Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tương chó bằng HPLC

Chuẩn bị mẫu phân tích  Chuẩn bị các dung dịch gốc trong MeOH : + Dung dịch chuẩn gốc FA FB: cân chính xác một lượng FA FB pha vào MeOH để được dung dịch chuẩn gốc FA FB có nồng độ khoả

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ BẰNG

HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI 2018

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người cô đáng kính của tôi: TS Nguyễn Thị Thuận - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội và người chị Phạm Thị Huyền Chang – Cao học 21 - trường Đại học Dược Hà Nội Cô và chị

không chỉ hướng dẫn chỉ bảo tôi tận tình mà còn luôn tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia, Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm kiểm nghiệm bộ môn Hóa đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày 4 tháng 1 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB) 2

1.2 Tổng quan về kỹ thuật HPLC 5

1.3.Một số phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4 Ứng dụng thực tế 18

2.5 Phương pháp xử lý kết quả 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20

3.2 Thẩm định phương pháp 22

3.2.1 Sự phù hợp hệ thống sắc ký 22

3.2.2 Độ chọn lọc, độ đặc hiệu 23

3.2.3 Tỷ lệ thu hồi 23

3.2.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 25

3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 27

3.2.6 Độ đúng, độ lặp lại 29

3.2.7 Độ ổn định 33

3.3 Ứng dụng thực tế 37

BÀN LUẬN 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

EtOAc Ethyl acetat

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UPHLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao

IS Chuẩn nội

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

LLOQ Giới hạn định lượng dưới

LOD Giới hạn phát hiện

LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

tR Thời gian lưu giữ

ULOQ Giới hạn định lượng trên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 : Một số phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương 9

Bảng 2 1 : Danh mục chất chuẩn 12

Bảng 2 2 : Danh mục dung môi và hoá chất 12

Bảng 2 3: Bảng nồng độ các mẫu QC 14

Bảng 3 1: Chương trình gradient 22

Bảng 3 2 : Kết quả sự phù hợp hệ thống 23

Bảng 3 3: Kết quả tỷ lệ thu hồi FA sau khi chiết 24

Bảng 3 4: Kết quả tỷ lệ thu hồi FB sau khi chiết 24

Bảng 3 5: Kết quả tỷ lệ thu hồi IS sau khi chiết 25

Bảng 3 6 : Các giá trị sử dụng trọng số 25

Bảng 3 7 : Kết quả khảo sát đường chuẩn FA 26

Bảng 3 8 : Kết quả khảo sát đường chuẩn FB 26

Bảng 3 9 : Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FA 27

Bảng 3 10 : Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới FB 28

Bảng 3 11 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FA 29

Bảng 3 12 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FB 30

Bảng 3 13 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FA 31

Bảng 3 14 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FB 32

Bảng 3 15: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 33

Bảng 3 16: Độ ổn định của mẫu sau xử lý 34

Bảng 3 17: Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kì đông – rã 35

Bảng 3 18: Độ ổn định trong 30 ngày của mẫu huyết tương 36

DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ

Hình 1 1 : Công thức cấu tạo của FA 2

Hình 1 2 : Công thức cấu tạo của FB 2

Hình 1 3 : Sơ đồ máy HPLC 6

Hình 3 1: Phổ xác định bước sóng hấp thụ của FA và FB 20

Hình 3 2 : Sắc ký đồ chạy MeCN: đệm phosphat pH3 20

Hình 3 3 : Sắc ký đồ chạy MeOH: đệm phosphat pH3 21

Hình 3 4: Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 21

Hình 3 5 : Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 21

Hình 3 6 : Sắc ký đồ chương trình gradient 22

Hình 3 7 : Sắc ký đồ của FA, FB, IS kiểm tra sự phù hợp hệ thống 22

Hình 3 8 : Sắc ký đồ mẫu LLOQ……… 23

Hình 3 9 : Sắc ký đồ mẫu trắng……… ……….23

Hình 3 10: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FA 28

Hình 3 11: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FB 29

Hình 3 12: Đồ thị nồng độ FA trong HT chó theo thời gian 38

Hình 3 13: Đồ thị nồng độ FB trong HT chó theo thời gian 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn lipid máu hay còn gọi là bệnh mỡ máu, hiện đang là căn bệnh phổ biến trong thế giới hiện đại Trong những năm gần đây số người tử vong vì các bệnh tim mạch, đột quỵ tăng lên nhanh chóng, mà nguyên sâu xa lại bắt nguồn từ mỡ máu Bệnh

