phương pháp HPLC
2.2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc Sal-B 1150,36 µg/ml và dung dịch chuẩn gốc Tan-IIA 195,20 µg/ml trong methanol 70%. Lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc Sal-B pha với 2 ml dung dịch chuẩn gốc Tan-IIA được dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ Sal-B là 958,63 µg/ml và Tan-IIA là 32,53 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc này pha dãy chuẩn có nồng độ Sal-B trong khoảng 29,96-958,63 µg/ml và nồng độ Tan-IIA trong khoảng 1,02-32,53 µg/ml.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao vào bình nón có nút mài 50 ml, thêm chính xác 25 ml dung môi (khảo sát dung môi theo phương pháp nêu ở mục 2.2.2.2), cân, siêu âm trong 30 phút (khảo sát nhiệt độ chiết theo phương pháp nêu ở mục 2.2.2.2). Để nguội. Cân lại, bổ sung khối lượng mất đi bằng dung môi. Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch tiêm sắc ký.
2.2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
- Pha tĩnh: Cột sắc kí C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) - Detector: khảo sát bước sóng phát hiện
Tham khảo các tài liệu [9], [18], và căn cứ kết quả quét phổ mẫu chuẩn hỗn hợp trong khoảng 210-350 nm để chọn bước sóng.
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: khảo sát nhiệt độ cột
Tham khảo các tài liệu [18], [43] khảo sát các nhiệt độ cột sắc ký: 20 °C, 30 °C, 40 °C để chọn nhiệt độ cột cho sắc ký đồ có các peak Sal-B và Tan-IIA tách tốt nhất.
- Thể tích tiêm: 10 µl
- Pha động: khảo sát hệ dung môi gồm acetonitrile (dung môi A) và acid phosphoric 0,1% (dung môi B) theo chương trình rửa giải gradient.
19 Hệ 1: 0-15 ph: 28% A; 15-16 ph: 28-86% A; 16-30 ph: 86% A; 30-31 ph: 86-28% A; 31-35 ph: 28% A. Hệ 2: 0-20 ph: 27% A; 20-21 ph: 27-85% A; 21-35 ph: 85% A; 35-36 ph: 85-27% A; 36-40 ph: 27% A. Hệ 3: 0-20 ph: 26% A; 20-21 ph: 26-86% A; 21-35 ph: 86% A; 35-36 ph: 86-26% A; 36-40 ph: 26% A. Cách tiến hành:
Định tính: Tiêm 10 µl dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích peak. Trên sắc ký đồ của mẫu thử có peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của peak chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn, khác biệt không quá 2,0%.
Định lượng: Tiêm riêng biệt 10 µl các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ, diện tích của peak Sal-B, Tan-IIA. Xây dựng đường hồi qui tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) theo phương trình y = ax + b.
Tiêm 10 l dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, diện tích của peak Sal-B, Tan-IIA. Nồng độ Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (µg/ml) được tính theo công thức:
Ct = St b
a
Hàm lượng Sal-B, Tan-IIA trong cao khô tuyệt đối được tính theo công thức: X(%) = 25 100 (100 ) Ct m H (%) Trong đó:
St: Diện tích peak Sal-B, Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử. Ct: Nồng độ của Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (µg/ml). a: Giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính.
b: Giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính. m: Khối lượng cao đặc (g).
H: Hàm ẩm của cao đặc (%).
2.2.2.3. Khảo sát điều kiện chiết mẫu
a. Khảo sát dung môi chiết
Tham khảo các tài liệu [15], [31], [45] khảo sát dung môi chiết: Chiết cao bằng methanol 30%, 50%, 70% và 100%. Tiến hành định lượng theo điều kiện HPLC đã khảo
20
sát. So sánh hàm lượng Sal-B và Tan-IIA giữa các mẫu chiết bằng các dung môi khác nhau để chọn dung môi chiết cho hàm lượng Sal-B và Tan-IIA cao nhất.
b. Khảo sát nhiệt độ chiết
Tham khảo các tài liệu [20], [30] khảo sát nhiệt độ chiết: Chiết 3 mẫu với 3 mức nhiệt độ chiết là 30 °C, 40 °C và 50 °C. So sánh hàm lượng Sal-B và Tan-IIA giữa các mẫu chiết ở các nhiệt độ khác nhau để chọn nhiệt độ chiết thích hợp cho hàm lượng Sal-B và Tan-IIA cao nhất.
