Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin và các chất chuyển hóa trong huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ CÁC CHẤT CHUYỂN HĨA TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Tạ Mạnh Hùng PGS.TS Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đoàn Cao Sơn, TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, hai người thầy tận tình hướng dẫn quan tâm giúp đỡ suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô công tác Bộ mơn Hóa Phân tích - độc chất dạy giúp đỡ thời gian học tập trường Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới đồng nghiệp Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương động viên, giúp đỡ chia sẻ với tơi q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ động viên để tơi có đủ nghị lực, tâm hoàn thành luận văn Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn hỗ trợ, động viên, khích lệ Q Thầy, Cơ, Cơ quan, Bạn bè Gia đình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Hà nội, ngày 31 tháng 03 năm 2019 Học viên: Nguyễn Thị Dung MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ATORVASTIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA 1.1.1 Cơng thức cấu tạo tính chất lý hóa 1.1.1.1 Công thức cấu tạo 1.1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.2 Các đặc tính dược lý, dược động học 1.1.2.1 Tác dụng dược lý 1.1.2.2 Chỉ định [2] 1.1.2.3 Liều lượng cách dùng [2] 1.1.2.4 Dược động học 1.1.3 Một số phương pháp định lượng atorvastatin chất chuyển hóa dịch sinh học 1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1.2.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 1.2.2 Phân tích thuốc dịch sinh học phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI) 10 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu 11 1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization) 11 1.2.2.3 Bộ phận phát (detector) 13 1.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 13 1.2.3.1 Độ chọn lọc 13 1.2.3.2 Giới hạn định lượng 14 1.2.3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 14 1.2.3.4 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 14 1.2.3.5 Ảnh hưởng mẫu 15 1.2.3.6 Độ thu hồi hoạt chất chuẩn nội 15 1.2.3.7 Đánh giá khả nhiễm chéo 15 1.2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định hoạt chất dịch sinh học 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 17 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Mẫu huyết tương 18 2.2.2 Thuốc nghiên cứu (trong đánh giá tương đương sinh học) 18 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 18 2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định AT, o-AT, p-AT 18 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 19 2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương 19 2.3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: 20 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20 2.3.3 Xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT mẫu huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học chế phẩm Atorvastatin23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 25 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT 25 3.1.1.1 Điều kiện khối phổ định lượng AT 25 3.1.1.2 Điều kiện khối phổ định lượng o-AT p-AT 28 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29 3.1.3 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương 31 3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 35 3.1.5 Kết xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng AT, o-AT p-AT huyết tương 35 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 37 3.2.1 Sự phù hợp hệ thống LC-MS/MS 37 3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc phương pháp 38 3.2.3 Xác định giới hạn định lượng (LLOQ) 41 3.2.4 Xây dựng đường chuẩn khoảng tuyến tính 44 3.2.5 Độ đúng, độ xác phương pháp 45 3.2.5.1 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 45 3.2.5.2 Độ đúng, độ xác pha loãng mẫu lần 46 3.2.6 Ảnh hưởng mẫu 46 3.2.7 Xác định tỷ lệ thu hồi chất phân tích chuẩn nội 47 3.2.8 Độ nhiễm chéo 49 3.2.9 Nghiên cứu độ ổn định 50 3.2.9.1 Độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc 50 3.2.9.2 Độ ổn định dung dịch chuẩn nội làm việc nhiệt độ phòng 51 3.2.9.3 Độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn 52 3.2.9.4 Độ ổn định sau chu kỳ đông – rã đông 53 3.2.9.5 Độ ổn định mẫu sau xử lý (trong autosampler) 54 3.2.9.6 Độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 55 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG AT, O-AT, P-AT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NTN 56 CHƯƠNG BÀN LUẬN 64 4.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI AT, OAT VÀ P-AT TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI 64 4.1.1 Lựa chọn phổ khối MS/MS cho AT, o-AT p-AT 64 4.1.2 Kỹ thuật xử lý mẫu 64 4.