Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tương chó bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ACID FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ HÀ NỘI 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC MSV : 1301293 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ Người hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Thuận HVCH Phạm Thị Huyền Chang Nơi thực viện : Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia Bộ mơn hóa dƣợc Hà Nội-2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc trình bày nội dung phần thuộc đề tài mình, tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ngƣời suốt thời gian qua hỗ trợ động viên tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trƣớc tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với ngƣời đáng kính tơi: TS Nguyễn Thị Thuận - Bộ mơn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội ngƣời chị Phạm Thị Huyền Chang – Cao học 21 - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Cô chị không hƣớng dẫn bảo tơi tận tình mà ln tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia, Bộ mơn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị, bạn nhóm kiểm nghiệm mơn Hóa chia sẻ buồn vui, giúp đỡ khích lệ tơi suốt q trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan acid fenofibric (FA) fenofibrate (FB) 1.2 Tổng quan kỹ thuật HPLC 1.3.Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric huyết tƣơng CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.4 Ứng dụng thực tế 18 2.5 Phƣơng pháp xử lý kết 18 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 22 3.2.1 Sự phù hợp hệ thống sắc ký 22 3.2.2 Độ chọn lọc, độ đặc hiệu 23 3.2.3 Tỷ lệ thu hồi 23 3.2.4 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 25 3.2.5 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LLOQ) 27 3.2.6 Độ đúng, độ lặp lại 29 3.2.7 Độ ổn định 33 3.3 Ứng dụng thực tế 37 BÀN LUẬN 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 44 DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích µg Microgram µl Microlit Autosampler Hệ thống tiêm mẫu tự động C18 Cột Octadecylsilan CE Điện di mao quản CV Hệ số biến thiên DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam IV EtOAc Ethyl acetat FA Acid fenofibric FB Fenofibrate FDA Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Mỹ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao UPHLC Sắc ký lỏng siêu hiệu HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao HT Huyết tƣơng IS Chuẩn nội LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ lần LLOQ Giới hạn định lƣợng dƣới LOD Giới hạn phát LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeCN Acetonitril MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình PĐ Pha động r Hệ số tƣơng quan R% Độ thu hồi (%) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng Spic Diện tích pic TB Trung bình TĐSH Tƣơng đƣơng sinh học Tltk Tài liệu tham khảo tR Thời gian lƣu giữ V Thể tích ULOQ Giới hạn định lƣợng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 : Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric huyết tƣơng Bảng : Danh