Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Xây dựng phương pháp định lượng alpha tocopherol trong dầu gấc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BÔ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

KIỂU THỊ HƯỜNG

ALPHA-TOCOPHEROL TRONG DẦU GÂC BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2002-2007)

Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Tường Vy

DS Bùi Đinh Sơn

Nơi thực hiện: Bộ môn hóa phân tích- Trường ĐH Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện: Tháng 11/2006- 4/2007

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, lời đầu tiên cho phép tôi

được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới cô giáo Th.s

Nguyễn Tường Vy, giảng viên bộ môn hóa Dược là người đã chỉ bảo tận tình

và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Bùi Đình Sơn, giảng viên bộ môn hóa

phân tích, là người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tiến hành khóa luận

Cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn hóa phân tích đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện thí nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè đã giúp đỡ và

ở bên tôi trong thời gian qua.

Hà nội, tháng 5 năm 2007

Sinh viên

Kiều Thị Hường.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 DẦU GẤC 3

1.1.1 Nguồn gốc, phương pháp điều chế [9] .3

1.1.2 Tính chất [5] .3

1.1.3 Thành phần hoá học .3

1.1.4 Tác dụng dược lí [9] 4

1.1.5 Công dụng và liều dùng [9] 5

1.2 ALPHA-TOCOPHEROL (A T) 5

1.2.1 Công thức [23] 5

1.2.2 Nguồn gốc [2 ] 5

1.2.3 Tính chất [2,24] 5

1.2.4 Công dụng [2,17] 6

1.2.5 Một số phương pháp định lượng AT 6

1.3 Tổng quan về phương pháp HPLC [4,10,12] .8

1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột [10] 8

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký [4] 9

1.3.4 Cơ sở lí thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký[4,12] 12

1.3.5 Các cách tính kết quả [2,3,7]: 14

PHẦN 2:THựC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHAT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 16

2.1.1 Đối tượng 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 16

2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên c ứ u 17

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .19

2.2.1 Lựa chọn quy trình chiết vit E: .19

2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc k ý 21

2.2.3 Thẩm định phương pháp định lượng 23

2.3 ÁP DỤNG PHUƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỤNG ĐỊNH LUỢNG AT TRONG CHẾ PHẨM DẦU GẤC 30

2.4 BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP 32

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUÂT 34

3.1 KẾT LUẬN 34

3.2 ĐỀ XUẤT 34

CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

AT : Alpha-tocopherol

DAD : Detector tử ngoại-khả kiến.FID : Detector ion hóa ngọn lửa.HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao.STT : Số thứ tự

TB : Trung bình

USP : Dược điển Mỹ

ĐẬT VÂN ĐỂ

Gấc (Momordỉca chochinchinensis spreng) là loại cây mọc hoang dại

và được trồng khắp nơi ở Việt Nam, nhiều nhất ở các tỉnh đồng bằng và trung

du Bắc Bộ Bên cạnh việc dùng quả gấc như một loại thực phẩm độc đáo, nhân dân ta đã biết khai thác nhiều công dụng khác nhau từ rễ gấc và hạt gấc [9]; Trong đó, dầu gấc ép từ màng đỏ bao quanh hạt gấc đã được sử dụng từ năm

1942 Cho đến nay, nhờ những nghiên cứu chứng minh về tác dụng sinh học của nó đối với sức khỏe con người [9,18] dầu gấc đã trở thành một chế phẩm được đầu tư sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu đang ra tăng của thị trường dược phẩm trong và ngoài nước Việc xây dựng được các quy trình định tính và định lượng các thành phẩn hoá học trong dâu gấc không chỉ có ý nghĩa minh chứng khoa học cho những công dụng đã được thừa nhận mà còn

là cơ sở cho việc định hướng biện pháp trồng trọ t, thu hái và chế biến gấc một cách khoa học, hợp lí

Thành phần hóa học của dầu gấc đã được một số tác giả nghiên cứu, cho thấy dầu gấc là một loại thực phẩm giàu Carotennoid, acid béo no và không no [9,13], bên cạnh đó dầu gấc còn có các kim loại vi lượng và vitamin

E [7,9,18] Vitamin E là một trong 13 vitamin thiết yếu cho sự trao đổi chất,

sự phát triển của cơ thể và là chất chống lão hóa toàn diện Trong số 8 vitamin

E tồn tại trong tự nhiên, alpha-tocopherol là quan trọng nhất vì nó chiếm tới 90% trong số các Tocopherol trong các tổ chức của động thực vật và có hoạt tính vitamin E cao nhất [2]

