Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 2002- 2007)

Người hướng dẫn : Th.s Nguyễn Tường Vy

CN Vũ Tùng Lâm Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích

Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 03/2007- 05/2007

đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.

Đồng thời tôi cũng chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô và cấc kỹ thuật viên tại bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.

Sinh viên

Phạm Thị Quỳnh Hoa

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ È 1

PHẦN 1: TỎNG QUAN 2

1.1 DẦU GẤC 2

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm 2

1.1.2 Thành phần hoá học 2

1.1.3 Tác dụng và công dụng 2

1.2 BETA- CAROTEN 3

1.2.1 Công thức cấu tạ o 3

1.2.2 Tính chất 4

1.2.3 Tác dụng 4

1.2.4 một số phương pháp định lượng 4

1.3 LYCOPEN 5

1.3.1 Công thức cấu tạ o 5

1.3.2 Tính chất 5

1.3.3 Tác dụng 5

1.3.4 Phương pháp định lượng 5

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ Ị3-CAROTEN TRONG DẦU GẤC 6

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐồNG THỜI LYCOPEN VÀ Ị3-CAROTEN 7

1.6 PHƯƠNG PHÁP HPLC 8

1.6.1 Khái niệm 8

1.6.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột 8

1.6.3 Pha tĩnh, pha động trong HPLC 9

1.6.4 Các đại lượng đặc trưng 10

1.6.5 Các cách tính kết quả 12

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 14

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị và hoá chất 14

2.1.3 Nội dung và phương pháp thực nghiệm 15

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 16

2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết xuất lycopen và ị3-caroten trong dầu gấc 16

2.2.2 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký 17

2.2.3 Đánh giá phương pháp định lượng 21

2.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 28

2.2.5 ứng dụng chương trình đã xây dựng để định lượng một số mẫu dầu gấc 30

2.3 BÀN LUẬN 33

KẾT LUẬN 34

CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

EtOAC : Ethyl acetat

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao.

MTBE : Methyl-tert-butyl ether.

MeOH : Methanol

THF : Tetrahydrofuran

ĐẬT VẤN ĐÈ

Gấc (Momordica cochinchinensỉs (Lour.) Spreng, họ Bí (Curcubitaceae))

là loại cây rất quý của nước ta Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng quả gấc như một nguồn thực phẩm bổ dưỡng, dùng dầu ép từ màng đỏ quả gấc để làm thuốc Các nhà khoa học đã nghiên cứu, phát hiện trong màng đỏ bao quanh hạt gấc có rất nhiều chất dinh dưỡng: beta-caroten, lycopen, vitamin E, dầu thảo mộc Khi vào trong cơ thể, beta-caroten sẽ biến thành vitamin A Vì thế người ta dùng dầu gấc để chữa bệnh trẻ em chậm lớn, thiếu vitamin A, khô mắt, quáng gà, chữa bệnh người lớn kém ăn mệt mỏi Beta-caroten và lycopen

có tác dụng phòng một số loại ung thư Beta- caroten phòng và chữa bệnh ung thư đường tiêu hóa và dạ dày, ung thư phổi Lycopen có tác dụng phòng chống ung thư đường tiêu hóa, ung thư tuyến tiền liệt Do có nhiều tác dụng tốt như vậy, nên việc chiết xuất dầu gấc ngày càng phát triển để đáp ứng đủ nhu cầu nguyên liệu cho công nghệ thực phẩm trong nước và xuất khẩu

Dược điển Việt Nam I, tập 1 đã đưa ra phương pháp định lượng dầu gấc bằng đo phổ hấp thụ u v - VIS Tuy nhiên phương pháp này chỉ định lượng được (3-caroten trong khi lycopen cũng là một thành phần quan trọng có hoạt tính sinh học cao hiện nay đang được quan tâm rất nhiều Vì vậy chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời

p-caroten và lycopen trong dầu gấc ” với mục tiêu cụ thể sau:

- Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định lượng đồng thời

[3-'■ -— Jcaroten và lycopen trong dầu gấc

- ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng |3-caroten và lycopen trong nguyên liệu dầu gấc

Độ hoà tan: dễ tan trong ether dầu hoả, cloroform và ether.

