Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng

phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

 Theo DĐVN V và DĐTQ 2015, acid salvianolic B, tanshinon IIA được lựa chọn là các marker để định lượng hàm lượng hoạt chất trong chuyên luận dược liệu Đan sâm [3], [18]. Do đó, chúng tôi lựa chọn acid salvianolic B, tanshinon IIA làm marker định lượng cho cao đặc Đan sâm.

 Hiện nay, việc xác định và định lượng các thành phần hoạt chất trong dược liệu Đan sâm mới chỉ tập trung vào các hợp chất thân nước hoặc thân dầu [38], [43], không thể phản ánh chất lượng tổng thể của dược liệu; có rất ít các báo cáo về định lượng đồng thời các hoạt chất này [16], [30] và không có báo cáo nào về việc định lượng đồng thời acid salvianolic B và tanshinon-IIA trong cao đặc Đan sâm được đề cập. Trong khóa luận này, chúng tôi đưa ra một phương pháp định tính, định lượng đồng thời cả acid salvianolic B và tanshinon-IIA bằng HPLC đơn giản, đáng tin cậy, thông qua đó giúp xây dựng chỉ tiêu đánh giá chất lượng cao đặc Đan sâm.

 Từ các tài liệu tham khảo [9], [16], [30], [42] về định lượng đồng thời acid salvianolic B, tanshinon IIA trong Đan sâm bằng HPLC, chúng tôi nhận thấy đa số các nghiên cứu đều sử dụng sắc kí pha đảo, cột C18 và hệ dung môi pha động có thể sử dụng là acetonitril và acid phosphoric. Do đó, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi pha động gồm acetonitrile (dung môi A) và acid phosphoric 0,1% (dung môi B) theo chương trình rửa giải gradient và tiến hành khảo sát, lựa chọn tỉ lệ thành phần pha động phù hợp với các điều kiện sắc kí cố định ở phần 2.2.2.2. Kết quả cho thấy hệ dung môi: 0-20 ph: 26% A; 20-21 ph: 26-86% A; 21-35 ph: 86% A; 35-36 ph: 86-26% A; 36-40 ph: 26% A cho peak tách rõ, thời gian lưu phù hợp nhất.

 Trong tài liệu tham khảo [30] sử dụng phương pháp định lượng bằng HPLC gần như tương tự nghiên cứu của chúng tôi với chương trình gradient pha động gồm acetonitril và acid phosphoric để phân tích đồng thời 5 hợp chất. Tuy nhiên, phương pháp này được thực hiện ở điều kiện sắc ký khác: nhiệt độ cột (30 oC), sử dụng acid phosphoric 0,5% với chương trình gradient pha động phức tạp (gồm 9 bước) – khó triển khai hơn phương pháp của chúng tôi (nhiệt độ cột 20 oC, acid phosphoric 0,1%, chương

41

trình gradient gồm 5 bước). Đồng thời, cả hai phương pháp đều đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ chính xác, và độ đúng.

 Để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất từ cao đặc Đan sâm sao cho hàm lượng các thành phần thân nước và thân dầu đạt cao nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi thích hợp. Kết quả cho thấy hàm lượng acid salvianolic B không thay đổi nhiều khi chiết bằng methanol ở các nồng độ khác nhau, trong khi hàm lượng tanshinon-IIA tăng khi tăng nồng độ methanol từ 30% lên 70%. Khi tăng nồng độ methanol lên 100%, hàm lượng tanshinon-IIA thay đổi không đáng kể so với chiết bằng methanol 70%. Do vậy methanol 70% được chọn làm dung môi chiết các mẫu cao đặc Đan sâm.

 DĐVN 5 [3], DĐTQ [18] trong chuyên luận dược liệu Đan sâm, các phương pháp định lượng bằng HPLC thường chỉ tập trung định lượng từng hoạt chất riêng lẻ hoặc từng nhóm hoạt chất thân dầu hoặc thân nước. Vì vậy phương pháp định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA bằng HPLC trong nghiên cứu này có ưu điểm hơn trong việc kiểm tra đánh giá chất lượng Đan sâm do tiết kiệm hóa chất, dung môi và thời gian phân tích.