mục chất chuẩn 12 Bảng 2 : Danh mục dung mơi hố chất 12 Bảng 3: Bảng nồng độ mẫu QC 14 Bảng 1: Chƣơng trình gradient 22 Bảng : Kết phù hợp hệ thống 23 Bảng 3: Kết tỷ lệ thu hồi FA sau chiết 24 Bảng 4: Kết tỷ lệ thu hồi FB sau chiết 24 Bảng 5: Kết tỷ lệ thu hồi IS sau chiết 25 Bảng : Các giá trị sử dụng trọng số 25 Bảng : Kết khảo sát đƣờng chuẩn FA 26 Bảng : Kết khảo sát đƣờng chuẩn FB 26 Bảng : Kết xác định giới hạn định lƣợng dƣới FA 27 Bảng 10 : Kết xác định giới hạn định lƣợng dƣới FB 28 Bảng 11 : Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày FA 29 Bảng 12 : Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày FB 30 Bảng 13 : Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày FA 31 Bảng 14 : Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày FB 32 Bảng 15: Độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng 33 Bảng 16: Độ ổn định mẫu sau xử lý 34 Bảng 17: Độ ổn định mẫu huyết tƣơng sau chu kì đơng – rã 35 Bảng 18: Độ ổn định 30 ngày mẫu huyết tƣơng 36 Bảng 19 : Nồng độ FA, FB huyết tƣơng chó theo đƣờng chuẩn 37 DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ Hình 1 : Cơng thức cấu tạo FA Hình : Cơng thức cấu tạo FB Hình : Sơ đồ máy HPLC Hình 1: Phổ xác định bƣớc sóng hấp thụ FA FB 20 Hình : Sắc ký đồ chạy MeCN: đệm phosphat pH3 20 Hình 3 : Sắc ký đồ chạy MeOH: đệm phosphat pH3 21 Hình 4: Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 21 Hình : Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 21 Hình : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 22 Hình : Sắc ký đồ FA, FB, IS kiểm tra phù hợp hệ thống 22 Hình : Sắc ký đồ mẫu LLOQ…………………………………………………… 23 Hình : Sắc ký đồ mẫu trắng…………………………………… ……………….23 Hình 10: Sắc ký đồ phát giới hạn phát FA 28 Hình 11: Sắc ký đồ phát giới hạn phát FB 29 Hình 12: Đồ thị nồng độ FA HT chó theo thời gian 38 Hình 13: Đồ thị nồng độ FB HT chó theo thời gian 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu hay gọi bệnh mỡ máu, bệnh phổ biến giới đại Trong năm gần số ngƣời tử vong bệnh tim mạch, đột quỵ tăng lên nhanh chóng, mà nguyên sâu xa lại bắt nguồn từ mỡ máu Bệnh mỡ máu đƣợc phát sớm điều trị kịp thời trì ổn định số mỡ máu, phòng tránh biến chứng nguy hiểm Hiện có nhiều nhóm thuốc để điều trị rối loạn lipid, nhóm thuốc statin nhóm thuốc fibric đƣợc sử dụng rộng rãi Fenofibrat dẫn chất acid fibric đƣợc dùng điều trị rối loạn mỡ máu Chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol gan làm giảm thành phần gây xơ vữa, giảm triglycerid làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao, có tác dụng tốt điều trị mỡ máu Sau uống, fenofibrat bị thủy phân huyết tƣơng thành chất chuyển hố có hoạt tính acid fenofibric Hiện nay, fenofibrat có nhiều dạng bảo chế nên uống vào thể fenofibrat chƣa bị thủy phân thành aicd fenofibric Tuy nhiên Việt Nam chƣa có phƣơng pháp đƣợc xây dựng để định lƣợng đồng thời aicd fenofibric fenofibrat huyết tƣơng Do chúng tơi thực đề tài : “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT TƢƠNG BẰNG HPLC” nhằm mục đích : Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng FA FB huyết tƣơng chó Ứng dụng đánh giá