2.2.2.4. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm
Tiến hành chạy sắc kí các dung dịch đã được xử lí theo quy trình xử lí mẫu ở trên theo điều kiện đã chọn, thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu:
- Đối với phương pháp định tính: thẩm định tiêu chí độ đặc hiệu.
- Đối với phương pháp định lượng: thẩm định các tiêu chí tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng [14], [26].
Độ đặc hiệu:
Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách chắc chắn khi chất phân tích có mặt trong mẫu phân tích, xác định độ đặc hiệu trong phương pháp phân tích nhằm:
- Đối với phương pháp định tính: chứng minh phép thử dương tính khi có mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt chất phân tích cũng như các chất liên quan có cấu trúc gần giống chất phân tích.
- Đối với phương pháp định lượng: chứng minh kết quả của phép định lượng không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình phân tích.
Cách tiến hành: Tiến hành chạy sắc kí lần lượt với các mẫu sau:
Dung dịch mẫu trắng.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp acid salvianolic B, tanshinon IIA.
Dung dịch mẫu thử.
Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn.
Yêu cầu:
- Sắc kí đồ dung dịch mẫu thử phải cho peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của peak thu được trên sắc kí đồ chuẩn.
21
- Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích, ...
- Tiến hành: sắc kí 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp acid salvianolic B, tanshinon IIA có nồng độ thích hợp. Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích peak. Tính RSD (%) của các thông số trên.
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích peak ≤ 2,0%. [14]
Độ tuyến tính
- Pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp acid salvianolic B, tanshinon IIA ở các nồng độ thích hợp. Tiến hành sắc kí như điều kiện đã lựa chọn.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ acid salvianolic B, tanshinon IIA trong các dung dịch chuẩn.
Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99. [14]
Độ chính xác
Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dùng dãy dung dịch chuẩn trong phần độ tuyến tính. - Chuẩn bị dung dịch thử: Tiến hành trên 6 mẫu thử độc lập rồi chuẩn bị như quy trình phân tích.
- Định lượng 06 mẫu thử độc lập.
- Thực hiện độ lặp lại vào 2 ngày ngày khác nhau.
- Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng Sal-B, Tan-IIA có trong mẫu.
- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ở mỗi ngày và giữa hai ngày.
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng mỗi ngày (n=6) và của cả 2 ngày (n=12)
≤ 2,7% với các chất có hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1% [14].
Độ đúng
- Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực.
- Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm một lượng đã biết chất chuẩn tương ứng với 25%, 50% và 100% so với mẫu thử vào mẫu thử ở mức nồng độ 50% để được nồng độ các chất Sal-B và Tan-IIA ở mức 75%, 100% và 150% so với mẫu thử.
22
- Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và sắc kí theo điều kiện đã chọn, định lượng Sal-B và Tan-IIA trong mẫu thử và mẫu thử 50% thêm chuẩn, xác định tỷ lệ thu hồi Sal- B và Tan-IIA, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần.
- Xác định tỉ lệ thu hồi (%) Sal-B và Tan-IIA. Yêu cầu:
- Tỷ lệ thu hồi đạt 97,0-103,0% với các chất có hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và đạt 95-105 % với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1% ở mỗi mức nồng độ [14].
2.2.2.5.Định lượng các mẫu cao đặc Đan sâm
Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng các mẫu cao đặc Đan sâm được chiết bằng nước và ethanol ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 90% và 96%.