 Trong các nghiên cứu [16], [30], phương pháp HPLC được sử dụng có thể định lượng đồng thời các hoạt chất thân nước và thân dầu trong Đan sâm (thường nhiều hơn 5 hoạt chất) giúp phản ánh rất tốt chất lượng tổng thể của dược liệu. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi chương trình pha động sắc ký phức tạp (gồm 9 bước [30]) và thời gian sắc ký kéo dài (60 phút [16] hoặc 80 phút [30]), phương pháp trong nghiên cứu này của chúng tôi có chương trình pha động gồm 5 bước với thời gian sắc ký 40 phút là đơn giản hơn nhưng vẫn đủ độ chính xác và tin cậy.

42

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận

5.1.1. Định tính cao đặc Đan sâm bằng TLC

 Định tính acid salvianolic B: - Điều kiện sắc ký:

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110 oC trong 60 phút.

Pha động: Cloroform – ethyl acetat – toluen – acid formic – methanol (3:4:2:2:0,5). Khoảng cách triển khai: 90 mm kể từ đáy bản mỏng.

Hiện vết: UV 366 nm.

- Sau khi hiện vết ở bước sóng 366 nm, trên sắc kí đồ định tínhacid salvianolic B, cao đặc Đan sâm có 5 vết tương ứng với dược liệu Đan sâm, có 4 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn và có 1 vết tương ứng với chất chuẩn Sal-B (Rf = 0,08).

 Định tính tanshinon IIA: - Điều kiện sắc ký:

Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110 oC trong 60 phút. Pha động: Toluen – ethyl acetat (19:1).

Khoảng cách triển khai: 90 mm kể từ đáy bản mỏng. Hiện vết: UV 254 nm.

- Sau khi hiện vết ở bước sóng 254 nm, trên sắc kí đồđịnh tính tanshinon IIA, cao đặc Đan sâm có 3 vết tương ứng với dược liệu Đan sâm, có 3 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn và có 1 vết tương ứng với chất chuẩn Tan-IIA (Rf = 0,44).

5.1.2. Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng HPLC bằng HPLC

Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng HPLC với điều kiện sắc kí:

 Cột C18 (150 x 4,6 mm, 5 m)

 Detector: UV 270 nm

 Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

 Nhiệt độ cột: 20 oC

43

 Pha động: acetonitril (dung môi A) - acid phosphoric 0,1% (dung môi B) theo chương trình rửa giải gradient: 0-20 ph: 26% A; 20-21 ph: 26-86% A; 21-35 ph: 86% A; 35-36 ph: 86-26% A; 36-40 ph: 26% A.

Phương pháp phân tích có độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống tốt (RSD của thời gian lưu và diện tích peak của Sal-B và Tan-IIA đều < 2,0%), khoảng tuyến tính từ 29,96 đến 958,63 µg/ml đối với Sal-B và từ 1,02-32,53 µg/ml đối với Tan- IIA, độ lặp lại và độ chính xác trung gian tốt, độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi Sal-B trong khoảng 97-103%; tỷ lệ thu hồi Tan-IIA trong khoảng 95-105%). Hàm lượng Sal-B và Tan-IIA trong các mẫu cao đặc Đan sâm khảo sát lần lượt là 7,16% - 7,72% và 0,011% - 0,785%.

5.2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu:

 Hoàn thiện các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc Đan sâm.

 Xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần khác trong cao đặc.

 Nghiên cứu bào chế chế phẩm từ cao đặc Đan sâm và thử tác dụng dược lý của sản phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1. Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất (2016), Hóa phân tích tập II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 168-200, 205-212.

2. Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 84- 110.

3. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam-Lần xuất bản thứ 5, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 1152-1154.

4. Đặng Thị Ngần (2017), "Nghiên cứu phân lập và định lượng cryptotanshinon từ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) phục vụ công tác đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm", ĐHQGHN, Khoa Y-Dược.

5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 818-820.

6. Khoa Y học cổ truyền - Trường Đại học Y Hà Nội (2005), Bào chế đông dược, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 88.

7. Phạm Xuân Sinh, Phùng Hoà Bình (2014), Dược học cổ truyền, Bộ Y tế, Hà Nội, tr. 291.

8. Trần Danh Việt, Đào Văn Núi & Nguyễn Văn Hùng (2017), "Nghiên cứu di thực cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) tại một số vùng của miền Bắc Việt Nam,

Bản B của Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 15(4).