nồng độ FA FB số mẫu HT chó CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan acid fenofibric (FA) fenofibrate (FB) 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất vật lý FA FB Acid fenofibric : O H3C CH3 Cl OH O O Hình 1 : Công thức cấu tạo FA - Tên khoa học : 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoic acid - Công thức phân tử : C17H15ClO4 - Khối lƣợng phân tử: 318,75 - Tính chất hóa lý: + Là dạng chuyển hóa có hoạt tính huyết tƣơng FB cách cắt liên kết ester phân tử FB nhờ enzyme esterase + Dạng bột tinh thể màu trắng trắng, không tan nƣớc, độ tan tăng hệ đệm, tan tốt MeOH, nóng chảy 179-1830C + Có khả hấp thụ UV cực đại 288nm, nên định lƣợng HPLC detector UV-VIS bƣớc sóng Fenofibrat: O O O Cl O Hình : Công thức cấu tạo FB - Tên khoa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoat Bảng 3.11 cho thấy phƣơng pháp định lƣợng FA có độ ngày mức nồng độ từ nằm giới hạn cho phép 85-115%; độ lặp lại ngày với giá trị RSD đạt yêu cầu < 15% Nhƣ vậy, độ độ lặp lại ngày phù hợp với phƣơng pháp phân tích dịch sinh học Kết độ độ lặp lại ngày FB đƣợc thể bảng 3.12 Bảng 12 : Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày FB LQC Mẫu MQC HQC FB Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) 0,54 107,6 24,8 99,3 39,7 99,2 0,52 104,4 24,1 96,2 40,3 100,9 0,55 110,5 25,3 101,2 36,6 91,6 0,54 108,8 24,8 99,4 39,7 99,2 0,53 106,6 24,1 96,4 40,3 100,9 0,52 104,9 25,4 101,8 36,8 91,9 TB 0,54 107,1 24,8 99,1 38,9 97,3 RSD(%) 2,2 2,2 2,4 2,4 4,5 4,5 Nồng độa Độ đúngb (µg/ml) (%) a: tính theo phƣơng trình hồi quy, b: % so với nồng độ thực Bảng 3.12 cho thấy phƣơng pháp định lƣợng FB có độ ngày mức nồng độ từ nằm giới hạn cho phép 85-115%; độ lặp lại ngày với giá trị RSD đạt yêu cầu < 15% Nhƣ vậy, độ độ lặp lại ngày phù hợp với phƣơng pháp phân tích dịch sinh học 3.2.6.2.Độ đúng, độ lặp lại khác ngày Kết độ độ lặp lại khác ngày FA đƣợc thể bảng 3.13 30 Bảng 13 : Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày FA LQC Ngày MQC Nồng độa Độ đúngb Nồng độa (µg/ml) (%) (µg/ml) HQC Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) Độ đúngb (%) 0,53 93,6 29,3 103,8 43,8 97,0 0,56 98,4 24,5 86,8 42,5 93,9 0,57 102,0 26,7 94,4 41,7 92,2 0,52 92,0 28,6 101,2 42,7 94,5 0,55 97,3 25,3 89,6 42,3 93,6 0,56 99,1 27,1 95,9 42,8 94,7 0,49 85,9 27,9 98,7 43,2 95,6 0,48 85,5 29,7 105,3 43,4 96,0 0,50 88,5 25,5 90,2 50,1 110,8 0,53 93,8 27,5 97,3 43,5 96,2 0,51 90,3 30,2 106,9 44,1 97,6 0,49 86,7 26,3 93,1 49,6 109,7 0,57 100,2 29,7 105,2 44,7 98,9 0,50 88,2 30,7 108,8 46,5 102,8 0,51 89,9 27,9 98,7 45,5 100,8 0,60 105,5 27,3 96,6 44,7 98,9 0,50 88,2 27,7 98,1 44,8 99,0 0,51 89,9 29,5 104,4 39,9 88,3 TB 0,53 93,0 27,8 98,3 44,2 97,9 RSD% 6,6 6,7 6,5 6,5 5,9 5,9 I II III a: tính theo phƣơng trình hồi quy, b: % so với nồng độ thực Kết đƣợc trình bày bảng 3.13 cho thấy ba nồng độ 0,5; 25,0 40,0 µg/ml, phƣơng pháp cho độ khoảng 85 - 115% với giá trị RSD < 15% chứng tỏ phƣơng pháp nghiên cứu có độ độ lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phƣơng pháp phân tích thuốc dịch sinh học 31 Kết độ độ lặp lại khác ngày FB đƣợc thể bảng 