Ngoài ra còn có một số chất vi lượng cần thiết cho cơ thể như đồng, sắt, coban, kẽm và selen, một chất mới được biết rất cần thiết để phòng chống ung thư [6 ]

- Dùng ngoài bôi vào vết thương, vết bỏng làm mau lên da non, chóng lành Dầu gấc dùng kèm một số kháng khuẩn đặc biệt chữa được bệnh trứng

1.1.4 Các phương pháp sản xuất dầu gấc

Muốn chế dầu gấc, trước hết cần sấy khô màng hạt gấc, sau đó tán nhỏ rồi

áp dụng một trong các phương pháp sau [6]:

> Chiết bằng dung môi (ether dầu hoả): Lấy kiệt bằng ether dầu hoả Sau

đó thu hồi ether bằng cách đun cách thuỷ trong bầu khí trơ Cặn còn lại là dầu gấc

> Ép: Màng đỏ đã sấy khô tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép.

> Phương pháp thủ công nghiệp: Màng hạt gấc đã sấy khô tán nhỏ cho

vào dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60-70° Dầu lạc hay mỡ lợn sẽ hoà tan chất dầu chứa trong màng dầu gấc

Dầu gấc được bảo quản trong chai màu, nút kín

1.2 BETA- CAROTEN

1.2.1 Công thức cấu tạo

Tên khác: Ị3,ị3- caroten, carotaben, provaten, solaten.

Tên khoa học: (all E)- 3, 7, 12, 16- tetramethyl- 1, 18- bis(2, 6, 6- trimethyl

cyclohex- 1-enyl) octadeca-1, 3, 5,7,9,11,13,15,17- nonaene

độc như vitamin A Cơ thể người tích luỹ (3-caroten ở gan và khi cần thì

enzym gan sẽ phần ly P-caroten thành 2 phân tử vitamin A

- Ị3-caroten còn có tác dụng chống oxy hoá, ngăn ngừa ung thư

- Trong công nghiệp thực phẩm P-caroten được dùng làm phẩm màu

- Lycopen là một chất có hoạt tính chống oxy hoá mạnh.

- Có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và ung thư, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt

- Lycopen còn được sử dụng như một chất màu thực phẩm

• Tốc độ dòng: l,2mL/phút.

• Detector: 472nm

• Thể tích tiêm: 10(0.1

• Nhiệt độ cột: 30°c

• Thời gian chạy: 12 phút

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ p-CAROTEN TRONG DẦU GẤC

❖ Phương pháp 1

Cân chính xác khoảng 0,5g dầu gấc vào bình nón nút mài dung tích lOOmL, thêm 30mL dung dịch KOH 2N trong ethanol (TT), đung sôi hồi lưu trong cách thuỷ 30 phút Sau đó làm lạnh nhanh rồi dùng 20mL nước cất để chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, acid hoá dung dịch bằng acid HC1 đặc đến

pH khoảng 4-5, chiết 3 lần, mỗi lần với 30mL ether dầu hoả (40-60°C) Rửa dịch chiết ether dầu với nước cất 3 lần, mỗi lần 70mL Lọc dịch chiết ether dầu qua phễu có natrisulfat khan vào bình thuỷ tinh, dùng 30mL ether dầu để tráng phễu và bình gạn Để dịch lọc ether dầu bay hơi tự nhiên đến cạn Dùng 40mL dicloromethan để chuyển hết cắn thu được vào bình định mức màu nâu 50mL, lắc đều và thêm dicloromethan vừa đủ đến vạch, trộn đều Hút chính xác 5mL dung dịch vào bình định mức 20mL, thêm dicloromethan vừa đủ, trộn đều Lọc qua màng lọc 0,45p.m Thu được dung dịch thử [5]

❖ Phương pháp 2

Cân chính xác khoảng 0,75g dầu gấc vào bình định mức 20mL, thêm 15

mL ether dầu hoả (40-60° C) lắc kỹ cho tan, định mức đến vạch bằng ether dầu hoả Hút chính xác 2,0mL dung dịch này chuyển vào một cột thuỷ tinh có chứa lg bột nhôm oxyd (đã được hoạt hoá) Cho 20mL ether dầu hoả (40- 60°C) chảy qua cột với tốc độ khoảng 30-35 giọt/phút Hứng lấy dịch chiết

ether dầu hoả, tiếp tục cho 30mL dicloromethan chảy qua với tốc độ như trên Gộp dịch chiết dicloromethan và dịch chiết ether dầu hoả, để bay hơi tự nhiên đến cạn Dùng dicloromethan để hoà tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức thuỷ tinh màu nâu lOmL, thêm dicloromethan đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc cỡ 0,45|im, thu được dung dịch thử [8].