Hiện nay phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng rộng rãi để phân tích định tính và định lượng vitamin E vì phương pháp này cho kết quả có độ chính xác cao và phù hợp vói điều kiện của nhiều phòng thí nghiệm Ngoài vitamin E, trong dầu gấc còn chứa một lượng lớn các chất như acid béo, carotenoid nên trước khi đem định lượng bằng HPLC cần phải có

giai đoạn tách chiết và làm sạch mẫu phân tích Trên cơ sở tham khảo một số quy trình đã công bố và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm của Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành đề tài: " Định lượng alpha-Tocopherol trong dầu gấc bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Nguồn gốc, phương pháp điều chế [9]

Nguồn gốc: Dầu gấc (oleum Momordica) là dầu ép từ màng đỏ phơi hay sấy khô của hạt cây gấc (Momordica cochinchinensis spreng), họ bí (c ucurbỉtaceae).

Phương pháp điều chế: Dầu gấc được điều chế bằng cách sấy khô

màng hạt gấc, sau đó tán nhỏ, rồi áp dụng một trong các phương pháp sau đây:

> Chiết bằng dung môi: lấy kiệt dầu bằng dung môi hữu cơ, sau đó thu hồi dung môi, cặn còn lại là dầu gấc

> Phương pháp ép: màng đỏ đã sấy khô tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép ra được dầu gấc Dầu ép khi để lâu hay để trong tủ lạnh cũng phân thành hai lớp như dầu chiết bằng dung môi

> Phương pháp thủ công nghiệp: cho màng hạt gấc đã sấy khô tán nhỏ vào dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60-70°C Dầu lạc hay

mỡ lợn sẽ hòa tan chất dầu trong màng gấc Dầu này dùng trong gia đình hay dùng trong một thời gian ngắn

1.1.2 Tính chất [5]

Dầu gấc có tính chất lỏng sánh, trong, màu đỏ máu, mùi thơm đặc biệt,

vị béo, không khé cổ Nếu để lâu hoặc ở nhiệt độ 0-5°C có cặn thì cặn đó

thuộc loại tinh thể Carotenoid

Độ hoà tan: dễ tan trong ether dầu hỏa, cloroform và ether

Tỷ trọng dầu gấc ở 15°c là 0,9151- 0,9156

Chỉ số khúc xạ của dầu gấc ở 20°c là 1,4681- 1,4685

1.1.3 Thành phần hoá học

Theo tài liệu nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi và một số tác giả khác về thành phần hóa học trong dầu gấc cho thấy dầu gấc giàu beta-caroten, lycopen và các acid béo không no Trong dầu gấc có trên 0,1% â-caroten, lycopen, các acid béo không no (acid oleic 44,4%, acid palmatic 33,8%, acid linoleic 14,7%, acid stearic 7,69%) [1,9]

Ngoài ra, trong dầu gấc còn có một số kim loại vi lượng cần thiết cho

cơ thể như đồng, sắt, coban, và đặc biệt là kẽm và selenium (một chất mới được biết rất cần thiết để phòng chống ung thư) [9,17]

Bên cạnh đó, vitamin E cũng đã được phát hiện là một thành phần của dầu gấc [7,18]

1.1.4 Tác dụng dược lí [9]

Dầu gấc có tác dụng như những thuốc có vitamin A, đặc biệt khi bôi lên các vết thương, vết loét dầu gấc làm vết thương chóng lành và mau lên da non Uống dầu gấc, bệnh nhân chóng lên cân

Trên súc vật thí nghiệm và trên người bệnh, dầu gấc có khả năng sửa chữa các hư hỏng của nhiễm sắc thể, các khuyết tật về phôi thai do dioxin gây trên động vật, khả năng phòng ung thư cho người bị bệnh xơ gan

1.1.5 Công dụng và liều dùng [9]

Công dụng: dùng trong những trường hợp cần vitamin A hay caroten:

bệnh chậm lớn của trẻ em, biến chứng về mắt (khô mắt, quáng gà), chữa các vết loét, triệu chứng của sức chống đỡ kém của cơ thể, làm cho mau lên da non, trong những vết bỏng, vết thương

Cách dùng và liều dùng:

Dùng trong: với liều 5 giọt một lần, ngày hai lần trước 2 bữa ăn chính,

có thể dùng tới 20 giọt, đối với trẻ em dùng 5 đến 10 giọt một ngày

Dùng ngoài: dưới hình thức thuốc mỡ có 5-10% dầu gấc, có thể dùng

dưới hình thức dầu nguyên chất để bôi bỏng

Trong tự nhiên, AT cũng như các chất khác trong nhóm vit E có nhiều

trong mầm hạt (lúa, mì, ngô và các hạt khác), có trong rau diếp, đậu tương và dầu bông Tất cả cây xanh đều có chứa vit E

