Xây dựng qui trình định lượng và khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin

Thuốc dán clonidin trị cao huyết áp có nhiều ưu điểm hơn dạng uống nên đang được quan tâm nghiên cứu phát triển. Hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng chế phẩm này là hàm lượng và độ phóng thích hoạt chất. Đề tài này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng và khảo sát khả năng phóng thích hoạt chất của thuốc dán clonidin.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT TỐC ĐỘ PHĨNG THÍCH HOẠT CHẤT CỦA THUỐC DÁN CLONIDIN Trần Quốc Thanh*, Lê Quan Nghiệm*, Huỳnh Văn Hóa*, Lê Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mục tiêu: Thuốc dán clonidin trị cao huyết áp có nhiều ưu điểm dạng uống nên quan tâm nghiên cứu phát triển Hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng chế phẩm hàm lượng độ phóng thích hoạt chất Đề tài thực với mục tiêu xây dựng quy trình định lượng khảo sát khả phóng thích hoạt chất thuốc dán clonidin Phương pháp: Thăm dò điều kiện chiết clonidin từ thuốc dán Thăm dò điều kiện sắc ký pha động: khơng có dung dịch đệm, sử dụng dung dịch đệm, thêm vào tác nhân tạo cặp ion Thăm dò quy trình thử độ hòa tan sử dụng phương pháp cánh khuấy đĩa ; tiến hành khảo sát các yếu tố pH môi trường (H3PO4 0,001M; đệm HCl pH 4,5; đệm HCl pH 3,5 ; HCl 0,1 N), tốc độ cánh khuấy (50 vòng/ phút, 100 vòng / phút), thời gian lấy mẫu Kết quả: Đã xây dựng quy trình định lượng thuốc dán clonidin HPLC với điều kiện sắc ký: cột C18, thành phần pha động gồm 1,21g Natri 1-heptansulfonat 600 ml nước: 400 ml methanol ml acid phosphoric, chỉnh pH=3; phát đầu dò PDA bước sóng 210 nm, tốc độ dòng: ml/ phút, thể tích tiêm mẫu: 20 µl.Với phương pháp chiết clonidin từ thuốc dán sử dụng 10 ml cloroform để phá dính 10 ml HCl 0,003% để chuyển clonidin từ dạng base sang dạng acid tan HCl 0,003%, lấy lớp acid định lượng Đã xây dựng được quy trình thử độ hòa tan: phương pháp cánh khuấy đĩa, môi trường 500 ml HCl 0,1 N, tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút, thời gian lấy mẫu 1-2-4-6-8-10-12 Kết luận: Phương pháp định lượng chứng minh phù hợp để định lượng clonidin thuốc dán mơi trường thử độ hòa tan Đồng thời đề tài khảo sát quy trình thử độ hòa tan cho thuốc dán clonidin, quy trình cho kết ổn định Từ khóa: Clonidin, thuốc dán hấp thu qua da, độ hòa tan thuốc dán ABSTRACT DEVELOPING THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF CLONIDIN IN TRANSDERMAL PATCHES AND SURVEYING THEIR RELEASE RATE Tran Quoc Thanh, Le Quan Nghiem, Huynh Van Hoa, Le Hau, Nguyen Thien Hai, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: - 13 Objectives: Clonidine patches as an antihypertensive agent have more advantages than oral dosage forms, therefore the development of clonidine patches is regarded Two important qualitative evaluation factors are the content and release rate of clonidine This topic is done with the goal: development of the assay method and dissoluion tests for clonidine transdermal patches Method: Probe conditions extracted clonidine from patches Exploration phase chromatographic conditions: no buffer solution, using a buffer solution, in addition to an artificial ion pair The dissolution test was performed using apparatus (Paddle over Disk); and examing the pH of medium (0.001 M H3PO4; HCl buffer pH 4.5; HCl * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Trần Quốc Thanh - ĐT: 0903 389 214 - Email: tranquocthanhdhyd@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học buffer pH 3.5; HCl 0.1 N), the paddle speed (50 rpm, 100 rpm), and the sample times Results: The quantitative test has been developed using HPLC with chromatographic conditions: column C18, the mobile phase consists of 1.21 g sodium 1-heptansulfonat in 600 ml water: 400 ml methanol and ml phosphoric acid, adjust to pH = 3; detected by PDA detector at 210 nm.