Thời gian (phút) Dung môi A Dung môi B Dung môi c

- Phương pháp 3 [25]:

• Cột C30 (YMC Inc Wilmington, NC), 250mm X 4,6mm, 3|j,m

• Pha động: MTBE: MeOH: EtOAC (40:50:10)

1.6.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột:

Nạp mẫu phân tích gồm các chất A, B, c vào cột tách, đồng thời cho dung môi pha động chảy qua cột, kết quả là các chất A, B, c sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách ở đây là tống của các tương tác:

F3Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rữa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại Đối với mỗi chất

sự lưu giư được quy định bởi 3 lực thành phần: FI, F2, F3 Trong đó FI, F2 là quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

F1 là lực giữ chất trên cột.

F2 là lức kéo nó ra khỏi cột

Như vậy, các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột [13]

1.6.3 Pha tĩnh, pha động trong HPLC

1.6.3.1 Pha tĩnh:

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, hạt thường là hình cầu và kích thước rất nhỏ, đường kính hạt từ 3- 10ụm, diện tích bề mặt riêng từ 50- 500m2/g

Điều kiện đối với pha tĩnh:

- Phải trơ và bền với các điều kiện cuả môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trongnhững điều kiện nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Hạt phải đồng nhất

1.6.3.2 Pha động :

Pha động là dung môi để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách, thực hiện quá trình sắc ký Nó có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay cũng có thể là hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn vào nhau theo một tỷ lệ phù hợp Nó cũng có thể là dung dịch của các muối chứa các chất đệm, chất tạo phức

Điều kiện đối với pha động:

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Phải hoà tan được các chất phân tích

- Ben với thời gian

- Có độ tinh khiết cao.

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detector sử dụng

- Phải kinh tế, không quá đắt và hiếm

1.6.4 Các đại lượng đặc trưng

s i g n a l C o m p o n e n t C o m p o n e n t

• Thời gian lưu (t,.):

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh

+ Bản chất thành phần, tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp cũng phụ thuộc pH của pha động

Hệ số dung lượng là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất qua cột Cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa của cột.

B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A

Để tách hai chất cần có a >1, thường dùng trong khoảng 1,05-2,0 Nếu

a quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài

Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lóp sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng Những lóp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết

H là chiều cao đĩa lý thuyết:

N

SỐ đĩa lý thuyết được tính bằng công thức sau:

N = 16(— ) 2 = 5,54(— ) 2

W: chiều rộng đo ở đáy pic

W0 5: chiều rộng đo ở nữa chiều cao pic

Thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho

RB t r a ) _ t RA ) _ _1 k ' B

R = 0,75 : hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1 : hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 : hai pic tách nhau gần như hoàn toàn, chỉ xenphủ nhau 0,3%

• Phương pháp ngoại chuẩn:

Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy

sc: diện tích pic chuẩn

• Phương pháp nội chuẩn:

Người ta chọn một chất chuẩn thứ hai đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Chất thêm vào này gọi là chuẩn nội Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thòi gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân

tích nhưng phải được tách hoàn toàn và có nồng độ tương đương, cấu trúc hoá học tương tự [12].

sr

C T = ^ - C n x F x

Yếu tố hiêu chỉnh: Fỵ = S " X C('

sc X c„

Cn: nồng độ dung dich nội chuẩn

Cc: nồng độ dung dịch ngoại chuẩn

Sn: diện tích pic chuẩn nội

sc: diện tích pic chuẩn ngoại.

• Phương pháp thêm chuẩn'.

Thêm vào mẫu thử một lượng xác định chất chuẩn Tiến hành sắc ký cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử đã thêm chất chuẩn trong cùng điều kiện [12]

Ac: là lượng chất chuẩn thêm vào

As: là phần tăng của diện tích pic

• Phương pháp tính theo % diên tích pic:

Hàm lượng phần trăm của các chất cần phân tích trong mẫu được tính bằng phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Kết quả chỉ tương đối và nó đòi hỏi mọi chất trong mẫu đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau [12]

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1.1 Đối tượng nghiên cửu

Chúng tôi sử dụng 8 mẫu dầu gấc do công ty TNHH Hải Linh cung cấp Các mẫu này có nguồn gốc khác nhau

Bảng 1: Các mẫu dầu gấc được dùng để nghiên cứu.