mỡ máu nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể duy trì ổn định các chỉ số

mỡ máu, phòng tránh các biến chứng nguy hiểm

Hiện nay có nhiều nhóm thuốc để điều trị rối loạn lipid, trong đó nhóm thuốc statin và nhóm thuốc fibric được sử dụng rộng rãi Fenofibrat là một dẫn chất của acid fibric được dùng trong điều trị rối loạn mỡ máu.Chất này có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan làm giảm các thành phần gây xơ vữa, giảm triglycerid và làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao, do đó có tác dụng tốt trong điều trị mỡ máu

Sau khi uống, fenofibrat bị thủy phân trong huyết tương thành chất chuyển hoá

có hoạt tính là acid fenofibric

Hiện nay, fenofibrat có nhiều dạng bảo chế mới nên có thể khi uống vào cơ thể fenofibrat chưa bị thủy phân ngay thành aicd fenofibric Tuy nhiên ở Việt Nam chưa

có phương pháp nào được xây dựng để định lượng đồng thời aicd fenofibric và fenofibrat trong huyết tương

Do đó chúng tôi thực hiện đề tài : “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC” nhằm mục đích :

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng FA và FB trong huyết tương chó

2 Ứng dụng đánh giá nồng độ FA và FB trong một số mẫu HT chó.

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB)

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của FA và FB

Hình 1 1 : Công thức cấu tạo của FA

- Tên khoa học : 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoic acid

- Công thức phân tử : C17H15ClO4

- Công thức phân tử : C20H21ClO4

- Khối lượng phân tử: 360,8 [2]

- Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng Thực tế không tan trong nước, rất dễ tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol 96% Fenofibrat thân dầu, trung tính,

hệ số phân bố D/N logP = 5,24 Nóng chảy ở 79-820C

- Tính chất hóa học: có cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân cho acid fenofibric (FA)

và isopropanol Hấp thụ tia UV ở bước sóng 286nm nên có thể định lượng bằng HPLC detector UV-VIS tại bước sóng này [2]

1.1.2 Đặc điểm dược động học của FA và FB

Fenofibrat được hấp thu ngay ở đường tiêu hóa cùng với thức ăn Hấp thu thuốc

bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm Thuốc nhanh chóng bị thủy phân thành acid fenofibric có hoạt tính; chất này gắn nhiều vào albumin huyết tương và có thể đẩy các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn Nồng độ đỉnh trong huyết tương xuất hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nước tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dưới dạng liên hợp glucuronic

Không thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fibrat, thậm chí sau khi

đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột [3]

1.1.3 Dược lý dược lâm sàng

1.1.3.1 Tác dụng dược lý [3], [6] :

Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (lipoprotein tỷ trọng rất thấp VLDL và lipoprotein tỷ trọng thấp LDL), làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu, do đó giúp cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương [6]

Fenofibrat được dùng để điều trị tăng lipoprotein- huyết typ IIa, typ IIb, typ III, typ IV và typ V cùng với một chế độ ăn rất hạn chế về lipid Fenofibtrat có thể làm giảm 20- 25% cholesterol toàn phần và 40- 50% triglycerid trong máu Ðiều trị bằng fenofibrat cần phải liên tục

Trẻ > 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định nguyên nhân chính xác của tăng lipid máu ở trẻ Có thể điều trị kết hợp với một chế độ ăn được kiểm soát chặt chẽ trong vòng 3 tháng Liều tối đa khuyên dùng là 5mg/kg/ngày

Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng fenofibrat thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác) [3]