%); flow rate: 1ml/minute; injected sample volume: 20 µl The extraction method of clonidine from the patches used 10 ml cloroform and 10 ml and HCl 0.003% (cloroform was used to destroy the adhesive layer, HCl 0.003% was used to change Clonidine base into Clonidine hydrochloride), the acid layer was taken to assay The dissolution test has been developed using apparatus paddle over disk, 500 ml HCl 0.1 N, 50 rpm, sampled times: 1-2-4-6-8-10-12 hr Conclusion: The quantitative method has been developed and demonstrated that was suitable to quantify the clonidine in the patches and in the dissolution medium The topic has also developed the dissolution testing process for clonidine patches Key words: Clonidin, Transdermal patch, Dissolution transdermal patches ĐẶT VẤN ĐỀ Nguyên liệu Dạng thuốc dán hấp thu qua da (Transdermal Therapeutic System – TTS) ngày quan tâm phát triển rộng rãi có nhiều ưu điểm dạng uống Thuốc dán điều trị tăng huyết áp đời chế phẩm Catapres – TTS chứa dược chất clonidin để điều trị tăng huyết áp Tại Việt Nam, thuốc dán thấm qua da clonidin 2,5 7,5mg Khoa Dược – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành cơng Để phát triển dạng thuốc cần có tiêu kiểm sốt chất lượng, hai tiêu chí chất lượng quan trọng là: hàm lượng hoạt chất thuốc dán tốc độ phóng thích hoạt chất Do đề tài thực với mục tiêu: Chất chuẩn Clonidin hydroclorid chuẩn USP 32, hàm lượng 99,38%, số lô QT170913, hạn dùng tháng 04 / 2014 Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM cung cấp - Xây dựng quy trình định lựợng thuốc dán clonidin - Khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất thuốc dán clonidin ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Thuốc dán Clonidin 2,5 mg Khoa dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh Thuốc đối chiếu: Catapres-TTS® 2,5mg/3,5cm hạn dùng tháng 05/2013 cơng Hóa chất, dung mơi Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký Trang thiết bị Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type PTWS3C, hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Alliance 2965, đầu dò dãy diod quang (Waters, Mỹ) Máy đo pH Metrohm 744 (Metrohm, Đức) Máy siêu âm Elma (Elma, Đức) Phương pháp nghiên cứu Xây dựng qui trình định lượng clonidin thuốc dán HPLC với đầu dò PDA Khảo sát điều kiện sắc ký Clonidin chất có tính base, phân cực nên kỹ thuật sắc ký pha đảo lựa chọn Qua tham khảo tài liệu(1) định lượng clonidin thuốc dán điều kiện sắc ký ban đầu đề nghị sau: Cột sắc ký: cột Phenomenex Luna C18 (150 x 4,6 mm; µm) ty Boehringer Ingelhem, Đức Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Tốc độ dòng: ml/phút Đầu dò PDA, bước sóng phát 210 nm Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Pha động A (khơng có dung dịch đệm): methanol – nước (40:60) điều chỉnh đến pH acid phosphoric Pha động B (có dung dịch đệm): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60) thêm ml acid phosphoric điều chỉnh đến pH KOH 30% Pha động C (có tác nhân tạo cặp ion): 1000 ml hỗn hợp methanol – nước (40:60), thêm 1,21g natri 1-heptansulfonat ml acid phosphoric điều chỉnh đến pH KOH 30% Khảo sát hệ pha động để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thoả mãn yêu cầu sau: pic clonidin phải tách hồn tồn pic khác (nếu có) có hệ số đối xứng nằm khoảng 0,8 – 1,5 Khảo sát điều kiện chiết clonidin thuốc dán: Cách 1: Dựa theo chuyên luận USP 32 (1) dùng tetrahydrofuran để chiết clonidin thuốc dán Cách 2: Chọn cloroform làm dung mơi để chiết clonidin thuốc dán clonidin base dễ tan cloroform Nồng độ dung dịch HCl 0,003% đủ để chuyển hết clonidin base sang acid Chiết clonidin HCl miếng thuốc dán cách lắc rung(vortex) với cloroform thời gian 5, 10, 15, 20 phút thấy diện tích đỉnh sắc ký đồ tăng lên theo thời gian sau 20 phút diện tích đỉnh clonidin HCl khơng có khác kết định lượng Nghiên cứu Y học Mẫu thử Lấy miếng thuốc dán khỏi bao bì, cắt miếng thuốc dán có diện tích 1cm2 (1cm x 1cm), loại bỏ lớp bảo vệ bao phủ lên bề mặt bắt dính lớp chứa hoạt chất, cho vào chai có nắp đậy chặt dung tích khoảng 25 ml (đường kính khoảng cm), thêm xác 10 ml cloroform Lắc rung mạnh 20 phút Thêm xác 10 ml dung dịch HCl 0,003% (g/ml) Lắc rung mạnh tiếp phút Để yên nhiệt độ phòng từ 20 phút đến 30 phút Lấy lớp (lớp nước acid), lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành sắc ký Hàm lượng clonidin, C9H9Cl2N3, tính mg miếng thuốc dán cm2 tính theo cơng thức: X = 230,1 ST × CC × 10 × × 1000 266,6 SC Trong đó: ST: diện tích pic clonidin HCl mẫu thử SC: diện tích pic clonidin HCl mẫu chuẩn CC: Nồng độ clonidin HCl dung dịch chuẩn (µg/ml) 230,1: phân tử lượng clonidin 266,6: phân tử lượng clonidin HCl Thẩm định qui trình định lượng Gồm tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác, độ Qui trình thử độ hòa tan thuốc dán Dựa USP 32 số tài liệu tham khảo khác (2,3) thử độ hòa tan thuốc dán Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid gốc: Các điều kiện, yếu tố xác định Hòa tan clonidin HCl chuẩn nước cất để dd chuẩn gốc có nồng độ 0,1 mg/ml bảo quản – oC PTWS3C Thiết bị kiểu cánh khuấy đĩa (thiết Dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid: Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với nước cất để có dung dịch chuẩn nồng độ 60 µg/ml Chuyên Đề Dược Học Máy thử độ hòa tan Pharmatest Type bị loại theo USP 32) Mặt kính (d = 8cm), lưới (d = 8cm), kẹp Thể tích mơi trường: 500ml Nhiệt độ: 32 ± 0,5 oC Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Khoảng cách từ bề mặt cánh khuấy đến bề mặt lưới: 25 ± 2mm Thể tích lấy mẫu: 2ml Thời điểm lấy mẫu: 1- - - - - 10 12…giờ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Các yếu tố cần khảo sát Khảo sát điều kiện sắc ký Môi trường: H3PO4 0,001 M, HCl (pH =4,5), HCl (pH= 3,5), HCl 0,1 N Kết khảo sát điều kiện sắc ký thể qua hình Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút 100 vòng/phút (a) (b) (c) (d) Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn: (a) với pha động A, (b) với pha động B, (c) với pha động C chiết clonidin thuốc dán cloroform (d) với pha động C Do chọn cách xử lí thuốc dán cách chiết Nhận xét: Với pha động A, pic clonidin xuất với cloroform lựa chọn sớm, có thời gian lưu khoảng 2,28 phút Với pha động B, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 4,58 phút bị kéo đuôi Pha động C, pic clonidin có thời gian lưu khoảng 10 phút, pic clonidin tách hồn tồn pic tạp có hệ số đối xứng nằm khoảng 0,8 – 1,5 Vì pha động C lựa chọn Thẩm định qui trình định