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent - Detetor UV- VIS

- Cân phân tích Sartorius (10'4)

- Máy lắc siêu âm

- Bình định mức có nút mài, pipét và các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết khác

- Cột sắc ký thuỷ tinh dài 20cm, đường kính trong lcm, phía dưới có vòi khoá

2.ỉ 2.2 Hoá chất:

- Bột nhôm oxyd trung tính được hoạt hoá ở 120°c trong 3 giờ.

- Ether dầu hoả (40-60°C) PA

- Dicloromethan PA

- Dung dịch kali hydroxyd 2N trong ethanol

- Dung dịch HC1 đặc

- Methanol loại dùng cho HPLC

- Acetonitril loại dùng cho HPLC

- Dicloromethan loại dùng cho HPLC

Chất chuẩn sử dụng trong phân tích gồm:

- Chuẩn làm việc lycopen (Roche)

- Chuẩn P-caroten 95% (C 9750) Sigma

2.1.3 Nội dung và phương pháp thực nghiệm

caroten trong dầu gấc

2.1.3.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký:

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao detector UV- VIS

Trên cơ sở có sẵn cột RP18 (250mm X 4mm, lOịim ) chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho phép phân tích đồng thời |3-caroten và lycopen:

- Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

2.1.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

2.1.3.5 ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng một số mẫu dầu gấc

2.1.3.6 Một số công thức tính thống kê xử lý kết quả

Tuy nhiên quá trình để bay hơi dung môi ở môi trường tự nhiên tương đối lâu Với điều kiện của phòng thí nghiệm chúng tôi cho bay hơi dung môi bằng cách sục khí trơ (khí N2) Phương pháp này vừa rút ngắn thời gian chuẩn

bị mẫu, vừa làm giảm nguy cơ chất phân tích bị oxy hoá khi tiếp xúc với môi trường tự nhiên Vì vậy chúng tôi đưa ra phương pháp chiết đồng thời lycopen

và [3-caroten như sau:

Cân chính xác khoảng lg dầu gấc vào bình định mức 25mL, thêm 10

mL ether dầu hoả (40-60°C) lắc kỹ cho tan, định mức đến vạch bằng ether dầu hoả Hút chính xác 2,0mL dung dịch này chuyển vào một cột thuỷ tinh có

chứa lg bột nhôm oxyd (đã được hoạt hoá) Cho 20mL ether dầu hoả (40- 60°C) chảy qua cột với tốc độ khoảng 30 giọt/phút Hứng lấy dịch chiết ether dầu hoả, tiếp tục cho 30mL dicloromethan chảy qua với tốc độ như trên Gộp dịch chiết dicloromethan và dịch chiết ether dầu hoả, làm bay hơi dung môi đến cắn bằng dòng khí nitơ Dùng dicloromethan để hoà tan và chuyển toàn

bộ cắn vào bình định mức thuỷ tinh màu nâu 20mL, định mức bằng dicloromethan đến yạch, lắc đều, lọc qua màng lọc cỡ 0,45|j.m, thu được dung dịch thử

2.2.2 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký

• Lựa chọn thành phần pha động:

Căn cứ vào đặc điểm của các carotenoid là những chất không hoặc rất ít phân cực, tan tốt trong các dung môi có độ phân cực thấp (tetrahydrofuran, dicloromethan, cloroform, acetonitril )- Dựa trên một số tài liệu tham khảo,

và điều kiện hiện có, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ với nhiều hệ pha động khác nhau Từ kết quả khảo sát sơ bộ, chúng tôi nhận thấy với hỗn hợp 3 chất: methanol, acetonitril và dicloromethan, (3-caroten và lycopen phân tách tốt, các pic nhọn và cân đối Vì vậy từ 3 chất trên chúng tôi tiếp tục khảo sát để lựa chọn chương trình gradient tối ưu cho pha động

Các chương trình gradient khảo sát:

Chương trình 1:

Thời gian

(phút)

Acetonitril(%)

Methanol(%)

Dicloromethan(%)