9. Trần Hùng Sơn và các cộng sự (2018), "Nghiên cứu định lượng đồng thời acid salvianolic B và tanshinone IIA trong đan sâm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí Dược học. 58(3), tr. 33-37.

10 Trịnh Thị Điệp & Trần Thanh Hà (2015), "NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TANSHINONE IIA TỪ ĐAN SÂM LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU",

Tạp chí Khoa học Đại học Đà Lạt, 5(1&2), tr. 5-11.

11. Tuệ Tĩnh (2016), 3033 Cây thuốc đông y, Y học cổ truyền, tr. 378.

12. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 732-738.

13. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 107-114, 216-249.

Tài liệu Tiếng Anh

14. AOAC (2016), Appendix F: Guidelines for standard method performance requirements, AOAC International: Rockville, MD, USA.

15. Cao J, Wei Y. J, Qi L. W, et al. (2008), "Determination of fifteen bioactive components in Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae by high‐performance liquid chromatography with ultraviolet and mass spectrometric detection",

Biomedical Chromatography. 22(2), pp. 164-172.

16. Cheng H.T, Li X. L, Li X. R, et al. (2012), "Simultaneous quantification of selected compounds from Salvia herbs by HPLC method and their application",

Food Chemistry. 130(4), pp. 1031-1035.

17. Commission China Pharmacopoeia (2009), TLC Atlas of Chinese Crude Drugs in Pharmacopoeia of the People's Republic of China, People's Health Publishing House, pp. 197-198.

18. Commission China Pharmacopoeia (2015), Pharmacopoeia of the people's republic of China, Volume I, pp. 401-402.

19. Department of Health (2020), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards Volume 1, pp. 90-101.

20. Fang X, Wang J, Zhou H, et al. (2009), "Microwave‐assisted extraction with water for fast extraction and simultaneous RP‐HPLC determination of phenolic acids in Radix Salviae Miltiorrhizae", Journal of separation science. 32(14), pp. 2455-2461.

21. Si G, Liu Z, Li H, Little P. J, Liu P, & Xu S. (2012), "Cardiovascular actions and therapeutic potential of tanshinone IIA", Atherosclerosis. 220(1).

22. Ho J. H. C, & Hong C. Y. (2011), "Salvianolic acids: small compounds with multiple mechanisms for cardiovascular protection", Journal of Biomedical Science 18, pp. 30.

23. Hu P, Luo G. A, Zhao Z, & Jiang Z. H. (2005), "Quality assessment of Radix Salviae miltiorrhizae", Chemical and pharmaceutical bulletin (Tokyo). 53(5), pp. 481-486.

24. Huang M, Wang P, Xu S, et al. (2015), "Biological activities of salvianolic acid B from Salvia miltiorrhiza on type 2 diabetes induced by high-fat diet and streptozotocin", Pharmaceutical Biology 53(7), pp. 1058-65.

25. Huang Y. F, Liu M. L, Dong M. Q, et al. (2009), "Effects of sodium tanshinone II A sulphonate on hypoxic pulmonary hypertension in rats in vivo and on Kv2.1 expression in pulmonary artery smooth muscle cells in vitro", Journal of ethnopharmacology. 125(3), pp. 436-43.

26. ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005), Harmonised Tripartite Guideline, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. Q2 (R1).

27. Ji W and Gong B. Q. (2008), "Hypolipidemic activity and mechanism of purified herbal extract of Salvia miltiorrhiza in hyperlipidemic rats", Journal of ethnopharmacology. 119(2), pp. 291-8.

28. Jia L, Song N, Yang G, et al. (2016), "Effects of tanshinone IIA on the modulation of miR33a and the SREBP2/Pcsk9 signaling pathway in hyperlipidemic rats", Molecular medicine reports. 13(6), pp. 4627-35.

29. Jia Q, Zhu R, Tian Y, et al. (2019), "Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety", Phytomedicine. 58, pp. 152871. 30. Li-lan L, Hou S, Zheng T. T, Zhang X. L, & Wei J. H. (2015), "Simultaneous

determination of five hydrophilic and lipophilic components from roots of Salvia miltiorrhiza by HPLC", Chinese Herbal Medicines. 7(1), pp. 75-79.