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 65 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƯƠNG NTN 66 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 69 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AN : Chất phân tích (Analyte) AT : Atorvastatin AUC : Diện tích đường cong (Area under the curve) BMI : Chỉ số khối thể (Body mass index) Cmax : Nồng độ cực đại CTPT : Công thức phân tử CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) DC : Pha loãng DĐH : Dược động học EMA : Cơ quan quản lý Dược Châu Âu (European Medicines Agency) ESI : Ion hóa kiểu phun điện tử (Electrospray ionization) GlI : Glibenclamid HDC : Mẫu pha loãng nồng độ cao HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography) HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High quality control) HT : Huyết tương HTT : Huyết tương trắng IS : Chuẩn nội (Internal standard) LC-MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – Mass spectrometry) LC-MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography – tandem mass spectrometry) LDC : Mẫu pha loãng nồng độ thấp LLOQ : Giới hạn định lượng (Lower limit of quantitation) LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low quality control) m/z : Khối lượng/điện tích MDC : Mẫu pha lỗng nồng độ trung bình MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MF : Hệ số mẫu (Matrix factor) MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ (Medium quality control) NTN : Người tình nguyện o-AT : ortho-hydroxy atorvastatin p-AT : para-hydroxy atorvastatin RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SKD : Sinh khả dụng SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid phase extraction) SQC : Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control) STT : Số thứ tự TB : Trung bình TĐSH : Tương đương sinh học TLTK : Tài liệu tham khảo Tmax : Thời gian đạt nồng độ cực đại ULOQ : Giới hạn định lượng (Upper limit of quantitation) US-FDA : Cơ quan quản lý thuốc thực phẩm Mỹ v/v : Thể tích/thể tích (United States – Food and Drug Administration) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Giá trị số thông số dược động học AT, o-AT, p-AT Bảng 1.2 Một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT, o-AT, pAT HT Bảng 2.1- Cách chuẩn bị mẫu chuẩn huyết tương 21 Bảng 2.2- Cách chuẩn bị mẫu kiểm tra huyết tương 22 Bảng 2.3- Cách chuẩn bị mẫu pha loãng huyết tương…………… 22 Bảng 3.1- Tỷ lệ thu hồi AT, o-AT, p-AT chiết dung môi khác nhau…………………………………………………………………… 34 Bảng 3.2- Điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT IS 36 Bảng 3.3- Sự phù hợp hệ thống LC-MS/MS 38 Bảng 3.4- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu AT IS 39 Bảng 3.5- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu o-AT p-AT 39 Bảng 3.6- Đáp ứng pic mẫu LLOQ Zero 42 Bảng 3.7- Độ – độ xác mẫu LLOQ 43 Bảng 3.8- Kết khảo sát đường chuẩn AT, o-AT, p-AT 44 Bảng 3.9- Độ đúng, độ xác ngày khác ngày AT, o-AT, p-AT 45 Bảng 3.10- Độ đúng, độ xác khác pha loãng mẫu lần 46 Bảng 3.11- Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu AT 47 Bảng 3.12- Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu o-AT p-AT 47 Bảng 3.13- Kết xác định tỷ lệ thu hồi AT, o-AT p-AT 48 Bảng 3.14- Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS 49 Bảng 3.15- Kết đánh giá độ nhiễm chéo- AT 49 Bảng 3.16- Kết đánh giá độ nhiễm chéo- o-AT p-AT 50 Bảng 3.17- Kết độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc 51 Bảng 3.18- Kết độ ổn định dung dịch IS làm việc nhiệt độ phòng 51 Bảng 3.19- Kết độ ổn định mẫu HT nhiệt độ phòng 52 Bảng 3.20- Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đông – rã đông 53 Bảng 3.21- Kết độ ổn định mẫu sau xử lý autosampler 54 Bảng 3.22- Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 55 Bảng 3.23- Nồng độ trung bình AT, o-AT, p-AT huyết tương 27 NTN 59 Bảng 3.24- Thống kê mô tả số thông số dược động học AT NTN Việt Nam 60 Bảng 3.25- Thống kê mô tả số thông số dược động học o-AT NTN Việt Nam 61 Bảng 3.26- Thống kê mô tả số thông số dược động học p-AT NTN Việt Nam 62 ... chuyển chất phân tích hồ tan dung mơi sang dung mơi khác không đồng tan [1] Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan hoạt chất dung mơi chiết, tính phân cực dung mơi chiết, pH pha nước, hệ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THI T BỊ NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Chất chuẩn, dung mơi, hóa chất 17 2.1.2 Thi t bị, dụng cụ phân tích 17 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN... định dung dịch) độ mẫu ổn định nằm khoảng 85% - 115% so với nồng độ lý thuyết ban đầu 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THI T BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Chất chuẩn, dung