Ngoài ra, vit E còn có trong các sản phẩm bơ sữa, trong thịt, trứng, cà rốt, cà chua

Về điều chề: Vitamin E có thể được phân lập từ các sản phẩm tự nhiên,

ngày nay chủ yếu được điều chế bằng phương pháp tổng hợp hóa học

1.2.3 Tính chất [2,24]

Lí tính:

- Là chất lỏng dầu, dính dạng sền sệt

- Trong, không màu hoặc có màu vàng sáng

- Độ tan: không tan trong nước, tan trong ethanol, các dung môi hữu

cơ và dầu béo

Hoá tính:

Do trong phân tử có các nguyên tử cacbon bất đối nên AT có các đồng phân quang học Trong đó các đồng phân hữu tuyền (dạng d) có hoạt tính mạnh hơn các đồng phân tả tuyền (dạng 1)

Trong tự nhiên, AT tồn tại ở dạng d, loại tổng hợp chỉ tồn tại ở dạng

racemic

AT có tính khử mạnh, vì vậy dễ bị oxy hoá, tác nhân xúc tác cho sự oxy hóa là tia tử ngoại, chất béo đã bị ôi, một số muối kim loại nặng và môi trường kiềm

1.2.4 Công dụng [2,17]

AT cũng như các chất khác trong nhóm vit E là một chất chống oxi hoá toàn diện, nó có tác dụng bảo vệ cho các acid béo chứa nhiều dây nối đôi ở màng tế bào và các tổ chức khác của tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do

và bảo vệ cho hồng cầu khỏi sự tan vỡ Nó đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển và duy trì hoạt động của thần kinh và cơ

Thiếu vit E có thể gây bệnh thần kinh ngoại biên, liệt mắt, hoại tử cơ Ngoài ra vit E còn tham gia tạo coenzym của một số hệ enzym

1.2.5 Một số phương pháp định lượng AT.

> Phương pháp đo phổ hấp thụ tử ngoại [2]

Nsuyên tắc: dựa trên tính chất hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại của nhân chroman trong AT, đo độ hấp thụ ở cực đại hấp thụ 292nm hoặc 230nm Có

thể đo phổ hấp thụ tử ngoại trực tiếp hoặc sau khi tách ra bằng các phương pháp sắc ký

> Phương pháp sắc ký khí [23,24]

Nsuyên tắc: dựa vào sự tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do

sự phân bố không đồng đều của chúng vào pha tĩnh là một chất rắn và pha động là một dòng khí chạy qua pha tĩnh Sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại

các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Detector được sử dụng thuộc loại ion hoá ngọn lửa (FID) với nguyên tắc cơ bản là: nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ bị bẻ gãy mạch và bị ion hóa chuyển thành tín hiệu điện và cho kết quả dưới dạng sắc đồ bao gồm các pic Diện tích pic là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu.

> Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

Là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay để định lượng vit E Một số điều kiện HPLC định lượng vit E được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1: Một số điều kiện định lượng AT bằng HPLC

Tàiliệu

1.3 Tổng quan về phương pháp HPLC [4,10,12]

1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lí dùng

để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất rắn Pha rắn có thể được nhồi trong cột hay tráng lên bản mỏng Pha động là khí hay chất lỏng Tuỳ thuộc vào trạng thái của pha động

mà bản chất của hiện tượng sắc ký có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [4]

Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp

HPLC là một phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên cơ sở phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [4]

1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột [10]

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kĩ thuật nhất định Pha tĩnh là một yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Pha tĩnh được liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên kết Nếu pha tĩnh

là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử Khi đặt chất phân tách lên

pha tĩnh ở đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua, chúng ta đã thực hiện quá

trình sắc ký Ví dụ: khi nạp mẫu phân tích gồm các chất A ,B ,C vào cột tách.Kết quả là các chất A,B,C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.Quyết định hiệu quả của sự tách ở đây là tổng hợp của các lực tương tác:

> Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh: F1

> Tương tác giữa chất phân tích và pha động: F2

> Tương tác giữa pha tĩnh và pha động: F3

Theo sơ đồ sau:

Trong đó F1 và F2 đóng vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

1.3.3 Các thông sô đặc trưng của quá trình sắc ký [4].

a Thời gian lưu (tr):

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi chất đã ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của một chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh

+ Bản chất thành phần, tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

b Hệ số phân bố K

K=k cs/cm

Cs và Cm là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là

hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng

chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột K chỉ phụ thuộc vào : Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.