31. Li Y. G, Song L, Liu M, & Wang Z. T. (2009), "Advancement in analysis of

Salviae miltiorrhizaeRadix et Rhizoma (Danshen)", Journal Chromatography A. 1216(11), pp. 1941-1953.

32. Li Y. J, Duan C. L, Liu J. X, & Xu Y. G. (2010), "Pro-angiogenic actions of salvianolic acids on in vitro cultured endothelial progenitor cells and chick embryo chorioallantoic membrane model", Journal Ethnopharmacol. 131(3), pp. 562-6.

33. Li Zh, Xu S, and Pei-qing Liu. (2018), "Salvia miltiorrhiza Burge (Danshen): A golden herbal medicine in cardiovascular therapeutics", Acta Pharmacol Sin. 39(5), pp. 802-824.

34. Mathers Colin D and Dejan Loncar (2006), "Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030", Plos med. 3(11), pp. e442.

35. Organization World Health (2017), "Monitoring health for the SDGs", World health statistics 2017, pp. 31.

36. Organization World Health (2019), "Monitoring health for the SDGs, sustainable development goals", World health statistics 2019, pp. 31.

37. Chun-Yan S. U, Qian-Liang M. I. N. G, Rahman K, Ting H. A. N, & Lu-Ping Q. I. N. (2015), "Salvia miltiorrhiza: Traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology", Chinese journal of natural medicines. 13(3), pp. 163-182. 38. Wan X, Wang Y, Row K. H. (2009), "Separation of Tanshinone I, Tanshinone

IIA, and Cryptotanshinone from Salvia miltiorrhiza Bunge by Normal Phase HPLC", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 32(4), pp. 544-552.

39. Wang J, Xingjiang X, and Bo F. (2013), "Cardiovascular effects of salvianolic acid B", Evid Based Complement Alternat Medicine. 2013.

40. Wang X, Yang Y, Liu X, & Gao X. (2020), "Pharmacological properties of tanshinones, the natural products from Salvia miltiorrhiza", Advance in Pharmacology. 87, pp. 43-70.

41. Wang Zh, Xie P. (2015), Monographs for Quality Evaluation of Chinese Crude Drugs, SCPG Publishing Corporation, New York, USA, pp. 288-290.

42. Wei Y. J, Qi L. W, Li P, Luo H. W, Yi L, & Sheng L. H. (2007), "Improved quality control method for Fufang Danshen preparations through simultaneous determination of phenolic acids, saponins and diterpenoid quinones by HPLC coupled with diode array and evaporative light scattering detectors", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 45(5), pp. 775-784.

43. Xu J. Z, Shen J, Cheng Y. Y, & Qu H. B. (2008), "Simultaneous detection of seven phenolic acids in Danshen injection using HPLC with ultraviolet detector",

Journal of Zhejiang University SCIENCE B. 9(9), pp. 728-33.

44. Yang Q, Wang S, Xie Y. et al. (2010), "Effect of salvianolic acid B and paeonol on blood lipid metabolism and hemorrheology in myocardial ischemia rabbits induced by pituitruin", International journal of molecular sciences. 11(10), pp. 3696-704.

45. Zhu Z, Zhang H, Zhao L, et al. (2007), "Rapid separation and identification of phenolic and diterpenoid constituents from Radix Salvia miltiorrhizae by high‐ performance liquid chromatography diode‐array detection, electrospray ionization time‐of‐flight mass spectrometry and electrospray ionization

quadrupole ion trap mass spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up‐to‐the‐Minute Research in Mass Spectrometry. 21(12), pp. 1855-1865.

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1. SẮC KÍ ĐỒ SẮC KÍ LỚP MỎNG

Phụ lục 1.1. Sắc kí đồ định tính acid salvianolic trong cao đặc Đan sâm ở bước sóng 254 nm

Phụ lục 1.2. Sắc kí đồ định tính tanshinon IIA trong cao đặc Đan sâm ở ánh sáng thường

PHỤ LỤC 2. SẮC KÍ ĐỒ SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Phụ lục 2.5. Sắc kí đồ dung dịch chuẩn 5

PHỤ LỤC 3. PHIẾU KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU