2.2.3.I. Khảo sát tính thích hợp của hệ thông sắc ký
Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, chúng tôi tiến hành tiêm 5 lần 1 dung dịch mẫu chuẩn dl-a -Tocopherol vào máy sắc ký lỏng theo đúng điều kiện sắc ký đã khảo sát. Đánh giá kết quả theo thông số về sai số tương đối của 5 phép thử song song đối với thời gian lưu và diện tích pic.
Tiến hành:
Pha dung dịch chuẩn'. Cân chính xác khoảng 25mg chuẩn dl-a- Tocopherol acetat cho vào bình cầu có cổ nhám, thêm 40mL dung dịch NaOH 2N trong methanol, thêm viên sủi bọt, lắp ống sinh hàn hồi lưu, đặt bình cầu lên nồi cách thủy, tiến hành xà phòng hóa ở nhiệt độ 70°c trong thời gian 60 phút (xà phòng hóa trong môi trường khí trơ). Hạ nhiệt độ sôi, thêm 20mL methanol, 0,1 mL phenolphtalein 1%. Sau đó trung tính bằng dung dịch acid acetic đặc. Cho mẫu vào bình định mức lOOmL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và thêm methanol đến vạch. Pha loãng dung dịch thu được, lọc qua màng lọc 0,45|um để được dung dịch chuẩn có nồng độ dl-a-Tocopherol khoảng 5,5 Hg/mL.
Tiến hành tiêm 5 lần dung dịch trên, kết quả được thống kê ở bảng 1 và 2
Bảng 2: Giá trị thời gian lưu của a-Tocopherol
STT Nồng độ mẫu bơm (|Xg/mL)
Thời gian lưu
(phút) Số liệu thống kê. 1 5,28 2,98 ĨR = 3,00 s=0,0206 RSD=0,18% 2 5,28 2,98 3 5,28 2,99 4 5,28 3,02
Bảng 3: Giá trị diện tích pic của a-Tocopherol
STT Nồng độ mẫu
bơm (|ig/mL) Diện tích pic Số liệu thống kê.
1 5,28 159,05 5 = 1 5 6 . s=7,83 RSD=5,02% 2 5,28 168,37 3 5,28 152,48 4 5,28 149,93 5 5,28 150,21 Nhận xét:
Sai số tương đối của giá trị thời gian lưu và diện tích pic rất nhỏ. Giá trị các đại lượng đặc trưng như số đĩa lí thuyết và hệ số cân xứng đều trong giới hạn cho phép. Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký lỏng có tính thích hợp cao, đáp ứng được yêu cầu phân tích định lượng.
2.2.3.2. Khảo sát khoảng tuyến tính
Khảo sát khoảng tuyến tính nhằm tìm ra khoảng nồng độ thích hợp để định lượng các chất.
Độ tuyến tính được đánh giá dựa trên sự phụ thuộc của nồng độ giữa chất cần định lượng với diện tích pic của chất đó, thể hiện bằng phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy. Để khảo sát khoảng tuyến tính của dl-a- tocopherol, chúng tôi tiến hành pha một dãy 5 dung dịch chuẩn có nồng độ từ 2,64[ig/mL đến 31,68Ị!g/mL. Chạy sắc kí theo điều kiện sắc kí đã nếu trên.
Tiến hành:
Pha dung dịch chuẩn gốc: chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc theo quy trình ở mục 2.2.3.1 thu được dung dịch chuẩn a - Tocopherol có nồng độ 52,8|ig/mL
Từ dung dịch chuẩn gốc này, hút chính xác 4,0 mL rồi pha loãng trong bình định mức 10,0 mL bằng methanol được dung dịch A. Hút chính xác 5,0 mL dung dịch A pha loãng trong bình định mức 10,0 mL được dung dịch B. Tiếp tục pha loãng như vậy, được dung dịch a - Tocopherol có nồng độ từ 31,68 đến 2,64 |ng/mL.
Tiến hành sắc ký, mỗi nồng độ tiến hành sắc kí 3 lần theo quy trình rồi lấy kết quả trung bình. Kết quả thu được được trình bày trong bảng 4:
Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AT.
Nồng độ (|Hg/ml) 2,64 5,28 10,56 21,12 31,68 Diện tích pic 76,34 159,05 346,87 621,33 1012,4 Phương trình hồi quy Y = 31,6X- 6,91
Hệ số tương quan r = 0,9961
Nhận xét:
Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát, diện tích pic đáp ứng trên sắc đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng, thể hiện qua phương trình hồi quy và hệ số tương quan r > 0,996 (sát vói giá trị 1). Trên cơ sở đó, chúng tôi lựa chọn khoảng nồng độ để khảo sát AT trong chế phẩm dầu gấc là:
3|ig/ml - 30ụ.g/ml.