K lớn thì tR lớn, K nhỏ thì tR nhỏ

c Hệ sô dung lượng (K’):

Hệ số dung lượng là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Hệ số dung lượng là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyểncủa chất qua cột Cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộngvới sức chứa của cột

B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A

Để tách hai chất cần có a >1, thường dùng trong khoảng 1,05-2,0 Nếu

a quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài

e S ố đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H:

Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lớp sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết H là chiều cao đĩa lý thuyết

N

H phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh

+ Tốc độ và độ nhớt của pha động

+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột.

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định

Số đĩa lý thuyết được tính bằng công thức sau:

N = 16(— ) 2 = 5,54(-^—)2

W: chiều rộng đo ở đáy pic.

W0 5: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic

Thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ

R = 0,75 : hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1 : hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 : hai pic tách nhau gần như hoàn toàn, chỉ xen phủnhau 0,3%

1.3.4 Cơ sở lí thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký[4,12]

a Lựa chọn cột (pha tình) trong HPLC.

Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp phụ nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ Sắc ký hấp phụ có hai loại là:

• Sắc ký hấp phụ pha thuận

• Sắc ký hấp phụ pha đảo

Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ

bề mặt của pha tĩnh Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ

Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động khôngphân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực Trong sắc ký pha đảothì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực hay ít phân cực

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:

• Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

để phân tích các chất ít hoặc không phân cực

• Silica đã Alkyl hoá: được điều chế bằng cách Akyl hoá các nhóm

OH trên bề mặt Silica bằng các gốc Akyl - R của mạch cacbon (C2 C8 C18) hay các gốc cacbon vòng Do các nhóm OH thân nước được

thay thế bằng các gốc R kị nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã Alkyl hoá được sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.

• Silica Sulfon hoá hay Nitro hoá: để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation Silica amin hoá dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion

b Lựa chọn pha động trong HPLC:

Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2,3 dung môi theo tỷ lệ nhất định Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách

Yêu cầu của một pha động:

• Phải trơ đối với pha tĩnh

• Phải hoà tan được chất mẫu

• Phải bền vững theo thời gian

• Phải có độ tinh khiết cao

• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

• Phù hợp với loại Detector

• Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận thì pha động thuờng là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n_hexan, n_heptan, benzen, cloroform, Các pha động này thuờng được bão hoà nước.

Trong sắc ký pha đảo thì pha động là hệ dung môi phân cực như: Nước, methanol, Acetolnitril, hay hỗn hợp của chúng Các dung môi đó có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

1.3.5 Các cách tính kết quả [2,3,7]:

• Phương pháp ngoại chuẩn'.

Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy

sc: diện tích pic chuẩn

• Phương pháp nội chuẩn'.

Người ta chọn một chất chuẩn thứ hai đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Chất thêm vào này gọi là chuẩn nội Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích nhưng phải được tách hoàn toàn và có nồng độ tương đương, cấu trúc hóa học tương tự

Cc: nồng độ dung dịch chất cần phân tích đã biết nồng độ.Sn: diện tích pic chuẩn nội.

sc: diện tích pic của chất cần phân tích đã biết nồng độ

Fx phải là hằng số trong vùng nồng độ nghiên cứu, khi đó Cj được tính theo công thức:

Cr=%-C xFx

Òn

• Phương pháp thêm chuẩn:

Thêm vào mẫu thử một lượng xác định chất chuẩn Tiến hành sắc

ký cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử đã thêm chất chuẩn trong cùng điều kiện

C T = S r ^

A s

Ac: là lượng chất chuẩn thêm vào

Às: là phần tăng của diện tích pic

• Phương pháp tính theo % diện tích pỉc:

Hàm lượng phần trăm của các chất cần phân tích trong mẫu được tính bằng phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Kết quả chỉ tương đối và nó đòi hỏi mọi chất trong mẫu đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chuẩn dl-a-tocopherol acetat (ll,35mg dl a-Tocopherol acetat tương

ứng với lOmg dl a-tocopherol) của Viện Kiểm Nghiệm Bộ y tế

- Dung môi acetonitril tinh khiết dùng cho HPLC

- Các dung môi benzen, methanol, ether dầu hỏa (40°C-60°C) acidacetic, các hóa chất Na2S04, NaOH, phenolphtalein thuộc loại PA

- Nước cất hai lần

- Nhôm oxyd trung tính dùng cho sắc ký (cỡ hạt 0,063 - 0,2 mm),được hoạt hóa ở nhiệt độ 120°c trong thời gian 4 giờ

- Khí trơ nitơ 99,99%