Sắc ký đồ độ lặp lại - mẫu LL-06 PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT Sắc ký đồ khảo sát chiết lần Sắc ký đồ khảo sát chiết lần PHỤ LỤC 5: MỘT SỐ KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU PL 5.1 Hàm lượng nhãn Chất phân tích Nhãn Khối lượng trung bình viên 4-HD 2,2mg/ viên XA 4mg/ viên 0,511 Hàm lượng nhãn mg/g ppm 4,31 172,21 7,83 313,11 PL 5.2: Phương pháp chiết 4-HD Mẫu Khối lượng cân Diện tích (mAu.s) Nồng độ (ppm) XA HLSVN (%) Diện tích (mAu.s) Nồng độ (ppm) HLSVN (%) Siêu âm 30 phút PP - 01 0,3000 2478920 47,33 91,61 3669179 77,26 82,25 PP - 02 0,2965 2456001 46,91 91,88 3663423 77,14 82,31 Trung bình 91,75 82,67 Lắc ngang PP - 03 0,2012 1409442 27,95 80,67 2140662 46,44 73,71 PP - 04 0,1993 1404696 27,87 81,19 2039696 44,40 71,15 Trung bình 80,93 72,43 PL 5.3: Nhiệt độ chiết số lần chiết Mẫu Khối lượng cân Diện tích (mAu.s) 4-HD Nồng độ HLSVN (%) (ppm) Nhiệt độ chiết Diện tích (mAu.s) XA Nồng độ (ppm) HLSVN (%) 45oC 45 - 0,1952 1476565 27,76 82,58 2225162 45,26 74,05 45 - 0,2014 1659887 30,94 87,99 2487079 50,30 78,67 Trung bình 85,29 76,36 60oC 60 - 0,2057 1670919 31,14 87,89 2501039 50,57 78,52 60 - 0,2058 1670309 31,12 87,82 2501668 50,58 78,50 Trung bình 87,86 78,51 Nhiệt độ phòng - lần chiết Ph - 01 0,3021 2565417 46,67 89,72 3800387 75,59 79,91 Ph - 02 0,2969 2587668 47,06 92,04 3636689 72,43 77,92 Trung bình 90,88 78,91 Nhiệt độ phòng - lần chiết 2C - 0,2223 1778719 33,01 86,69 2740760 55,19 79,71 2C - 0,2011 1650201 30,78 88,34 2421285 49,03 77,41 Trung bình 87,51 78,56 PL 5.4: Tỷ lệ dung môi chiết Mẫu Khối lượng cân 4-HD Diện tích (mAu.s) Nồng độ (ppm) XA HLSVN (%) Diện tích (mAu.s) Nồng độ (ppm) HLSVN (%) MeOH/H2O : 7/3 KS - 01 0,1993 1657041 29,47 85,86 2357612 45,56 73,00 KS - 02 0,2082 1625969 28,95 80,75 2377681 45,92 70,45 Trung bình 83,31 71,12 MeOH/H2O : 8/2 KS - 03 0,2991 2563015 48,12 93,42 3288762 77,17 82,40 KS - 04 0,2947 2484579 43,80 85,15 3701571 70,67 76,17 Trung bình 89,28 79,28 MeOH/H2O : 9/1 KS - 05 0,1964 1662609 29,56 87,41 2592742 49,88 81,12 KS - 06 0,1989 1761318 31,20 91,09 2619596 50,38 80,89 Trung bình 89,25 81,00 MeOH 100% KS - 07 0,1992 1551798 27,72 80,81 2393403 46,21 74,09 KS - 08 0,2013 1730955 30,70 88,55 2664619 51,20 81,24 Trung bình 84,68 77,67 PHỤ LỤC 6: KẾT QUẢ ĐỘ THU HỒI PL 6.1: Kết độ thu hồi với 4-HD Mức chuẩn Nồng độ thấp: 9,4 ppm Nồng độ trung bình 28,2 ppm Nồng độ cao 56,4 ppm Mẫu Diện tích peak (mAu,s) Nồng độ thu hồi (ppm) Độ thu hồi (%) TH - 01 478819 9,61 102,3 TH - 02 484394 9,70 103,2 TH - 03 488255 9,77 103,9 TH - 04 1570791 27,67 98,1 TH - 05 1652048 29,01 102,9 TH - 06 1638037 28,78 102,1 TH - 07 3371603 57,44 101,9 TH - 08 3305693 56,35 99,9 TH - 09 3307093 56,38 100,0 PL 6.2: Kết độ thu hồi với XA Mức thêm chuẩn Nồng độ thấp: 10,7 ppm Nồng độ trung bình 53,5 ppm Nồng độ cao 107 ppm Mẫu Diện tích peak (mAu,s) Nồng độ thu hồi (ppm) Độ thu hồi (%) TH - 01 477777 9,97 93,2 TH - 02 503759 10,45 97,7 TH - 03 503500 10,44 97,6 TH - 04 2726678 51,68 96,6 TH - 05 2714982 51,46 96,2 TH - 06 2638465 50,04 93,5 TH - 07 5327165 99,92 93,4 TH - 08 5157096 96,76 90,4 TH - 09 5196300 97,49 91,1 PHỤ LỤC 6: QUY ĐỊNH AOAC PL 6.1: Độ lặp lại tối đa chấp nhận theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất phân tích Đơn vị RSD (%) 100 100% 1,3 ≥ 10 10-1 10% 1,9 ≥1 10-2 1% 2,7 ≥ 0,1 10-3 0,1% 3,7 0,01 10-4 100 ppm 5,3 0,001 10-5 10 ppm 7,3 0,0001 10-6 ppm 11 0,00001 10-7 100 ppb 15 0,000001 10-8 10ppb 21 10 0,0000001 10-9 ppb 30 PL 6.2: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 2016 TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất phân tích Đơn vị Độ thu hồi (%) 100 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 ... ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ TRUNG KIÊN 140 1338 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 4- HYDROXYDERRICIN VÀ XANTHOANGELOL TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHALCONE BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ... cứu - Xây dựng quy trình chiết xuất đồng thời XA, 4- HD mẫu thực phẩm chức chứa chalcon - Khảo sát điều kiện HPLC PDA để định lượng đồng thời 4- HD XA - Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng. .. tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời hàm lượng 4- Hydroxyderrcin Xanthoangelol thực phẩm chức chứa chalcon - Ứng dụng quy trình xây dựng để định lượng sản phẩm chức Chalcone lưu