1.1.3.3 Chống chỉ định [3], [6] :

Suy thận nặng Rối loạn chức năng gan nặng Trẻ dưới 10 tuổi

1.1.3.4 Tác dụng không mong muốn

Tác dụng không mong muốn thường nhẹ và ít gặp

- Thường gặp, ADR >1/100

+ Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, trướng vùng thượng vị, buồn nôn, ỉa chảy nhẹ

+ Da: Nổi ban, nổi mày đay, ban không đặc hiệu

+ Gan: Tăng transaminase huyết thanh

+ Cơ: Ðau nhức cơ

- Hiếm gặp, ADR < 1/1000

Sỏi đường mật, mất dục tính và liệt dương, giảm tinh trùng, giảm bạch cầu

1.1.3.4 Tương tác thuốc [3], [6] :

Dùng kết hợp các thuốc ức chế HMG CoA reductase (ví dụ: pravastatin, simvastatin…) và fibrat sẽ làm tăng đáng kể nguy cơ tổn thương cơ và viêm tụy cấp Kết hợp fibrat với ciclosporin làm tăng nguy cơ tổn thương cơ Không được dùng kết hợp các thuốc độc với gan (thuốc ức chế MAO, perhexilin maleat ) với fenofibrat Fenofibrat làm tăng tác dụng của các thuốc uống chống đông và do đó làm tăng nguy cơ xuất huyết do đẩy các thuốc này ra khỏi vị trí gắn với protein huyết tương Cần theo dõi lượng prothrombin thường xuyên hơn và điều chỉnh liều thuốc uống chống đông trong suốt thời gian điều trị bằng fenofibrat và sau khi ngừng thuốc 8 ngày

1.2 Tổng quan về kỹ thuật HPLC

1.2.1 Khái Niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố hay trao đổi ion tùy thuộc vào pha tĩnh được sử dụng

1.2.2 Nguyên tắc

Để tiến hành sắc ký, pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo 1 kỹ thuật nhất định phù hợp Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh :

+ Là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha ngược (hệ NP-HPLC hay RP-HPLC)

+ Là chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( Iex-HPLC)

+ Là chất lỏng thì ta có sắc ký chiết hay sắc ký phân bố (LLC)

Cùng với pha tĩnh, để thực hiện sắc ký, rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách, chúng ta phải cần một dung môi rửa giải, đó là pha động Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng các mối tương tác :

Trong đó : X là chất phân tích

SP là pha tĩnh

MP là pha động

Lực F1 giữ chất phân tích ở lại trên cột, trong khi đó lực F2 kéo chất phân tích ra khỏi pha tĩnh, F3 là lực tương tác giữa pha động và pha tĩnh Nếu trong 1 hệ sắc ký với các chất khác nhau thì F1 và F2 thay đổi, F3 không thay đổi Như vậy F1 và F2 là hai yếu tố quyết định sự lưu giữ của chất tan trong một hệ pha

1.2.3 Cấu tạo hệ thống HPLC [1], [4]

Về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, sự tách các chất xảy ra liên tục trong cột sắc ký từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến khi nó được rủa giải ra khỏi cột cùng với pha động Vì thế hệ thống HPLC cần có sự phù hợp giữa các bộ phận trong hệ thống

để thu được kết quả tốt nhất Về nguyên tắc hệ thống HPLC gồm các bộ phận sau :

Hình 1 3 : Sơ đồ máy HPLC

* Bơm cao áp :

Bơm cao áp để bơm pha động qua cột sắc ký Bơm phải điều chỉnh được áp suất (áp suất bơm có thể từ 0- 400 bar) để tạo tốc độ dòng phù hợp với quá trình sắc ký và phải nhanh chóng đạt cân bằng tốc độ bơm đã chọn (thông thường từ 0,2- 10ml/phút)

và lặp lại tốt cũng như ổn định trong suốt quá trình bơm

* Detecter : [4]

Là bộ phận phát hiện chất khi ra khỏi cột Hiện nay có nhiều loại detector khác nhau : + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV- VIS): 190- 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là loại thông dụng nhất

+ Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng nhƣ các dẫn chất có huỳnh quang Là loại detector có độ chọn lọc cao hơn hẳn detecter UV- VIS

+ Detector mảng diod phát quang: Loại detecter này có độ nhạy, độ chọn lọc rất cao và

1.2.4 Các đại lượng đặc trưng [1], [4]

* Thời gian lưu giữ (t R ) :

Các chất phân tích khi nạp vào cột sắc ký sẽ bị lưu giữ ở trong cột theo một thời gian nhất định, tR. Thời gian lưu giữ này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại

tR = t0 + t’RTrong đó: t0 là thời gian không lưu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động)

t’R là thời gian lưu giữ thực của chất trong cột

*Hệ số tách của 2 chất (α):

Với 2 chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ chúng ta có :

α = t’R(B) - t’R(A)Giá trị α càng lớn thì sự tách của chất A và B càng rõ Khi đại lượng này bằng 1 thì không có sự tách của 2 chất, lúc này 2 chất nằm trong cùng 1 pic Còn nếu α gần bằng

1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng đè lên nhau, nghĩa là chúng chập vào nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trưng cho hai chất đó

*Hệ số phân bố (K) :

Quá trình tách sắc ký của các chất tan là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong cột Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố K

K = CS / CM Với CM , CS lần lượt là nồng độ chất tan trong pha động và pha tĩnh

Hệ số phân bố này cho biết khả năng phân bố của chất tan như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh)

*Hệ số dung lượng (k) :

Hệ số dung lượng cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố trong mỗi pha

là bao nhiêu

k’ = ( CS.VS)/(CM.VM) k’ = K.VS/VM Với VM là thể tích pha động trong cột tách, VS là thể tích thực của pha tĩnh trong cột

*Độ phân giải (R S ) :

Độ phân giải nói lên mức độ tách các chất khỏi nhau trong một chương trình sắc ký

Độ phân giải được tính theo công thức sau:

RAB = 2.(tR(A) – tR(B))/(WA – WB)

Ở đây : tR(A), tR(B) lần lượt là thời gian lưu của chất A và B

WA, WB là bề rộng đáy pic sắc ký của hai chất A và B

Hai chất A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao R càng lớn thì pic 2 chất A và B càng tách xa nhau Song nếu R lớn quá cũng không cần thiết vì như thế sẽ làm tốn dung môi pha động để rửa giải các chất hơn Trong thực tế nếu R quá lớn thì chúng ta phải ứng dụng quá trình rửa giải gradient thành phần pha động để cho chất sau được rửa giải nhanh hơn

1.3.Một số phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương

Bảng 1 1 : Một số phương pháp định lượng acid fenofibric trong huyết tương Tltk Phương pháp

-Thể tích tiêm mẫu: 50µl -Bước sóng phân tích 288nm -Chất nội chuẩn: atorvastatin

Tủa protein

[10] HPLC-UV -Cột: Symmetry Shield TMRP 18 (150

× 4,60mm; 5µm) -Pha động: MeCN– acid phosphoric 0,02M (50: 50)

-Bước sóng phân tích: 287nm -Chất chuẩn nội: CFHB

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

[12] HPLC-UV -Cột: C18 (4,6x 250mmx 5µm)

-Pha động: MeCN: đệm acetat 20mM

= 40:60 -Bước sóng phân tích: 295nm -Chất chuẩn nội: Nevidipin

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

[16] HPLC-UV -Cột: Lithosphere 60 RP-Select B

(250x 4mm; 5µm) -Pha động: MeCN: đệm phosphate pH 6,0 = 30: 70

-Chất chuẩn nội: Diazepam

Chiết lỏng- lỏng bằng EtOAc

dichloromethan: isopropanol

[8]

UHPLC-MS/MS

-Cột: UPLCTM BEH C18 column (50

× 2,1 mm, 1,7 μm; Waters Corp., Milford, MA, USA)