3.14 Bảng 14 : Kết xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày FB LQC MQC HQC Độ đúngb (%) 89,8 Nồng độa (µg/ml) 27,3 Độ đúngb (%) 109,1 Nồng độa (µg/ml) 41,7 Độ đúngb (%) Nồng độa (µg/ml) 0,45 0,43 85,7 27,3 109,2 36,6 91,6 0,44 88,5 27,7 110,9 46,1 115,4 0,45 90,6 26,8 107,2 40,5 101.3 0,41 82,5 28,2 112,8 42,3 105,8 0,51 101,5 27,6 110,4 37,2 93,0 0,52 104,5 27,3 109,1 41,7 104,2 0,43 87,0 27,4 109,5 36,6 91,6 0,55 109,1 28,7 114,9 45,4 113,4 0,49 98,0 27,3 109,2 40,8 102,0 0,52 104,6 27,8 111,2 37,5 93,8 0,46 92,0 28,1 112,4 44,6 111,5 0,50 100,6 24,4 97,6 40,1 100,3 0,54 107,7 24,2 96,8 36,6 91,6 0,55 109,6 27,7 111,0 41,0 102,5 0,45 90,4 24,7 98,8 39,6 99,0 0,43 86,7 23,8 95,2 37,4 93,5 0,48 96,8 27,3 109,2 42,5 106,3 TB 0,48 96,2 26,8 107,4 40,4 101,0 RSD%(n=6) 9,3 9,3 5,7 5,7 7,7 7,7 Ngày 104,2 I II a: tính theo phƣơng trình hồi quy, b: % so với nồng độ thực Kết đƣợc trình bày bảng 3.14 cho thấy ba nồng độ 0,5; 25,0 40,0 µg/ml, phƣơng pháp cho độ khoảng 85 - 115%với giá trị RSD < 15% 32 chứng tỏ phƣơng pháp nghiên cứu có độ độ lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phƣơng pháp phân tích thuốc dịch sinh học 3.2.7 Độ ổn định 3.2.7.1 Độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng Tiến hành đánh giá độ ổn định chất phân tích huyết tƣơng bảo quản nhiệt độ phòng vòng 06 cách phân tích lơ mẫu LQC HQC sau đƣợc chuẩn bị sau 06 Kết độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng đƣợc trình bày bảng 3.15 Bảng 15: Độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng Nồng độ FA STT LQC(0,5µg/ml) FB HQC(40µg/ml) LQC(0,5µg/ml) HQC(40µg/ml) Ban Sau 06 Ban Sau 06 Ban Sau 06 Ban Sau 06 đầu1 0,53 giờ2 0,57 đầu1 43,8 giờ2 38,9 đầu1 0.45 giờ2 0,52 đầu1 41,7 giờ2 37,2 0,56 0,50 42,5 43,8 0,43 0,53 36,6 40,5 0,57 0,51 41,7 47,7 0,44 0,46 46,1 43,2 0,52 0,51 42,7 42,8 0,45 0,46 40,5 44,7 0,55 0,57 42,3 45,3 0,41 0,46 42,3 41,9 0,56 0,44 42,8 46,7 0,51 0,43 37,2 42,4 TB 0,55 0,52 42,6 44,2 0,45 0,48 40,7 41,7 RSD(%) 3,6 5,9 1,7 4,5 7,21 8,1 8,6 6,2 CV (%) -2,8 1,2 6,6 2,3 Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ FA, FB hai khoảng nồng độ cao thấp, sau 6h để nhiệt độ phòng so với mẫu ban đầu khác không 15%, RSD mẫu nhỏ 15% Do mẫu đạt độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng 33 3.2.7.2 Độ ổn định mẫu sau xử lý (trong autosampler) Tiến hành chuẩn bị mẫu huyết tƣơng tự tạo nồng độ LQC HQC, xử lý mẫu theo quy trình xây dựng Số mẫu sau xử lý đƣợc tiêm sắc ký ngay, sau tiếp tục để autosampler 24h tiêm lại mẫu Kết độ ổn định autosampler (nhiệt độ 50C) đƣợc trình bày bảng 3.16 Bảng 16: Độ ổn định mẫu sau xử lý Nồng độ FA FB LQC STT HQC LQC HQC (0,5µg/ml) (40µg/ml) (0,5µg/ml) (40µg/ml) Tiêm Sau 24 Tiêm Sau 24 Tiêm Sau 24 Tiêm Sau 24 0,53 0,53 43,8 42,9 0,45 0,46 41,7 42,8 0,56 0,55 42,5 42,6 0,43 0,44 36,6 37,5 0,57 0,56 41,7 40,7 0,44 0,42 46,0 45,8 0,52 0,52 42,7 41,2 0,45 0,43 40,5 41,2 0,55 0,54 42,3 41,3 0,41 0,40 42,3 43,4 0,56 0,53 42,8 44,0 0,51 0,53 37,2 38,3 TB 0,55 0,54 42,6 42,1 0,45 0,45 40,7 41,5 RSD(%) 3,6 2,7 1,7 3,0 7,2 10,2 8,5 1,6 CV (%) -1,7 -1,2 -0,4 1,9 Kết cho thấy mẫu có RSD