lượng clonidin thuốc dán Khảo sát điều kiện chiết clonidin thuốc dán Bảng 1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu huyết tương thêm chuẩn (n=6) Kết khảo sát điều kiện sắc ký cho thấy chiết clonidin thuốc dán tetrahydrofuran mẫu lẫn nhiều tạp pic clonidin chưa tách hẳn khỏi pic tạp (Hình 2).Còn chiết clonidin thuốc dán cloroform loại phần lớn tạp pic clonidin tách hồn tồn khỏi pic tạp (Hình 1d) 10 Khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Kết phân tích lặp lại lần mẫu thuốc thử trình bày bảng Diện tích Thời gian Hệ số Số đĩa lý Độ pic (µAu x lưu (phút) đối xứng thuyết phân giây) (As) (N) giải (Rs) TB 6699881 10,6239 1,1115 11264 5,45 RSD 1,41% 1,65% 0,45% 0,64% 0,95% Nhận xét: RSD thông số khảo sát gồm diện tích pic, thời gian lưu, hệ số đối, số đĩa lý thuyết, độ phân giải có RSD < 2%, chứng tỏ qui trình có tính phù hợp hệ thống Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Hình 1d Sắc ký đồ mẫu thuốc dán chiết với clororm Hình Sắc ký đồ mẫu thuốc dán chiết với tetrahydrofuran pic clonidin mẫu chuẩn (hình 1c), mẫu Tính đặc hiệu trắng (hình 4) khơng có pic trùng với pic Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử clonidin, sử dụng chức kiểm tra độ tinh mẫu trắng theo điều kiện sắc ký chọn Kết khiết pic cho thấy pic clonidin mẫu thử cho thấy: phổ UV-Vis thời gian lưu tinh khiết (hình 5) Do đó, khẳng định qui pic clonidin mẫu thử mẫu chuẩn giống trình phân tích có tính đặc hiệu (hình 3), thời gian lưu pic mẫu thử (hình 1d) tương đương với thời gian lưu (a) (b) Hình 3: Phổ UV-Vis thời gian lưu pic clonidin mẫu chuẩn (a) mẫu thử (b) Hình 4: Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 5: Đồ thị minh họa độ tinh khiết pic clonidin HCl mẫu thử Chuyên Đề Dược Học 11 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác Bảng 2: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác Chỉ tiêu thẩm định Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính (µg/ml) Độ (tỷ lệ hồi phục, n=9) Độ xác Độ xác ngày khác ngày (n=18) Độ lặp lại (n=6 Clonidin HCl Ŷ = 119744 X ; R = 0,9999 – 150 Tỷ lệ hồi phục mức nồng độ nằm khoảng 97,51 102,39% chứng tỏ phương pháp phân tích có độ cao phạm vi khảo sát Kết phân tích mẫu thử khác nồng độ ngày khác Mỗi ngày sắc ký mẫu thử khác cho độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, qui trình đạt độ xác liên ngày Kết phân tích mẫu thử khác nồng độ cho độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,23% < 2%, qui trình phân tích đạt u cầu độ lặp lại Kết khảo sát thử độ hòa tan thuốc dán clonidin: Mơi trường H3PO4 0,001M độ phóng thích clonidin thuốc thử tăng, clonidin thuốc dán đối chiếu catapres giảm theo thời gian Môi trường đệm HCl pH= 4,5 đệm HCl pH= 3,5 khơng thấy có pic clonidin, xuất pic tạp nên không định lượng clonidin hai môi trường (Hình 6) (a) polymer có thành phần thuốc dán Miếng thuốc dán ngâm môi trường dung dịch HCl 0,1N liên tục 12h nên sau 12h môi trường bị phân hủy làm ảnh hưởng đến hoạt chất tá dược dính có thuốc dán phóng thích làm mơi trường bị đục làm kết định lượng clonidin bị sai Độ phóng thích clonidin thuốc dán khảo sát đến 12h chứng minh tác động kéo dài miếng thuốc dán Từ kết khảo sát ta thiết lập thơng số thử độ hòa tan sau: Máy đo độ hòa tan: PHARMATEST TYPE PTWS3C (b) Hình 6: Sắc ký đồ thử đồ hòa tan thuốc dán clonidin môi trường HCl pH= 4,5(a) đệm HCl pH= 3,5(b) thời điểm 12h Môi trường HCl 0,1N độ phóng thích clonidin thuốc thử thuốc đối chiếu