-Pha động: acetonitril: water: formic = 70: 30: 0,2

-Chất chuẩn nội : acid mefenamic -Tổng thời gian phân tích mẫu là 2 phút

Chiết lỏng -lỏng bằng hỗn hợp diethylether- ethylacetat

[14] CE -Mao quản 25cm x 50µm ( ID)

-Dòng điện 5,5kV

Tủa protein bằng MeCN

-Áp suất tiêm mẫu 3447Pa -Bước sóng phát hiện 280nm -Hệ đệm là acid boric, sodium carbonat, polyethylen glycol 6000

-Thời gian phân tích: 7 phút

Hầu hết các nghiên cứu trên đều sử dụng HPLC và xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng Do đó chúng tôi cũng lựa chọn định lượng fenofibrat và acid fenofibric trong huyết tương bằng HPLC với detector UV, sử dụng hệ sắc ký pha đảo với cột C18 và xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng với ethylacetat

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tương chó

2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất

Bảng 2 1 : Danh mục chất chuẩn

Fenofibrat Viện kiểm nghiệm TW 0113295.01 99,82%

Acid fenofibric Cayman chemical 19262 98%

Natri diclofenac Viện kiểm nghiệm TW 0216130.02 99,83%

Bảng 2 2 : Danh mục dung môi và hoá chất

STT Tên Độ tinh khiết Hãng sản xuất

4 Kali dihydrophosphat P.A Merck- Đức

5 Natri hydroclorit P.A Merck- Đức

Huyết tương thử là huyết tương chó lấy tại các thời điểm nhất định sau khi cho uống 1 liều fenofibrat (do nhóm dược lý cung cấp)

Huyết tương trắng là huyết tương được tách từ máu chó nuôi bình thường, sử dụng heparin chống đông trong quá trình bảo quản máu

2.1.3 Thiết bị dụng cụ:

Thiết bị:

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao của shimadu, cột Shim-pack GIST C18 (150 x 4,6mm; 5µm)

 Cân phân tích Mettler Toledo XPE 105

 Máy lắc xoáy Vortex ZX3

 Máy lắc ngang GFL 3006

 Máy ly tâm Herme Z306

 Máy cô nitơ Hanon HN200

 Tủ lạnh âm sâu Sanyon MDF U333

 Tủ sấy Memmert ULM 500

Dụng cụ:

Ống ly tâm thủy tinh, vial, đầu típ micropipet, micropipet, quả bóp cao su, bình

định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng FA và FB trong huyết

tương trên thiết bị HPLC

 Thẩm định phương pháp định lượng (sự phù hợp hệ thống, độ chọn lọc/ đặc

hiệu, tỷ lệ thu hồi, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện,

giới hạn định lượng, độ ổn định)

 Ứng dụng đánh giá nồng độ FA và FB trong một số mẫu huyết tương chó.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích

 Chuẩn bị các dung dịch gốc trong MeOH :

+ Dung dịch chuẩn gốc FA (FB): cân chính xác một lượng FA (FB) pha vào

MeOH để được dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml

+ Dung dịch chuẩn nội gốc natri diclofenac (IS): cân chính xác một lượng IS, pha

vào MeOH để được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 1mg/ml

+ Dung dịch QC gốc FA (FB): cân chính xác một lượng FA (FB) pha vào MeOH

để được dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml

 Các dung dịch làm việc :

+ Chuẩn làm việc 1 có nồng độ 50µg/ml: pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn gốc

FA (FB) bằng MeOH để thu được chuẩn làm việc 1

+ Chuẩn làm việc 2 nồng độ 5µg/ml: pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn làm việc 1 của FA (FB) bằng MeOH để thu được chuẩn làm việc 2

+ Chuẩn nội làm việc: Pha loãng IS gốc 10 lần bằng MeOH thu được IS làm việc

có nồng độ 100µg/ml

+ Pha tương tự như các chuẩn làm việc 1 và 2 để thu được các QC làm việc của

FA (FB) có nồng độ 5µg/ml và 50µg/ml

 Chuẩn bị các dung dịch trong huyết tương:

+ Dãy đường chuẩn FA: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FA có nồng độ 5µg/ml

và 50µg/ml, pha thành dãy chuẩn FA có nồng độ trong huyết tương bằng: 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 50 (µg/ml)

+ Dãy đường chuẩn FB: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FB có nồng độ 5µg/ml

và 50 µg/ml, pha thành dãy chuẩn FB có nồng độ trong huyết tương bằng: 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 50 (µg/ml)

+ Mẫu QC kiểm tra: Từ các dung dịch QC làm việc pha thành 3 dung dịch hỗn hợp QC có nồng độ trong huyết tương lần lượt là LQC, MQC, HQC

Bảng 2 3: Bảng nồng độ các mẫu QC

Mẫu QC Mã Khoảng nồng độ Giá trị (µg/ml)

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp LQC ≤ 3 x LLOQ 0,5

Mẫu kiểm tra nồng độ

Gần điểm giữa của

Mẫu kiểm tra nồng độ cao HQC 70% - 80% ULOQ 40

Các dung dịch trong huyết tương tiếp tục được đưa vào xử lý để thu được các dung dịch tiêm sắc ký theo quy trình xử lý mẫu dưới đây

*Quy trình xử lý mẫu :

Hút 1 ml mẫu, thêm tiếp 100µl dung dịch chuẩn IS (100µg/ml) lắc đều 5 giây Sau đó thêm 0,5ml dung dịch NaCl bão hòa vào lắc đều 5 giây Thêm tiếp 5ml dung môi EtOAc lắc ngang 20 phút tốc độ 300 lần/phút, ly tâm 20 phút tốc độ 5500 vòng/phút Hút 3ml lớp dung môi hữu cơ cô nitơ ở nhiệt độ phòng tới cắn Hòa tan cắn trong 1ml MeOH: đệm phosphat pH3 (0,01M) = 70: 30 sau đó tiến hành chạy sắc ký

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích FB, FA và

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của Cục quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Mỹ (FDA–Mỹ) [9] với các chỉ tiêu:

 Sự phù hợp của hệ thống

 Độ chọn lọc/đặc hiệu của phương pháp

 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

 Độ đúng, độ lặp lại

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

 Tỷ lệ thu hồi chuẩn nội và hoạt chất

 Độ ổn định của mẫu phân tích bao gồm:

 Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông

 Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 2,0% và diện tích pic phải ≤ 5,0% Trường hợp giá trị RSD > 5%, phải có sự giải thích phù hợp

- Tỷ lệ thu hồi

Tiến hành phân tích các lô mẫu QC trên nền mẫu huyết tương, mỗi lô gồm 06 mẫu độc lập, song song chuẩn bị các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha động có nồng

độ tương ứng mẫu QC Phân tích các mẫu QC theo phương pháp đã xây dựng Định lượng trực tiếp các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua giai đoạn chiết tách Yêu cầu: Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi hoạt chất không quá 110% và không thấp hơn 30% Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng

độ không quá 15% Độ lệch giữa các tỷ số FA/IS (FB/IS) trong các mẫu QC có qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải không quá 15% và không qua chiết tách không quá 5%

- Độ chọn lọc/đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành phân tích các mẫu: Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu khác nhau Huyết tương trắng có thêm chuẩn (ở nồng độ LLOQ) và IS Tiến hành phân tích các mẫu trên theo phương pháp đã xây dựng và ghi lại pic sắc ký

Yêu cầu: Ở điều kiện phân tích, pic của chất cần phân tích phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của FA và FB không được vượt quá 20% đáp ứng của FA và FB ở nồng độ LLOQ Đáp ứng của mẫu trắng ở điều kiện xác định

IS tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt quá 5% đáp ứng của

IS ở nồng độ LLOQ

- Đường chuẩn và khoảng hồi quy

Mối quan hệ tỷ số diện tích pic FA/IS (FB/IS) với nồng độ của FA (FB) được đánh giá bằng phương trình hồi quy Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trên đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

Để thiết lập mối tương quan giữa nồng độ của chất chuẩn với đáp ứng của thiết bị phân tích, số lượng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm 1 mẫu trắng, một mẫu trắng có chuẩn nội và ít nhất 6 điểm chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát phải bao hàm được khoảng nồng độ có thể đạt được trong quá trình phân tích mẫu

Phân tích các dung dịch chuẩn đã chuẩn bị theo phương pháp đã xây dựng

Theo FDA [9] đường chuẩn nên là đường đơn giản nhất mô tả chính xác mỗi quan

hệ giữa nồng độ và đáp ứng đo được Khi phân tích dịch sinh học, khoảng nồng độ chất phân tích thường rộng và trải dài trên nhiều khoảng tuyến tính khác nhau Một đường hồi quy tuyến tính không sử dụng trọng số sẽ tạo ra sai số lớn vì mô hình này giả định

SD2 tương đương nhau trên toàn bộ phạm vi của các mẫu Trong một đường cong hiệu chuẩn điển hình, phương sai (SD2) tăng khi tăng nồng độ Giải pháp để nâng cao độ

Từ kết quả phân tích, dùng T-test để xác định mức độ đồng nhất của tập hợp kết quả thu được trên hai mức nồng độ LLOQ và ULOQ, nếu kết quả F test cho thấy không có sự khác biệt giữa giá trị SD2 ở hai nồng độ thì không cần sử dụng trọng số và ngược lại [11],[13] Hệ số trọng số phù hợp (1, 1/x, 1/x2

, 1/x1/2 ) là hệ số mô tả tốt nhất tương quan giữa đáp ứng pic và nồng độ của chất chuẩn (tổng phần dư của độ đúng là nhỏ nhất) [7] Theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo [13], tiến hành tính tổng phần dư độ đúng để chọn hệ số weighting phù hợp nếu F-test cho thấy có sự khác biệt giữa giá trị SD2 ở hai nồng độ LLOQ và ULOQ

Yêu cầu: Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80% - 120% Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất đạt tiêu chuẩn Khoảng tuyến tính có hệ số r ≥ 0,95 [9]

-Độ đúng, độ lặp lại

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Độ lặp lại là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị RSD% Độ lặp lại bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày

Yêu cầu: Với mỗi nồng độ độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận từ 80% đến 120% Độ lặp lại trong ngày giá trị RSD% phải ≤ 15% Riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận ≤ 20% Độ lặp lại khác ngày giá trị RSD% phải ≤ 15%, riêng với mẫu LLOQ được chấp nhận ≤ 20%

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích sinh học có thể phát hiện từ nhiễu nền một cách đáng tin cậy (S/N = 3)

Giới hạn định lượng dưới là nồng độ thấp nhất của chất cần thử có thể định lượng được với độ đúng và độ lặp lại thích hợp LLOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải gấp 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

Phân tích các mẫu ở nồng độ LLOQ và LOD đã chuẩn bị ở trên

Yêu cầu: Với LOD tỷ số S/N = 3, với LLOQ đáp ứng pic của chất phân tích trên mẫu LLOQ ít nhất bằng 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng Độ đúng phải đạt từ 80-120%, RSD độ lặp lại phải ≤ 20%

- Độ ổn định

Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH, quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng mẫu lớn Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình bảo quản và phân tích Trong quá trình thẩm định phương pháp cần thực hiện các loại ổn định sau:

+ Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm: độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông, độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn dịnh thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản

+ Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler)

Yêu cầu: các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu nếu giá trị nồng độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các lần phân tích không quá 15%

2.4 Ứng dụng thực tế

Xác định hàm lượng FA và FB trong một số mẫu huyết tương chó đã được uống

16 mg/kg FB ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau (trước khi uống thuốc, sau khi uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 12; 24 giờ )

2.5 Phương pháp xử lý kết quả

Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lí bằng các phần mềm Postrun Analysis trong thiết bị HPLC để thu được dữ liệu là các pic và diện tích pic tương ứng