2.2.3.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Độ chính xác đánh giá mức độ dao động của các phép thử song song. Độ chính xác của phương pháp được biểu thị bằng độ lặp lại hay độ tái hiện.
Vì thời gian khảo sát trong cùng một ngày, do cùng một người thực hiện trong cùng một điều kiện nên chúng tôi tiến hành khảo sát độ chính xác của phương pháp bằng độ lặp lại.
Để xác định độ lặp lại, chúng tôi tiến hành định lượng 5 lần đối với một mẫu dầu gấc, so sánh diện tích pic thu được với diện tích pic của mẫu chuẩn để tính kết quả.
Mẫu dầu gấc và mẫu AT chuẩn được chuẩn bị theo đúng quy trình đã nêu ở mục 2.2.1 và 2.2.3.1. Dung dịch chuẩn có nồng độ 52,8 ỊJ.g/ml. Kết quả hàm lượng của AT trong mẫu dầu gấc được tính theo công thức:
X ( % ) = (s > + b ) x K
a x m ữ
Trong đó:
• X: hàm lượng % (kl/kl) của AT trong mẫu dầu gấc. • St: diện tích pic của mẫu thử.
• a,b: các hệ số của đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic. (a=31,6; b= 6,91)
• K: hệ số pha loãng của mẫu thử. • m0: khối lượng của mẫu dầu gấc.
Độ lặp lại của phương pháp phân tích được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) với n=5. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 5
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
STT Lượng mẫu thử (g)
Hàm lượng AT thu được (|ig)
Hàm lượng X % Số liệu thống kê
1 1,024 213,39 0,02084 x = 0,0213% s = 0,000601 RSD = 2,83% 2 1,069 230,08 0,02152 3 0,986 208,47 0,02114 4 1,076 223,21 0,02074 5 1,108 245,28 0,02213 Nhận xét:
Phương pháp phân tích có độ chính xác có thể chấp nhận được trong phân tích định lượng các hợp chất tự nhiên có hàm lượng nhỏ.
2.2.3.4. Đánh giá độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được tiến hành nhằm đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị được coi là thực.
Độ đúng của phương pháp được đánh giá bằng cách thêm một lượng chính xác AT (tính tương ứng từ AT-acetat) vào mẫu dầu gấc đã biết hàm lượng AT. Lượng thêm vào sao cho tổng hàm lượng của mẫu thử và mẫu chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Tổng khối lượng của thử và chuẩn thêm cố trong mẫu dầu gấc là:
= k ( s , + b )
■ ■“ 'a
Trong đó:
• St : diện tích pic của mẫu đã có thêm chuẩn • K: hệ số pha loãng của mẫu thử.
• a,b: hệ số của đường tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic. (a=31,6; b= 6,91)
Khối lượng thu hồi của chuẩn là:
™ , h = m t +c - m , (m)
Trong đó:
• mth: lượng chất chuẩn thu hồi.
• mt+c: tổng lượng chất thử và chuẩn trong mẫu dầu gấc.
• mt: lượng chất thử có ban đầu trong mẫu dầu gấc.
Phần trăm lượng chất chuẩn được thu h ồ i : T = ^ x 1 0 0
m c (%)
mc là lượng chất chuẩn thêm vào mẫu dầu gấc.
Tiến hành:
> Cân 30,4mg chuẩn AT-acetat hòa tan trong 100 ml methanol thu được dung dịch AT- Acetat chuẩn. Pha loãng 4 lần dung dịch thu được. Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn này vào bình cầu để thủy phân cùng dầu gấc, tương đương với 66,96 |Lig AT.
> Cân chính xác khoảng lg dầu gấc đã biết nồng độ. Thêm chính xác 10ml dung dịch AT-acetat chuẩn đã pha ở trên. Xử lí mẫu như quy trình
chuẩn bị mẫu thử (2.2.1) rồi định lượng trên HPLC. Dùng phương trình đường chuẩn để tính tổng nồng độ của thử và chuẩn thêm. Làm 5 lần quy trình này trên cùng mẫu dầu gấc đã biết nồng độ để khảo sát độ đúng của phương pháp.
Kết quả:
Kết quả thu được được trình bày trong bảng 6.
Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng
STT Lượng có sẵn (|ig) Lượng thêm vào (ng) Lượng thu hồi (ng) Tỷ lệ thu hồi (%) Tỷ lệ thu hồi trung bình 1 235,49 66,96 65,31 97,5 R = 96,3% 2 225,92 66,96 64,06 95,7 3 230,38 66,96 64,82 96,8 4 216,77 66,96 65,79 98,2 5 223,58 66,96 62,37 93,2
2.23.5. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Giới hạn phát hiện (Limit of detection: LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng của mẫu trắng.
Giới hạn định lượng (Limit of quantitation: LOD) là nồng độ thấp nhất trong mẫu thử có thể định lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận được. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng
Chuẩn bị dung dịch chuẩn AT-acetat ở một nồng độ xác định. Pha loãng dung dịch này bằng mẫu trắng để được các nồng độ thấp dần. Tiến hành như quy trình xử lí mẫu chuẩn ở mục 2.2.1 và phân tích trên hệ thống HPLC. Thiết lập tỷ số giữa tín hiệu đáp ứng và nhiễu đường nền (Signal to noise Ration, S/N) tại điểm ứng với thời gian lưu của AT.
Kết quả cho thấy nồng độ AT cho S/N =10 là 26,4|ig/ml và S/N=3 là 8,8|ug/ml.
Vậy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của AT theo phương pháp lần lượt là 8,8 và 26,4|ig/ml.
Hình 4: sắc đồ giói hạn phát hiện của AT
[' DAD1A, Sig=230,8 Ref=400,100 (NTVY-VTE\0604VTE5.D)
I mAU
I 25 õ
2.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng định lượng AT trong chê phẩm dầu gấc.
Dựa trên phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định tính và định lượng các mẫu dầu gấc có nguồn gốc khác nhau.
Trên nguyên tắc so sánh thời gian lưu thu được từ mẫu dầu gấc với thời gian lưu của AT chuẩn, chúng tôi đã xác định sự có mặt của AT trong các mẫu dầu gấc khảo sát. Từ đó tính hàm lượng của AT có trong mẫu dầu gấc theo phương pháp đã xây dựng.
Tiến hành:
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn đúng theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.1 Chuẩn bị và cho hệ thống sắc kí chạy ổn định với pha động trong khoảng thời gian 30 phút. Tiêm mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống sắc kí trong điều kiện đã chọn. Với mỗi mẫu, làm 3 lần để lấy giá trị trung bình.
Với độ đúng của phương pháp đã khảo sát, hàm lượng của AT trong dầu gấc được tính như sau:
Hàm lượng AT trong các mẫu dầu gấc đã định lượng theo phương pháp đã xây dựng như sau:
a X m0X R
Trong đó:
• H: hàm lượng % (kl/kl) của AT trong mẫu dầu gấc. • St: diện tích pic của mẫu thử.
• K: hệ số pha loãng của mẫu thử. • m0: khối lượng của mẫu dầu gấc. • R . độ thu hồi trung bình đã khảo sát.
• a,b: hệ số của đường tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ (a=31,6; b= 6,91)
Bảng 7: Hàm lượng AT trong một số mẫu dầu gấc.
STT Tên mẫu Hàm lượng (|ig/g) 1 MOI 292,67 ± 2,44% 2 M02 264,83 ± 2,54% 3 M03 86,93 ± 2,93% 4 M04 155,56 ± 2,55% 5 M05 248,3 ± 2,87% Nhận xét
Hàm lượng của AT trong các mẫu dầu gấc khảo sát là khác nhau có ý nghĩa thống kê. Sự khác nhau này là do các mẫu dầu gấc được khai thác từ các nguồn khác nhau.
2.4. BÀN LUẬN VỂ PHƯƠNG PHÁP
Việc định lượng vitamin E trong dầu thực vật nói chung và dầu gấc nói riêng có quá trình xử lí mẫu tương đối phức tạp và mất thời gian. Trong quá trình nghiên cứu định lượng AT trong dầu gấc chúng tôi nhận thấy cần tuân thủ các điều kiện trong khi chiết tách và làm sạch mẫu trước khi chạy HPLC, như sục khí trơ trong thòi gian xà phòng hóa và dùng khí trơ để bay hơi dung môi. Các điều kiện này rất cần thiết để tránh oxy hóa dược chất nhằm đảm bảo độ chính xác và độ đúng của phương pháp. Ngoài ra thời gian thao tác trong quá trình chiết tách cũng là một yếu tố quan trọng cần phải chú ý trong quá trình định lượng.
Để định lượng AT trong dầu gấc, chúng tôi đã sử dụng kĩ thuật HPLC. Đây là một phương pháp đã được áp dụng phổ biến hiện nay để định lượng vitE trong các sản phẩm tự nhiên cũng như các chế phẩm vitamin. Kĩ thuật
này có nhiều ưu việt về độ chính xác, tính tiện lợi về vận hành máy, khả năng tái sử dụng của cột phân tích cũng như việc lựa chọn dung môi phân tích.
Với chương trình sắc kí đã xây dựng, alpha-tocopherol được tách ra hoàn toàn với thời gian lưu tương đối ngắn. Kết quả thực nghiệm cho thấy hệ thống có tính tích hợp cao, độ lệch chuẩn tương đối nhỏ, các đại lượng khác như số đĩa lí thuyết N, hệ số đối xứng T đều có giới hạn nằm trong giới hạn cho phép. Với độ thu hồi trung bình là 96,3%, phương pháp định lượng đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu phân tích.
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. KẾT LUẬN
Sau quá trình thực nghiệm chúng tôi đã xây dựng được một quy trình định lượng alpha-tocopherol trong dầu gấc bằng HPLC đảm bảo chính xác và tin cậy
Chúng tôi đã ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng AT trong 5 mẫu dầu gấc có nguồn gốc khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng AT trong các nguồn dầu gấc là khác nhau có ý nghĩa thống kê.
3.2. ĐỂ XUẤT
Với điều kiện thời gian và kinh phí trong khuôn khổ một đề tài tốt nghiệp, sau khi nghiên cứu quy trình định lượng AT trong dầu gấc, chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất như sau về việc nghiên cứu định lượng vitamin E trong sản phẩm dầu gấc:
- Tiếp tục nghiên cứu điều kiện chiết tách AT trong dầu gấc để tối ưu hóa một số điều kiện như thời gian và nhiệt độ xà phòng hóa đối với dầu gấc nhằm tích kiệm thời gian chiết và nâng cao độ thu hồi cho quy trình định lượng.
- Tiếp tục nghiên cứu định lượng các chất khác trong nhóm vitamin E có trong dầu gấc như Ị3,y-tocopherol, a,p,Ỵ-tocotrienol. Các chất này tuy không phổ biến như AT nhưng cũng có một số tác dụng riêng đối với cơ thể đang được quan tâm [17].
- Tiếp tục nghiên cứu, cải tiến phương pháp có thể để kết hợp định lượng đồng thời AT với các chất trong nhóm vitamin E hoặc với các nhóm chất khác có trong dầu gấc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB khoa học kỹ thuật, trang 861.
2. Bộ môn hóa dược - Đại học Dược Hà Nội (2004), Hóa dược, tập 1, trang 312-316.
3. Bộ môn hóa phân tích - Đại học Dược Hà Nội (2005), Hóa phân tích, tập 1, trang 29-45.
4. Bộ môn hóa phân tích - Đại học Dược Hà Nội (2002), Hóa phân tích, tập 2, trang 55-84.
5. Bộ Y tế (1971), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ nhất, NXB Y học, trang 186-187.
6. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ ba, NXB Y học, trang 282-284.
7. Phạm Gia Huệ, Nguyễn Thị Kiều Anh, Hà Văn Mạo, Đinh Ngọc Lâm (1993), “Về sự có mặt của vitamin E trong Gacavit một chế phẩm sản xuất từ dầu gấc”, tạp chí Dược học, số 1, trang 11-12.
8. Nguyễn Tiến Khanh (1993), Thống kê ứng dụng trong công tác Dược,
Trung tâm thông tin-Thư viện Đại học Dược Hà Nội, trang 17,27-35. 9. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học,
trang 885-887.
10. Thái Phan Quỳnh Như (1990), “Định lượng vitmin E trong dầu gan cá bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp đo màu”, thông báo kiểm nghiệm, số 3, trang 1-5.
11. Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm nghiệm chất lượng và thanh tra VSATTP, NXB y học.
12. Đào Hữu Vinh và cộng sự, Các phương pháp sắc kí, NXB khoa học kỹ thuật, trang 162-220; 329-355.
13. Nguyễn Tường Vy, Trần Tử An, Trịnh Văn Lẩu, Đặng Đức Khanh (2006), “Xác định các acid béo trong dầu màng hạt gấc bằng phương pháp sắc ký khí (GC-FTD) ”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, số 1, trang 18. 14. Viện kiểm nghiệm (1979), Định lượng vitamin, tập hai, NXB y học,