tăng Về khảo sát tốc độ cánh khuấy tăng lên 100 vòng/phút so với tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút độ phóng thích hoạt chất hai tốc độ quay cho kết định lượng khác khơng có ý nghĩa Đồng thời thể tích mơi trường thử độ hòa tan sử dụng 500ml nên chọn tốc độ quay cánh khuấy 50 vòng/phút để hạn chế thủy động cao tạo dòng xốy bào mòn nhanh đến tá dược dính 12 Thiết bị: cánh khuấy đĩa (thiết bị loại 5) gồm có mặt kính đồng hồ đường kính cm, lưới thép khơng rỉ đường kính 8cm, cỡ mắt lưới khoảng 0,1 mm, đường kính sợi lưới khoảng 0,02mm.Gỡ bỏ lớp bảo vệ miếng thuốc dán, dán nhẹ mặt dính miếng thuốc lên lưới cố định vào mặt kính đồng hồ kẹp cho miếng thuốc dán nằm mặt kính miếng lưới, bề mặt phóng thích hoạt chất hướng lên Mơi trường thử độ hòa tan: 500 ml HCl 0,1N Nhiệt độ thử nghiệm: 32°C ± 0,5°C Tốc độ quay: 50 vòng/ phút Thả hệ mặt kính - thuốc dán - lưới vào bình hòa tan cho mặt kính đồng hồ thật phẳng song song với cạnh đáy cánh khuấy, hạn chế không để có bọt khí bề mặt miếng thuốc dán Hạ cánh khuấy xuống cho khoảng cách Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Clonidin HCl từ cạnh đáy cánh khuấy đến bề mặt đĩa cố định 25 ± mm Nghiên cứu Y học (a) Thời điểm lấy mẫu: 1- - - - – 10 - 12 ( Thể tích mẫu lấy định lượng: ml mơi trường hòa tan, lọc qua màng lọc 0,45 µm, ta có dung dịch thử Tiến hành định lượng theo quy trình Dung dịch chuẩn: xây dựng đường chuẩn cách pha dung dịch chuẩn clonidin hydroclorid nồng độ khác (sao cho nồng độ định lượng giới hạn đường chuẩn này) Lọc qua màng lọc 0,45µm Sắc ký đồ phương pháp thử độ hòa tan thuốc dán xây dựng thể (Hình 7) Hình 7: Sắc ký đồ thử đồ hòa tan thuốc dán clonidin thuốc thử (a) thuốc đối chiếu Catapres (b) môi trường HCl 0,1N thời điểm 12h Phần trăm clonidin phóng thích Ứng dụng qui trình thử độ hòa tan thuốc dán Clonidin(n=6) thuốc đối chiếu Catapres(n=6) Thời gian (giờ) Hình Đồ thị biểu diễn phóng thích theo thời gian thuốc dán clonidin 2,5 mg thuốc dán Catapres 2,5 mg KẾT LUẬN Đề tài xây dựng quy trình định lượng khảo sát độ hòa tan clonidin thuốc dán phương pháp HPLC với đầu dò PDA Qui trình định lượng clonidin thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ xác, độ Quy trình ứng dụng để xác định phần trăm phóng thích clonidin thuốc dán thử nghiệm thuốc dán đối chiếu Catapres AAPS Pharm Sci Tech (2003) FIP/AAPS Guidelines to Dissolution/in Vitro Release Testing of Novel/Special Dosage Forms Shah VP, Tymes NW, Skelly JP (1989) In vitro release profile of clonidin transdermal therapeutic systems scopolamine patches Pharmaceutical research 6, 346-351 Ngày nhận báo : 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo : 25.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO United States Pharmacopoeia 32 (2009) The United States Pharmacopeial Convention, 557-563 Chuyên Đề Dược Học 13 ... nghiệm thuốc TPHCM cung cấp - Xây dựng quy trình định lựợng thuốc dán clonidin - Khảo sát tốc độ phóng thích hoạt chất thuốc dán clonidin ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Thuốc dán. .. hoạt chất tá dược dính có thuốc dán phóng thích làm mơi trường bị đục làm kết định lượng clonidin bị sai Độ phóng thích clonidin thuốc dán khảo sát đến 12h chứng minh tác động kéo dài miếng thuốc. .. HCl 0,1N độ phóng thích clonidin thuốc thử thuốc đối chiếu tăng Về khảo sát tốc độ cánh khuấy tăng lên 100 vòng/phút so với tốc độ cánh khuấy 50 vòng/phút độ phóng thích hoạt chất hai tốc độ quay